毕氏酵母%28Pichia_pastoris%29感受态细胞制备及转化.doc

毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化 1、毕氏酵母氯化锂转化法 （1）试剂 1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释） 50% PEG3350（Sigma P3640  用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装） 2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存 注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用； （2）感受态毕氏酵母的制备 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）； 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min； 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管； 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中； 按50ul/管分装，立即进行转化； 注：不要将感受态酵母菌冰浴； （3）毕氏酵母的转化 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA； 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液； 对于每一个转化，按以下顺序加入： 50% PEG3350                      240ul 1M LiCl                           36ul 2mg/ml 单链Salmon sperm DNA       25ul 5～10ug/50ul H2O 质粒DNA          50ul 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）； 30℃水浴孵育30min； 42℃水浴热休克20～25min; 6000～8000rpm离心收集酵母菌体； 重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育； 1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定； 2、毕氏酵母PEG1000转化法 （1）试剂 缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35 缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存 注： 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存; 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）; （2）待转化毕氏酵母的制备 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d; 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜； 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8； 室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次； 重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻， -70℃保存 （3）毕氏酵母的转化 将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率； 37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次； 取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀； 30℃水浴孵育1h； 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中； 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中； 将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定； 3、毕氏酵母电转化法 （1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备 取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。取100ul菌液接种于200ml液体LB培养基中。 37℃，200 rpm，培养16～18小时。 灭菌500 ml离心管，4℃，4000 rpm，20 min。得菌体沉淀。弃上清，菌体用10％甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。 第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约1ml 液体用于重悬菌体。 从制得得感受态细胞中，取200ul于灭菌EP管中，加入连接反应产物5ul，混匀，不要产生气泡，在冰上放置5min。 将混匀后得200ul菌液移入电击杯中。 使用电击穿孔仪进行转化，设置为电压 2500 V，时间 5 ms。 电击后，往电击杯中加入 800ul SOC培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，轻摇45～60 min。 取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB－Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流动，37℃ 培养12～16小时。 （2）线性化质粒DNA对Pichia pastorisGS115的转化 取新鲜制备的（或－70℃冻存的）感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻； 1）将100μl菌体移出至一新的无菌Eppendorf管中，加入5－20μg线性化质粒（5～10μl），轻弹混匀，尽数吸出转移到0.2cm 型的电穿孔转化杯中； 2) 转化杯置于冰浴中5～10分钟，保持低温。 3) 电穿孔转化电击条件：电压：1500V；电阻：400Ω；电容：25μF；脉冲时间：10mS；一次电击。 4) 电击后，马上在电击转化杯中加入1ml 4℃预冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液枪吹打均匀，置于冰浴中； 5) 取30℃烘至表面半干的MD培养基平板，在超净工作台上无菌操作涂布平板，400μl/板 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.4.1 菌体的准备： 1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜； 2. 取100-500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜，至OD600达到1.3~1.5； 3. 将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； 4. 按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； 5. 按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬； 6. 按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml； 7. 备注：可将其分装为80μl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周之内）。 3.4.2 电击转化： 8. 将5~20μg的线性化DNA溶解在5~10μl TE溶液中，与80μl的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中； 9. 将电转化杯冰浴5min； 10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击； 11. 电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的EP管中； 12. 将菌体悬液涂布于MD或RDB平板上，每200~600μl涂布一块平板； 13. 将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。 推荐：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω。电击时间为4～10msec。