骨髓间充质干细胞界面行为的microRNA机理研究.pdf

申请代码 C1003 受理部门 收件日期 受理编号 国家自然科学基金国家自然科学基金 申申 请请 书书 (2 0 1(2 0 1 1 1 版版)资助类别：面上项目 亚类说明：附注说明：项目名称：骨髓间充质干细胞界面行为的 microRNA 机理研究 申 请 人：吴琼 电话：010-62771664 依托单位：清华大学 通讯地址：北京市海淀区清华大学生命科学学院 105 邮政编码：10084 单位电话：62784622 电子邮箱： 申报日期：2011年2月25日 国家自然科学基金委员会 31170252NSFC 2011 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 2 页 版本 1.006.671 基本信息基本信息 zYleU7IM 申申 请请 人人 信信 息息 姓名 吴琼 性别 男 出生 年月 1973 年 2 月 民 族 汉族 学位 博士 职称 副教授 每年工作时间（月）6 电话 010-62771664 电子邮箱 传真 010-62794217 国别或地区 中国 个 人 通 讯 地 址 北京市海淀区清华大学生命科学学院 105 工作单位 清华大学/生命科学学院 主 要 研 究 领 域 组织工程，再生医学 依托单位信息依托单位信息 名称 清华大学 联系人 宿芬 电子邮箱 kjc- 电话 62784622 网站地址 http:/ 单 位 名 称 项项 目目 基基 本本 信信 息息 项目名称 骨髓间充质干细胞界面行为的microRNA机理研究 资助类别 面上项目 亚 类 说 明 附注说明 申请代码 C1003:组织工程学 C0704:细胞增殖、生长与分化 基地类别 研究期限 2012 年 1 月 2015 年 12 月 研究属性 应用基础研究 申请经费 66.0000 万元 摘摘 要要 (限限 400400 字字)：组织工程利用生物科学与工程技术手段实现复杂的人造组织和器官，具有广阔的应用前景。种子细胞在材料表面的界面行为控制着细胞的生长和器官构筑，是组织工程领域的核心问题和研究热点。大量的相关研究都从模拟体内微环境入手，通过调整材料的各种特性，可以实现调控细胞黏附、增殖、迁移和分化，但是对细胞界面行为的理解还远不能满足组织工程的需要。microRNAs（miRNAs）是新发现的转录后调控因子，是近年的研究热点，在细胞分化、胚胎发育、组织生成、癌变等过程中均发挥着重要作用。本申请将利用 BIOMEMS 技术构建具有微尺度特征表面的生物材料（PHBHHx）模拟体内骨微环境，实现骨髓间充质干细胞向骨细胞分化的倾向。通过 miRNAs 表达谱分析探索 miRNAs 在干细胞界面行为中的作用，尝试从机理上揭示种子细胞在微尺度特征材料表面的界面行为，并利用界面设计和 miRNAs 相结合控制细胞的界面行为。关关 键键 词词(用分号分开，最多 5 个)microRNAs；BIOMEMS；骨髓间充质干细胞；界面行为；组织工程 NSFC 2011 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 3 页 版本 1.006.671 项目组主要项目组主要参与者参与者（注:项目组主要参与者不包括项目申请人）编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮箱 项目分工 每年工作时间（月）1 蔺枭 1989-11-26 女 博士生 学士 清华大学 010-62772676 miR 功能研究 10 2 蒋仙丽 1988-11-7 女 硕士生 学士 清华大学 010-62772676 miR 分析及检测 10 3 任梦达 1988-10-10 男 硕士生 学士 清华大学 010-62772676 材料界面构建 10 4 吴莉 1985-9-28 女 技术员 硕士 清华大学 010-62772676 细胞信号通路研究 10 5 王华素 1983-7-4 女 技术员 学士 清华大学 010-62772676 细胞分化行为研究 10 6 7 8 9 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 6 1 2 1 2 说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请人负责填报（含申请人），总人数由各分项自动加和产生。