多酚氧化酶基因的体外高效表达及催化儿茶素形成茶黄素机理的研究__点此下载.pdf

申请代码：C041104 受理部门：收件日期：受理编号：国家自然科学基金 申 请 书 国家自然科学基金 申 请 书(2 0 0 9 版)(2 0 0 9 版)资助类别：青年科学基金项目 亚类说明：附注说明：项目名称：多酚氧化酶基因的体外高效表达及催化儿茶素形成茶黄素机理的研究 申 请 者：王坤波 电话：07314635304 依托单位：湖南农业大学 通讯地址：长沙市芙蓉区湖南农业大学茶学教育部重点实验室 邮政编码：410128 单位电话：0731-4618098 电子邮件： 申报日期：2009年3月15日 国家自然科学基金委员会 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 2 页 版本 1.015.615 基本信息基本信息 7wOIISoR 姓名 王坤波 性别男 出生 年月 1974 年 9 月 民族 汉族 学位 博士 职称助理研究员主要研究领域 茶叶生物化学 电话 07314635304 电子邮件 传真 07314635306 国别或地区 中国 个 人 网 页 工 作 单 位 湖南农业大学/茶学教育部重点实验室，作物种质创新与资源利用国家重点实验室培育基地 申 请 者 信 息 申 请 者 信 息 在研项目批准号 名称 湖南农业大学 联系人 伍小松 电子邮件 依托单位信息 依托单位信息 电话 0731-4618098 网站地址 http:/ 位 名 称 合作单位信息 合作单位信息 项目名称 多酚氧化酶基因的体外高效表达及催化儿茶素形成茶黄素机理的研究 资助类别 青年科学基金项目 亚 类 说 明 附注说明 申请代码 C041104:茶学 基地类别 预计研究年限 2010 年 1 月 2012 年 12 月 研究属性 应用基础研究 项 目 基 本 信 息项 目 基 本 信 息 申请经费 25.0000 万元 摘 要(限 400 字)：摘 要(限 400 字)：多酚氧化酶是儿茶素氧化合成茶黄素的关键酶。茶黄素是红茶中的重要品质成分，具有多种保健功效与药理功能。红茶中茶黄素的含量低，以红茶为原料来开发制备茶黄素的价值不大。而以茶儿茶素为底物，利用生物技术进行体外生物合成茶黄素，具有重要的理论与实际意义。本项目拟筛选出能高效表达且能高效催化儿茶素合成茶黄素的多酚氧化酶基因，并克隆其全长基因；构建基因工程菌，使目的基因在酵母菌内高效表达，通过正交回归组合设计优化工程菌高效生产多酚氧化酶的培养条件；优选出合成茶黄素的最佳条件；采用蛋白质层析系统和快速蛋白质纯化液相色谱分离纯化多酚氧化酶同工酶，利用数学模型结合电子自旋共振等方法研究多酚氧化酶同工酶与儿茶素组分相对应的催化氧化关系,揭示多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素的机理。关 键 词关 键 词(用分号分开，最多 5 个)多酚氧化酶；工程菌；表达；合成；茶黄素 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 3 页 版本 1.015.615 项目组主要参与者项目组主要参与者（注:项目组主要参与者不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。）编号 姓 名 出生年月 性别职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工 每年工作时间（月）1 傅冬和1967-12-15 女 教授 博士 湖南农业大学 07314618734 总体设计和技术指导 6 2 龚雨顺1974-8-26 男 副教授 硕士 湖南农业大学 07314635304 茶黄素形成机理的研究 8 3 李适1981-3-23 女 讲师 硕士 湖南农业大学 07314673760 工程菌培养条件优化 8 4 李娟1981-9-10 女 博士生 硕士 湖南农业大学 07314635305 xixi_ 工程菌的构建及表达 9 5 李勤1983-10-13 男 博士生 硕士 湖南农业大学 07314635305 多酚氧化酶分离纯化 9 6 吴扬1983-4-25 男 硕士生 学士 湖南农业大学 07314635305 wy_ 基因的筛选及克隆 10 7 李银花1977-10-12 女 讲师 硕士 湖南农业大学 07314635304 茶黄素分析方法的建立 8 8 9 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 8 2 3 2 1 说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。