NSFC 2011 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 4 页 版本 1.006.671 经费申请表经费申请表 （金额单位：万元）科目 申请经费 备注（计算依据与说明）一一.研究经研究经费费 46.8000 1.科研业务费 18.8000 （1）测试/计算/分析费 9.5000 多次生物芯片检测，荧光定量 PCR 仪，流式细胞仪器，共聚焦显微检测等（2）能源/动力费 3.0000 实验室水电费（3）会议费/差旅费 2.0000 参加学术会议和学术活动（4）出版物/文献/信息传播费 2.0000 发表 SCI 论文等（5）其他 2.3000 非预期性费用 2.实验材料费 20.0000 （1）原材料/试剂/药品购置费 20.0000 BIOMEMS 微图形材料制备；细胞培养试剂，生化分子检测试剂，实验动物等（2）其他 0.0000 3.仪器设备费 5.0000 （1）购置 5.0000 新购置离心机等小型设备（2）试制 4.实验室改装费 3.0000 实验室简单装修改造费用 5.协作费 二二.国际合作与交流费国际合作与交流费 6.0000 1.项目组成员出国合作交流 4.0000 参加国际性学术交流 2.境外专家来华合作交流 2.0000 邀请国际专家前来交流 三三.劳务费劳务费 9.9000 课题组学生的研究津贴 四四.管理费管理费 3.3000 合合 计计 66.0000 与本项目相关的 其他经费来源 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计其他经费来源合计 0.0000 NSFC 2011 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 5 页 申请者在撰写报告正文时，请遵照以下要求：1、请先选定项目基本信息中的资助类别，再填写报告正文；2、在撰写过程中，不得删除系统已生成的撰写提纲（如误删可点击“查看报告正文撰写提纲”按钮，通过复制/粘贴恢复）；3、请将每部分内容填写在提纲下留出的空白区域处；4、本要求将作为申请书正文撰写是否规范的评判依据，请遵照要求填写。报告正文报告正文面上项目申请书撰写提纲面上项目申请书撰写提纲 （一）立项依据与研究内容（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：1.项目的立项依据项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）世界上每年因患有组织缺损或器官衰竭而需要器官移植的病人在逐年增长。仅美国每年就有1100 万人接受生物材料移植治疗，费用超过 8000 亿美元（Tissue Engineering Research Final Report.WTEC Panel Report,Jan,2002）。随着全球人口老龄化的快速发展，老年病的增多使器官移植问题更加严重。目前治疗组织缺损或器官衰竭的主要方法是移植生物（主要是人）器官或移植用高分子生物材料制成的人工器官。由于生物器官的资源极度匮乏，人造器官已经成为解决器官移植资源最重要和最有发展前景的途径。组织工程是实现人造器官的手段。它应用工程科学和生命科学的原理和方法，认识哺乳动物正常和病理组织与器官的结构和功能的关系，并开发具有生物活性的人工替代物，以恢复、维持或者改善组织、器官的功能。组织工程是一个多学科高度交叉的新兴学科，综合了细胞生物学、工程科综合了细胞生物学、工程科学、材料科学和外科学，将活细胞和基质学、材料科学和外科学，将活细胞和基质(或叫支架或叫支架)材料结合起来，目的是制造出人造功能组织。材料结合起来，目的是制造出人造功能组织。组织工程是组织和器官缺损以及功能障碍治疗方法的革命性变化，可能挽救全世界数百万人的生命并改善生命质量。按照组织工程的基本思想，种子细胞、支架材料和组织构建是该领域的三大要素。在组织工程领域中，实现细胞界面行为的可控化对创伤修复极为重要。细胞界面细胞界面行为是指种子细胞与生物材料、行为是指种子细胞与生物材料、种子细胞与体内环境、体内细胞与植入材料之间发生的各种细胞行为，包括细胞的增殖、迁移、分种子细胞与体内环境、体内细胞与植入材料之间发生的各种细胞行为，包括细胞的增殖、迁移、分化和凋亡等化和凋亡等。由于细胞界面行为对其命运调控具有决定性作用，调控细胞界面行为的相关机制一直都是组织工程和再生医学领域的研究热点，是实现组织工程的核心内容。其中最常用的研究模型是组织工程种子细胞在生物材料表面上的界面行为1-2。在正常的组织中，细胞外基质，细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是调控细胞行为的主要“界面”，其重要性与可溶性因子不相上下3,9。ECM 是由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质构成的复杂网状结构，除了给细胞提供结构支持以外，ECM 还可以通过多种方式参与调控细胞行为，如：改NSFC 2011 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 6 页 变 ECM 表面的各种理化特性（如粗糙度、形态、硬度等）、结合细胞表面的黏附受体（如整合素Integrin 等）、向细胞呈递信号因子3。因此，大量细胞界面行为相关的研究都从模拟 ECM 入手，通过调整材料的理化特性、用黏附蛋白或其他信号因子修饰材料，可以达到调控细胞黏附、增殖、迁移和分化的目的1-2,4-9（见图 1）。介导细胞骨架构成、细胞与 ECM 之间相互作用的 Rho（ras homologus oncogenes）信号通路、FAK（focal adhesion kinase）和 Integrin 等也被证实参与了材料对细胞行为的调控过程10-14。图 1 结合多种调控因子修饰二维和三维的材料表面来调控细胞界面行为的模型。（左）二维材料表面；（右）细胞图案化实现的具有三维结构的材料表面。1 近年来对 microRNAs的发现和其功能的研究成为细胞生物学、干细胞、癌症等领域的热点之一。MicroRNAs(miRNAs)是一类含有大约 22(1824)个核苷酸的单链 RNA，属于非蛋白编码 RNA，一般通过碱基互补与靶 mRNA 的 3端非翻译区(3UTR)结合，根据碱基互补程度的不同，具有降解靶mRNA 或抑制靶 mRNA 翻译的功能。miRNAs在进化中高度保守，对细胞的增殖、分化和凋亡有重要的调节作用15-17。除了基础科学方面的发现型研究，生物医学工程领域作为融合了生物、医学和工程等领域的交叉学科，利用 miRNAs进行工程化改造的研究也开始逐渐升温。因此，探索 miRNAs对细胞界面行为的控制，对揭示细胞界面行为的机理具有显著的促进作用，在再生医学领域具有重要科学意义。Palmieri A 等发现，采用锐钛矿包被（Anatase Coating,AC）材料可以促进骨的再生，通过 miRNAs芯片对比传统的钛和 AC 发现，AC 材料引起了成骨细胞 miRNAs 表达谱的变化 18。机械刺激也会引起细胞 miRNAs 水平上的应答。Searles CD 等就发现，层流剪切力会影响内皮细胞的 miRNAs 表达谱19。Scot J.Matkovich 等的研究显示，在治疗充血性心脏衰竭时，miRNAs对于生物机械刺激的应答要比 mRNA 更为快速，这与 miRNA 是调控心肌对压力应答的重要因子这个事实是一致的20。研究还表明，miRNAs 的异常表达可以诱发癌症转移，其中部分 miRNAs 的作用对象是参与细胞骨架重构的蛋白因子21。细胞图案化（细胞图案化（Cell Patterning）是近年来研究和调控细胞行为的最有效手段之一，本申请从）是近年来研究和调控细胞行为的最有效手段之一，本申请从miRNAs 水平上揭示细胞图案化调控细胞界面行为的内在机理，具有很高的创新性。细胞图案化水平上揭示细胞图案化调控细胞界面行为的内在机理，具有很高的创新性。细胞图案化是指利用微加工技术在材料表面上塑造与细胞相关的微尺度的物化参量（如表面形态，硬度、粗糙度、胞外基质蛋白及细胞生长因子等），进而诱发细胞的自身响应机制，使得细胞选择性地黏附于特定区细胞选择性地黏附于特定区域、按设域、按设计形成图案计形成图案1-2。细胞图案化是研究材料表面如何调控细胞界面行为的最有效手段，一方面能够简化研究，突出特定信号对细胞的影响，有利于研究细胞行为的内在机理；另一方面，可精确NSFC 2011 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 7 页 地模拟体内复杂的微环境来迎合组织工程的需求，细胞图案化共培养和三维培养的出现正体现了这一发展趋势22,23。生物微机电系统（生物微机电系统（Biological Micro-Electro-Mechanical System，BioMEMS)是实现细胞图案化最常用的微加工技术之一（见图 2），它将微机电加工技术用于生物相关材料，制造不同材料、不同硬度、不同表面粗糙度的基底，实现用于细胞界面性质研究的微纳米尺度复杂形状的生物基底 24。