国家自然科学基金申请书 2009 版 第 4 页 版本 1.015.615 经费申请表经费申请表 （金额单位：万元）科目 申请经费 备注（计算依据与说明）一.研究经费 一.研究经费 22.5000 1.科研业务费 13.0000 （1）测试/计算/分析费 6.5000DNA 测序、引物合成、分析测试费用等（2）能源/动力费 2.0000试验过程中的能源消耗（3）会议费/差旅费 2.0000参加国内学术会议及样品收集（4）出版物/文献/信息传播费 2.5论文版面费、文献查询、专利申请费（5）其它 2.实验材料费 9.0000 （1）原材料/试剂/药品购置费 7.5000载体构建、克隆与表达、酶的分离纯化等（2）其它 1.5000生化试剂、标准品、常规分子生物学试剂等 3.仪器设备费 0.5000 （1）购置 0.5000增购电泳设备一套（2）试制 4.实验室改装费 5.协作费 二.国际合作与交流费 二.国际合作与交流费 0.0000 1.项目组成员出国合作交流 2.境外专家来华合作交流 三.劳务费 三.劳务费 1.2500研究生的劳务费用 四.管理费 四.管理费 1.2500学校科研管理费 合 计 合 计 25.0000 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配）与本项目相关的 其他经费来源 其他经费来源合计 其他经费来源合计 0.0000 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 5 页 版本 1.015.615 报告正文一、立项依据与研究内容 报告正文一、立项依据与研究内容(一一)立项依据立项依据 1研究意义研究意义 茶黄素是指红茶中溶于乙酸乙酯呈橙黄色的物质，由茶多酚、儿茶素类(主要为表儿茶素(EC),表没食子儿茶素(EGC),表没食子儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)及其衍生物在多酚氧化酶存在下氧化缩合而来。目前发现并经鉴定的茶黄素有 18种，四种主要茶黄素(茶黄素-3-没食子酸酯(TF2A),茶黄素-3-没食子酸酯(TF2B),茶黄素双没食子酸酯(TF3),茶黄素(TF1)的合成途径见图 1。红茶中茶黄素的含量约为 0.52%1,2。但茶黄素不仅是红茶的重要品质成分，而且具有多种药理功能与保健功效，如降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗突变、抗癌防癌等功效，在某些方面甚至优于儿茶素1-3。茶黄素的研究与开发具有重要的理论价值和广阔的产业化前景，尤其是在天然药物和功能性食品等方面。但是，目前茶黄素制备的产业化工艺技术尚不成熟，表现为产品纯度低、成本高、产能低，严重阻碍了以茶黄素为原料的天然药物及功能性食品的开发。红茶中茶黄素的含量低，以红茶为原料来开发制备茶黄素的价值不大。因此，以茶儿茶素为底物，筛选能高效表达且能高效催化儿茶素合成茶黄素的多酚氧化酶基因，并克隆其全长基因，构建基因工程菌，利用工程菌高效生产多酚氧化酶，进行体外生物合成茶黄素，研究多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素的机理，具有重要的理论与实际意义。(1)EC+EGC TF1 (2)EC+EGCG TF2A(3)ECG+EGC TF2B (4)ECG+EGCG TF3 图 1 四种主要茶黄素的化学结构和合成途径 茶黄素(TF1,R=R=H)茶黄素-3-没食子酸酯(TF2A,R=H,R=galloyl)茶黄素-3-没食子酸酯(TF2B,R=galloyl,R=OH)茶黄素双没食子酸酯(TF3,R=R=galloyl)表儿茶素(EC)表没食子儿茶素(EGC)表没食子儿茶素没食子酸酯(ECG)表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)国家自然科学基金申请书 2009 版 第 6 页 版本 1.015.615 2.国内外研究现状及发展动态分析国内外研究现状及发展动态分析 多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是自然界分布极广的一种酶，它在茶叶和果蔬加工中对品质形成具有极为重要的作用，它是儿茶素氧化合成茶黄素的关键酶。现在所说的多酚氧化酶通常是儿茶酚氧化酶(酪氨酸酶(单酚单氧化酶)、儿茶酚氧化酶(双酚氧化酶)和漆酶的统称4,5。多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚到它们对应的醌6。目前，在微生物中发现的多酚氧化酶主要是漆酶和酪氨酸酶，而儿茶酚酶则主要分布在植物中。