研究表明，三维支架结构能够给予细胞不同于二维刚性基质的环境，能够使细胞产生应答，从而促进细胞增殖、生长、体内表型以及组织的形态发生。利用 BIOMEMS 技术制作微纳米级三维培养系统是近年来组织工程领域的研究热点，既满足细胞对三维空间的需求又实现三维空间中微钠米量级的精细调控。利用呈三维空间设计的细胞培养体系，使细胞呈空间立体型生长，能够尽可能地接近体内生长模式，为器官在体外的重建提供良好的环境。精细化构筑三维培养体系，将可以实现各类细胞定向分化的诱导、分化后表型的维持、甚至组织和器官的体外构建。图 2 硅母版的制造和微模铸原理示意图。（a）光刻转移需要的三维图形的二维平面投影；（b）刻蚀制造硅母版；（c）微模铸 PHBHHx 溶液；（d）固化后剥离 PHBHHx 二维结构。干细胞具有自我更新能力且具有多项分化潜能，因此在组织工程学中有着广泛的应用潜力。作为组织工程研究广泛应用的种子细胞，骨髓间充质干细胞的界面行为的研究对实现组织工程中创伤修复有重要意义，而且被越来越多地应用于这一领域25。在体外，骨髓间充质干细胞（MSC）已被证实具有分化为内皮细胞（Endothelial Cells,EC）、平滑肌细胞（Smooth Muscle Cells,SMC）、神经元细胞以及骨细胞等的能力。近年来越来越多的研究表明用微图形技术构造的细胞界面物理性质对干细胞的命运起着重大的决定作用26。研究发现，研究发现，在具有不同硬度的生物材料上生长的在具有不同硬度的生物材料上生长的 MSC 分别分别具有向骨细胞、肌细胞、神经元细胞分化的趋势具有向骨细胞、肌细胞、神经元细胞分化的趋势27。甚至有研究发现甚至有研究发现 BIOMEMS 构筑出不同形状的构筑出不同形状的孔会诱导孔会诱导 MSC 向不同的细胞分化向不同的细胞分化28。在具有微米尺度的在具有微米尺度的 PDMS（聚二甲硅氧烷）槽上生长（聚二甲硅氧烷）槽上生长的的 MSC细胞被证明随着槽定向伸展，并且可以在一定程度上诱导细胞被证明随着槽定向伸展，并且可以在一定程度上诱导 MSC 分化成类神经元细胞分化成类神经元细胞29。Bruinink等发现在具有沟槽状的聚苯乙烯表面生长的等发现在具有沟槽状的聚苯乙烯表面生长的 MSC 有成骨细胞分化的倾向有成骨细胞分化的倾向30。羟基丁酸己酸共聚酯（PHBHHx）具有良好的生物相容性与机械加工性能。课题组已对 PHBHHx材料与细胞的相互作用进行大量的研究；同时课题组前期利用 BIOMEMS 技术成功建立具有一定槽宽和槽间距的微槽状微图形结构的 PHBHHx 基底以模拟体内微环境，并证明在十微米级尺度沟槽结构上生长的 MSC 表现出向成骨分化的倾向，成骨特征基因的 mRNA 水平上调。并且对微图形结构表面生长的 MSC 和光滑表面生长的 MSC 进行 miRNAs表达谱的分析比对，初步的分析结果发现有促进成骨分化作用的 miRNAs，除此之外，也发现被证实有促进成神经分化作用的 miRNAs。本本申请申请将以将以 BIOMEMs 为工程技术手段为工程技术手段，利用利用 PHBHHx 为基底材料，为基底材料，从从 miRNAs 水平上水平上重点重点NSFC 2011 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 8 页 探讨探讨骨骨组织工程种子细胞在材料表面组织工程种子细胞在材料表面成骨分化倾向成骨分化倾向这一这一界面行为的本质，理清材料表面影响细胞界界面行为的本质，理清材料表面影响细胞界面行面行为的相关信号通路，获得有效的调控该信号通路的为的相关信号通路，获得有效的调控该信号通路的 miRNAs。再根据细胞界面行为中起调控作用的 miRNAs 结果进行微图进行微图形结构参量的优化或者进一步形结构参量的优化或者进一步探索探索，实现，实现 BIOMEMS 模拟体内微环境的模拟体内微环境的可调控化可调控化。同时，鉴于细胞界面行为对于创伤修复的重大意义以及 miRNAs 对基因表达调控的普遍性，本研究的工作将在构建 miRNAs 层次上调控其他组织种子细胞界面行为的平台方面有巨大的指导意义。在另一方面，miRNAs 对体外微环境模拟的精细化调控，将为体外三维培养体系的摸索提供实验基础，大大推动组织工程的基础和应用发展。1.Matthias P.Lutolf,et al.Nature(2009)462,433-441.2.Nathaniel Huebsch,et al.Nature(2009)462,427-432.3.Richard O.Hynes.Science(2009)326,1216-1219.4.Adam J.Engler,et al.Cell(2006)126,677689.5.Chen,S,Wu Q.,et al.Journal of Biomedical Materials Research Part A(2008)86A(3),849-856.6.Wang YW,Wu Q,Chen GQ.Biomacromolecules(2005)6(2),566-571.7.Chen GQ,Wu Q.Biomaterials(2005)33,6565-6578.8.Eric A.Klein,et al.Current Biology(2009)19,18.9.Sui Huang,et al.Nature Cell Biology(1999)1,131-138.10.Maddala R,et al.Developmental Biology Journals(2008)315(1),217-231.11.Etiene2Manneviue S.Nature(2002)420(6916),629-635.12.Akiko Mammoto,et al.Nature(2009)457,1104-1109.13.Kiran Bhadriraju,et al.Biomaterials(2009)30,66876694.14.KAIURA TL,et al.Journal of Vascular Surgery(2000)31(3),577-584.15.Raftopoulou M.Nature Cell Biology(2006)8(2),112-112.16.Miska EA.Current Opinion in Genetics&Development(2005)15(5),563-568.17.Yang MC,et al.Cytokine&Growth Factor Reviews(2005)16(4-5),387-393.18.Palmieri A,et al.Nanomedicine-Nanotechnology Biology And Medicine(2007)3(2),138-143.19.Searles CD,et al.Circulation(2008)118(18),298-298.20.Scot J.Matkovich,et al.Circulation(2009)119,1263-1271.21.D W M ller,et al.Oncogene(2008)27,66986706.22.Eric Leclerc,et al.Biomedical Microdevices(2003)5,109-114.23.Shintaro Takahashi,et al.Journal of Bioscience and Bioengineering(2009)108(6),544550.24.Wu Q,et al.Biomaterials(2006)27,2550-2557.25.G.M.Riha,et al.Tissue Engineering(2005)11,1535-1552.26.John T.Connelly,et al.Nature Cell Biology(2010)12,711-U177.27.Engler,et al.Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.Cell(2006)126,677689.28.Kristopher A.Kilian,et al.Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America(2010)107,4872-4877.29.Sun-Jung Kim,et al.Journal of Materials Science:Materials in Medicine(2008)19:29532962.30.Bruinink,et al.Biomaterials 22,24652473.NSFC 2011 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 9 页 2.项目的研究内容、研究目标项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）研究目标：研究目标：利用 miRNAs 表达谱分析 MSC 与微尺度结构表面上生长的 MSC 之间的差异 miRNAs，找到参与材料表面调控细胞界面行为的重要 miRNAs，从从 miRNAs 水平揭示其本质机理水平揭示其本质机理，以此研究构建利用 miRNAs 调控优化组织工程种子细胞技术平台的方法。