漆酶的催化氧化机理主要表现在底物自由基的生成和漆酶分子中4 个铜离子的协同作用6,7。当漆酶催化酚类(如氢醌)氧化时，首先是底物氢醌向漆酶转移 1 个电子，生成半醌氧自由基中间体，用 ESR可观察到明显的自由基信号。其次是不均等非酶反应，2 分子半醌生成 1 分子对苯醌和 1 分子氢醌。氧自由基中间体还能转变成碳自由基中间体，它们可以自身结合或相互偶联，产物中除醌外还有聚合物和CO、CC偶联产物6,7。在氧气的存在下，还原态漆酶被氧化，氧气被还原成水。漆酶催化底物氧化和对氧气的还原是通过 4个铜离子协同地传递电子和价态变化实现的。酪氨酸酶的催化机理已基本阐明6,8。对酪氨酸酶的光谱研究表明它的活性中心有 2 个Cu2+，这 2 个 Cu2+能与周围的氮原子和氧原子形成 3 种不同的状态，分别为铜离子态(Emet)，氧-铜离子态(Eoxy)和亚铜离子态(Edeoxy)8。酪氨酸酶的基本功能有两个：一是作为单酚酶使单酚及其衍生物邻位羟基化，生成邻二酚及其衍生物；二是作为双酚酶氧化邻二酚及其衍生物生成相应的醌。酪氨酸酶和漆酶工程菌已得到成功构建并表达9,10。RT-PCR技术的应用，加速了植物 PPO基因的克隆，通常是根据己发表的 PPO基因铜结合区的保守序列或从组织纯化的 PPO 的 N 一末端的氨基酸序列设计 2 个寡核苷酸引物，进行 PCR扩增，就可以得到 PPO cDNA片段或全长，但一般 PCR 扩增分离得到的只是 PPO cDNA或基因片段，较少获得全长的 PPO cDNA或基因，若得到的是 PPO cDNA片段，还需再进行 3-RACE 和 5-RACE，以获得全长的 PPO cDNA。如 Gramham等用 RT-PCR从菠萝果肉中扩增出 PPO cDNA 片段11。彭世清用 RT-PCR 从甘薯块根中扩增出 PPO cDNA 核心片段12。赵东也用同样的方法从茶树叶片上分离出 PPO cDNA片段13,14。Haruta 等根据 Boss 等报道的苹果 PPO 铜结合区的保守序列15，设计 2 个寡核苷酸引物，以基因组 DNA为模板，进行 PCR扩增，分别从苹果、日本梨、中国梨、日本批把、桃、中国木瓜等蔷薇科果树的果实和叶片中分离出 PPO 基因的核心序列，其大小均为 681 bp16。把 PCR 扩增与基因文库筛选结合起来，可以高效准确地分离基因 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 7 页 版本 1.015.615 PPO cDNA 或基因全长。Boss 等从“Granny Smith”苹果果实中分离出 1 个编码“KD的全长 PPO cDNA(pAP05)15。Haruta等根据 Boss 等报道的苹果 PPO 的 cDNA序列设计引物，对苹果的基因组 DNA进行扩增，分离出 2个全长 PPO gDNA(PP03,PP07)，均含有长度为 1779 bp 的单一开放阅读框架17。Nishimura等从日本梨中分离出全长 PPO cDNA(1779 bp)，编码 66 KD PPO前体蛋白18。目前研究发现番茄和苹果的 PPO基因在大肠杆菌中得到了表达，表达产物不具有多酚氧化酶活性19。李桂琴对鸭梨多酚氧化酶基因编码区序列进行了克隆及表达，PPO基因在大肠杆菌中可以表达，表达产物具有酶活性，但活性较低20。植物多酚氧化酶基因在体外表达不具有活性或活性较低，原因可能有 2 种：一是由于大肠杆菌自身基因编码合成的蛋白酶使得表达蛋白发生了降解，导致酶的活性降低：二是多酚氧化酶是一种质体酶，其活性的发挥需要至少结合 2个铜离子并且要求形成正确的空间结构，但是由于蛋白质的原核表达缺乏翻译后加工过程，因此表达的蛋白质并没有形成有活性的高级结构，导致酶的活性比较低。因此，提高多酚氧化酶基因体外表达蛋白的活性是未来研究的核心问题。改变多酚氧化酶基因的表达，减少植物的酶促褐变，是作物育种的目标之一。Martinez 等认为采用反义 RNA 技术减少酶的表达，是一条控制酶促褐变的有效途径19.Bechem等用根癌农杆菌介导的方法，对马铃薯 PPO cDNA 的启动子(CaMV35S,GBSS,Patatin)进行筛选，发现 CaMV35S启动子首先可在植株的各个部分和各个阶段表达；虽然 GBSS,Patatin两个启动子都能在块茎中特异表达，但含 Patatin启动子的 PPO cDNA表达很弱；将含 Patatin 启动子的马铃薯 PPO cDNA 片段反向插入到根瘤农杆菌的染色体上，通过马铃薯节间外植体与携带多酚氧化酶反义基因的根瘤农杆菌共培养，获得转基因植株21。Murata等同样利用反义 RNA技术反向表达苹果的多酚氧化酶基因，将携带卡那霉素抗性基因和多酚氧化酶反义基因的根癌农杆菌感染苹果的叶片外植体，获得转基因苹果植株，结果转基因苹果植株的酶促褐变低于对照。从而进一步证明反义 RNA技术对控制多酚氧化酶酶促褐变具有重要意义22。茶叶 PPO 对茶叶品质的形成至关重要，红、绿茶的分类也是以是否对多酚氧化酶充分利用或充分钝化为依据。由于 PPO在茶叶加工中的特殊地位，从 18世纪末至今对它的研究从未间断，研究的内容也不断拓展和加深，但对茶树 PPO基因的研究却很少涉及。赵东等根据已经发表的植物多酚氧化酶中的保守序列区，设计简并引物，进行 nest-PCR，将产物与载体 pGEM-T Easy Vector连接、转化，得到了茶树多酚氧化酶基因的部分序列，其长度为 1006 bp，并将其与已经登陆于 GenBank中植物 PPO序列进行多重比较，发现 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 8 页 版本 1.015.615 茶树多酚氧化酶基因与其他植物多酚酚氧化酶基因有较高的相似性，尤其在铜离子结合部位，所有植物基本上一致13,14。Raizada J等分离得到了茶树(Camellia sinensis,black tea)多酚氧化酶基因全长，其长度为 1826 bp，GenBank 登录号为 AY659975。黄建安等对茶树多酚氧化酶(PPO)基因的 SNP 进行研究，以已克隆茶树 PPO基因的部分序列为模板，采用 PCR-SSCP 分析与对部分个体进行 DNA 测序相结合的方法，对不同茶树品种(株系)的 PPO基因作 SNP搜寻，并对酶切位点变异作进一步的 PCR-RFLP分析，以探讨 SNP与茶树品种适制性及遗传背景的关联性23。茶黄素由于具有独特的药理功能与保健功效，而成为当前研究重点和热点。自从Roberts 等首次应用儿茶素纯品进行体外酶促氧化实验以来，相继有许多学者对儿茶素的体外酶促氧化进行了深入的研究1,2。在酶性氧化方面取得了很大进展，如茶黄素(Theaflavins,TFs)类的合成，利用 PPO 取得成效，儿茶素结构中 C2-H 和 C3-H 的立体构象得以保留24。Robertson A 在茶叶体外模拟发酵试验中系统研究了不同浓度和比例的儿茶素混合体系、理化条件对 TFs 与 TRs 形成的影响25,26。Subramanion N.等研究了茶多酚氧化酶和过氧化物酶在茶黄素合成中的作用27，通过研究发现，茶叶多酚氧化酶同工酶 PPO1 有利于氧化 EC 和 EGC 合成茶黄素(TF1)。Tanaka T.等研究表明，46 种植物匀浆多酚氧化酶可以氧化 EC和 EGC形成茶黄素，其中枇杷、日本梨和蓝梅合成茶黄素的能力比茶叶强28。Sang Shengmin等采用过氧化物酶和 H2O2体系，通过茶儿茶素的配对氧化，合成了 18种茶黄素及其衍生物29。Tu You-Ying 等和 Kapil Sharmaa 等采用固定化酶合成茶黄素30,31。吴红酶分析比较了不同材料和不同提取方法得到的多酚氧化酶酶法制取茶色素的效果32。李适将毛栓菌多酚氧化酶应用于儿茶素的氧化，合成的茶黄素中酯型茶黄素的比例较高33。赵淑娟对微生物多酚氧化酶菌种进行了筛选和发酵，并应用于茶黄素合成34。王坤波3,35通过研究发现，丰水梨果实多酚氧化酶同工酶谱带较多，酶活性较强，有利于合成茶黄素。综上所述，利用生物酶源定向合成茶黄素将是制备茶黄素的发展趋势。目前，关于多酚氧化酶的酶源、多酚氧化酶同工酶对底物的竞争、多酚氧化酶的催化氧化机理和茶黄素的形成机理等一系列问题均未见系统而又深入的研究。本课题组近 10 年一直致力于多酚氧化酶的酶源筛选、多酚氧化酶基因的克隆、序列分析及结构预测、茶黄素的生物合成、茶黄素单体的分离制备以及茶黄素对多种肿瘤细胞的生长抑制开展了深入的研究，为本项目的开展实施奠定了一定的工作基础。本项目期望筛选出高表达或特异表达的多酚氧化酶基因，构建基因工程菌，使目的基因在宿主菌内高效表达，优化工程菌高 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 9 页 版本 1.015.615 效生产多酚氧化酶的条件，优选出合成茶黄素的最佳条件。同时突破多酚氧化酶同工酶的分离纯化技术，深入研究多酚氧化酶同工酶与儿茶素组分相对应的催化氧化关系，即多酚氧化酶同工酶(功能相同，而分子量大小不同的多酚氧化酶)催化儿茶素合成茶黄素的专一性，揭示多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素的机理。主要参考文献主要参考文献 1.宛晓春主编茶叶生物化学中国农业出版社，北京，2003，07 2.李立祥，萧伟祥茶黄素制取与分离研究进展中国茶叶加工，2000(4):29-33 3.王坤波茶黄素的酶促合成、分离鉴定及功能研究湖南农业大学博士论文，2007，10 4.