利用上述 miRNAs结果探索具有不同尺寸和不同形状的微图形结构的 PHBHHx 基底，模拟影响细胞界面行为的关键因素，摸索实现摸索实现 miRNAs 与与 BIOMEMS 建立体外微环境之间相互优化建立体外微环境之间相互优化的实的实验条验条件件。研究研究内容内容：1）利用利用 miRNAs 芯片筛选芯片筛选 miRNAs，并考察，并考察 miRNAs 的作用的作用 A 通过生物芯片生物芯片的方法比较 MSC 与在具有微尺度结构的 PHBHHs 表面上发生成骨分化倾向的 MSC的 miRNAs 表达谱。B 通过两组生物芯片的数据分析结果，确定若干个在通过定向排列微纳米沟槽状结构诱导倾向成骨分化的 MSC中被明显调控的 miRNAs；通过进一步的文献调研确定候选确定候选 miRNAs、预测靶基因并摸预测靶基因并摸索索上上下游信号通路下游信号通路。C 上调、下调某一特定上调、下调某一特定 miRNA，观察 MSC 能否在定向排列微纳米沟槽状结构的 PHBHHx 基底上诱导分化为骨细胞，确定该 miRNA在该过程中的作用。2)筛选影响筛选影响 MSC 受界面调控后发生界面行为的多个受界面调控后发生界面行为的多个 miRNAs 组合组合 通过上调、下调多种组合型 miRNAs，观察 MSC 能否在多个 miRNAs作用下产生更为明显的成骨分化行为。3）摸索摸索 miRNAs 调控界面行为的上游信号通路调控界面行为的上游信号通路 评估 MSC 感受表面微纳米级沟槽特征可能涉及到的信号通路感受表面微纳米级沟槽特征可能涉及到的信号通路，为揭示物理界面特征调控细胞界面行为的本质提供支持，完善 miRNAs 与界面之间关于信号通路的联系，预测 miRNAs 受界面调控的信号通路。4 4）探求模拟体内各种微环境实现探求模拟体内各种微环境实现 MSCMSC 特殊界面行为的各种参量特殊界面行为的各种参量 利用 BioMEMS 技术制备具有不同尺寸和不同形状的微图形 PHBHHx 基底，评估并检测 MSC 在该材料表面的多个细胞界面行为指标（包括增殖、分化和凋亡），结合 miRNAs 水平的检测，探索使探索使MSC 具有更为明显成骨分化界面行为或者向其他功能细胞界面行为的具体参量。具有更为明显成骨分化界面行为或者向其他功能细胞界面行为的具体参量。5）构建三维细胞构建三维细胞培养体系，在三维培养体系，在三维培养体系中初步检验培养体系中初步检验 miRNAs 调控调控 MSC 界面行为界面行为 模拟生理骨细胞生长的微环境，建立 PHBHHx 三维培养体系，进行 MSC 的培养。并将筛选获得的miRNAs 加入到三维培养体系中，观察其调控 MSC 定向分化成骨细胞的作用。NSFC 2011 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 10 页 拟解决的关键科学问题：拟解决的关键科学问题：1）筛选特定微图形界面下参与调控 MSC 界面行为的 miRNAs，预测 miRNAs的靶基因并摸索其下游信号通路；通过检测细胞表面受体、细胞外基质、第二信使以及细胞骨架的变化，揭示 miRNAs在细胞界面行为中的作用机理。2）利用 BioMEMS 技术探索体内各种微环境的模拟，从二维环境的简单模拟到 MSC 三维培养体系的构筑，在类似于体内的三维微环境中探索 miRNAs 调控 MSC 骨分化行为中的作用。3.拟采取的研究方案及可行性分析。拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）研究研究方案和技术路线方案和技术路线：实验方法与手段实验方法与手段:1）miRNAs 芯片筛选在成骨分化倾向界面行为过程中起作用的芯片筛选在成骨分化倾向界面行为过程中起作用的 miRNAs A 采用 microRNAs 芯片比较在无结构特征的 PHBHHx 基底上培养的 MSC 和在有微米结构特征的PHBHHx 基底上培养的 MSC，分析两者的 microRNAs 表达谱差异，挑选若干个在该界面行为过程中差异表达明显的 miRNAs进行后续研究。通过进一步通过进一步的的信息学分析信息学分析预测预测 miRNAs 的靶基因，从而的靶基因，从而确定在确定在 MSC 界面行为过程中起关键作用的界面行为过程中起关键作用的 miRNAs。在三维在三维培养体系中初步检验培养体系中初步检验 miRNAs调控调控 MSC 界面行为界面行为 摸索摸索 miRNAs 参与界面行参与界面行为调控的上游信号通路为调控的上游信号通路 BioMEMS 诱导诱导 MSC 发生界面行为发生界面行为 BioMEMS 构建三维构建三维的的 PHBHHx 细胞细胞培养培养体系体系 分析分析 miRNAs 芯片，芯片，找到找到受界面调控的受界面调控的单 个 或 者 组 合单 个 或 者 组 合miRNAs 并验证并验证 利用利用 BioMEMS 技术摸索技术摸索具有不同参数具有不同参数的的 PHBHHx 微图形微图形表面对表面对 MSC 界面行界面行为的影响为的影响，探索模拟组织微环境的最佳，探索模拟组织微环境的最佳参量参量 机理研究机理研究 界面表征界面表征 从分子水平研究从分子水平研究 miRNAs 与界面行为调与界面行为调控细胞分化的信号通路控细胞分化的信号通路 NSFC 2011 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 11 页 B 验证验证 miRNAs 靶基因。靶基因。通过双荧光素酶报告基因系统，验证 miRNAs对于靶基因的作用，确定其作用位点，并通过 Real-Time PCR 验证其作用方式，同时通过 western-blot，及免疫组化的方法研究其在蛋白水平上的作用，从而确定 miRNAs 对于靶基因的作用。通过靶基因摸索该 miRNAs 的下信号通路，并检测该通路中相关蛋白水平变化的来验证该信号通路的作用。C 进一步探索上游调控进一步探索上游调控 miRNAs 表达的转录因子表达的转录因子。确定微尺度结构表面对于哪一条信号通路产生影响，从而影响 miRNA的表达，最终引起 MSC 向成骨分化倾向的界面行为，从而从分子层面阐述细胞界面对于细胞分化的影响。确定该 miRNA在成骨信号通路中的位置及作用。D 上调或者下调该上调或者下调该 miRNA，通过通过 RT-PCR、Westernblot、免疫组化等方法检测成骨分化相关标志基、免疫组化等方法检测成骨分化相关标志基因的因的 mRNA 水平变化和蛋白水平的变化水平变化和蛋白水平的变化，验证其对 MSC 成骨分化的作用。2）研究两个或两个以上的研究两个或两个以上的 miRNAs 组合对细胞界面行为的调控作用组合对细胞界面行为的调控作用 通过转染候选 miRNAs 的多种组合，经 RT-PCR、Westernblot、免疫组化等方法检测成骨分化相关标志基因的 mRNA水平变化和蛋白水平的变化，研究多个研究多个 miRNAs 对对 MSC 成骨分化的成骨分化的综合综合影响影响，筛筛选在其中起作用的选在其中起作用的 miRNAs 组合。组合。3）进一步进一步摸索摸索细胞界面调控细胞界面调控 miRNAs 的信号通路的信号通路 利用 RT-PCR，Westernblot，免疫组化等方法检测检测 MSC 在微在微尺度尺度级沟槽状结构上级沟槽状结构上由细胞外环境由细胞外环境物理物理信号信号引起的引起的细胞表面受体细胞表面受体、细胞外基质细胞外基质、第二信使以及细胞骨架、第二信使以及细胞骨架水平的水平的变化变化。结合 miRNAs 上游调控的转录因子，预测物理界面与预测物理界面与 miRNAs 受转录因子调控之受转录因子调控之间的信号通路间的信号通路，并通过该通路中相关蛋白水平变化的检测验证信号通路的作用。从分子层面揭示细胞物理界面对于细胞分化这一界面行为的调控作用。4）利用）利用 BioMEMS 技术摸索材料表面不同参数对技术摸索材料表面不同参数对 MSC 界面行为的影响，界面行为的影响，探求实现探求实现 MSC 具有成骨具有成骨倾向特征的最佳参量倾向特征的最佳参量 设计并制作具有不同尺寸设计并制作具有不同尺寸和不同形状的和不同形状的 PHBHHx 细胞培养基底细胞培养基底，最小尺寸为 5m，最大的尺寸为100m，形状包括槽形、网络形、圆孔形、多边形等。利用 RT-PCR、Westernblot等方法检测 MSC在该材料表面的界面行为变化，同时检测 miRNAs 表达量的变化，对微对微图形参量进行图形参量进行反馈调节反馈调节，研研究使究使 MSC 界面行为多样化或者深程度化的具体参数界面行为多样化或者深程度化的具体参数。5）BioMEMS 构建三维构建三维 PHBHHx 细胞培养体系，在三维细胞培养体系，在三维培养体系中培养体系中研究研究 miRNAs 对对 MSC 界面行为界面行为的调控的调控 A 摸索 BIOMEMS 模拟生理骨细胞生长的微环境，建立建立具有微纳米量级的圆筒状、柱状、蜂窝状等具有微纳米量级的圆筒状、柱状、蜂窝状等结构的结构的 PHBHHx 三维三维培养体系培养体系，进行进行体外体外 MSC 的的培养培养。B 将筛选获得的 miRNAs 加入到三维培养体系中，检测 MSC 向成骨分化的水平，从三维宏观体系水平探索 miRNAs对 MSC 在体外三维系统构筑器官的调控作用。NSFC 2011 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 12 页 关键技术关键技术:1）设计并制作具有不同物理特性的微图形表面的 PHBHHx 细胞培养基底；2）细胞表面受体、细胞外基质、第二信使以及细胞骨架水平的检测；3）大量 miRNAs组合的建立与筛选；4）利用 BIOMEMS技术构筑不同立体形状的 PHBHHx 三维培养体系并实现 MSC 的三维培养；5）三维体系中 miRNAs的高效转染以及成骨化水平的检测。4.4.本项目的特色与创新之处。本项目的特色与创新之处。1)从细胞表面受体、细胞外基质蛋白、骨架蛋白等入手，在 miRNAs 水平上阐明材料表面对细胞界面行为影响的机理，并筛选出有效的 miRNAs，使得运用 miRNAs 调控组织工程种子细胞界面行为成为可能，并为进一步的研究或应用构建了良好的技术平台；2）考虑单个 miRNA作用的同时从多个 miRNAs 的综合作用着手，使 miRNAs的研究更为全面、有效；2)充分利用 BioMEMS 技术来构建研究材料表面与细胞界面行为的模型，为进一步、更全面的机理研究打下了基础；3)在三维水平上检测 miRNAs调控 MSC 定向分化成骨细胞的作用，建立精确模拟体内的体外调控系统。5.5.年度研究计划及预期研究结果。年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）2012 年 1 月-2012 年 12 月 预测在成骨倾向分化界面行为中被调控的 miRNAs，验证其在细胞界面调控细胞分化过程中的作用，预测靶基因，并验证与靶基因的相互作用和作用位点及方式。通过靶基因探索该 miRNAs 的下游信号通路 研究多个 miRNAs 的组合对 MSC 成骨分化的影响，筛选在其中起作用的 miRNAs组合 2013 年 1 月-2013 年 12 月 检测在细胞界面调控细胞分化过程中细胞骨架相关蛋白、细胞外基质蛋白、第二信使等的基因和蛋白水平的变化，预测并验证从细胞界面到调控 miRNAs的信号通路 2014 年 1 月-2014 年 12 月 调整 BIOMEMS 制作的具有微图形参量（尺寸、形状）的 PHBHHx 基底，寻找实现 MSC 不同界面行为的不同参数 NSFC 2011 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 13 页 2015 年 1 月-2015 年 12 月 构筑不同的 PHBHHx 三维培养体系，在三维培养体系中检验 miRNAs 调控 MSC 界面行为，进一步揭示 miRNAs调控细胞界面行为的机理 发表 SCI论文 5 篇以上，含在相关领域一流杂志上发表 3篇以上学术论文。（二）研究基础与工作条件（二）研究基础与工作条件 1、工作基础工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）申请人吴琼副教授多年来从事组织工程领域的研究，对 PHA 研究以及相关的组织工程研究有丰富经验，课题组成员对组织工程领域的研究方法手段包括 BioMEMS 技术都非常熟悉，在生物材料的加工和修饰以及细胞生物学研究方面均有深厚的工作基础，这为本项目的顺利进行打下良好的基础。课题组在 PHA的材料学研究方面包括：材料的生物相容性、细胞粘附性以及材料对细胞增殖和分化的作用，材料的表面修饰等性能改良研究。另一方面，原代细胞和细胞系的培养，细胞转染技术以及细胞-支架三维复合体相关技术已经成熟地运用在本课题组的研究中；RNA 和蛋白质水平上的机理探索研究也从基础科学研究方面促进了应用层面的研究和开发;同时miRNAs水平检测的平台也水平检测的平台也已经搭建成功已经搭建成功，已经成功证明出了已经成功证明出了 miRNA29a/b 对软骨细胞的调控作用对软骨细胞的调控作用。PHBHHx 是由本实验室开发的具有独立知识产权的生物可降解材料是由本实验室开发的具有独立知识产权的生物可降解材料，具有优良的生物相容性与机械加工性能。本课题组对 PHBHHx 材料与细胞的相互作用进行了富有成效的研究。发现 PHBHHx的单体可以抑制细胞凋亡1，促进细胞分化2，影响钙离子通道1等。这些研究为本课题中涉及到的细胞分子生物学研究打下坚实的基础。同时已经就 PHA三维支架的血管、神经导管、软骨等组织的组织工程进行了深入而富有成效的研究，课题