贺立红，宾金华高等植物中的多酚氧化酶植物生理学通讯，2001,37(4):340345 5.陈桂信，潘东明，赖钟雄等园艺植物多酚氧化酶的分子生物学研究进展江西农业大学学报，2003,25(1):107-110 6.Chang Y.Lee&John R.Whitaker.Enzymatic browning and its prevention.American Chemical Society,Washington D.C.,1995.7.Shuttleworth K L,Bollag J.M.Soluble and immobilized laccase as catalysts for the transformation of substituted phenols.Enzyme and Microbial Technology,1986,8(3):171.8.Juana C,Soledad C,Francisco G.Tyrosinase kinetics:A semiquantitative model of the mechanism of oxidation of monohydric and dihydric phenolic substrate-reply.Journal of Theoretical Biology,2000,203(1):1-12.9.刘卫晓，钞亚鹏，钱世钧漆酶工程菌株的构建及其培养条件的研究微生物学报，2004，44(5):596-599 10.王戈林，宁华，沈萍，彭珍荣酪氨酸酶基因工程菌产黑色素的发酵条件研究中国医药工业杂志，1999，30(4):150-154 11.Gramham M W Hardy V,Bernard M,et al.Genetic engineering of pineapple to control blackheart.Agricultural Biotechnology:Laboratory,Fied and MarketM.Darwin Australia,1998,356-358 12.彭世清.甘薯多酚氧化酶保守区的cDNA克隆及序列分析闭热带作物学报，2000,21(2):65-68 13.赵东.茶树多酚氧化酶基因的分离与转化系统建立的研究浙江大学博士学位论文，2001 14.赵东，刘祖生，奚彪茶多酚氧化酶基因的克隆及序列分析茶叶科学,2001,21(2):94-98 15.Boss P K,Gardner R C,Janssen B J,et al.An apple polyphenol oxidase cDNA is up regulated in wounded tissues.Plant Molecular Biology,1995,27:429-433 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 10 页 版本 1.015.615 16.Haruta M,Murata M,Kadokura H,et al.Immunological and molecular comparision of ployphenol oxidase in Rosaceae fruit trees.Phytochemistry,1999,50:1021-1025 17.Haruta M.,Murata M.,Hiraide A.,Kadokura H.,Yamasaki M.,Sakuta M.,Shimizu S.,Homma S.Cloning genomic DNA encoding apple polyphenol oxidase and comparison of the gene product in Escherichia coli and in apple.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,1998,62(2):358-362.18.Nishimura M,Fukuda C,Murata M,et al.Cloning and some properties of Japanese pear (Pyres yrifolia)polyphenol oxidase,and changes in browning potential during fruit maturation.J Sci.Food Agric.,2003,83:1156-1162 19.Martinez M V,Whitaker J R.The biochemistry and control of enzymatic browning.Trends in Food Science&Technology,1995,6:195-200 20.李桂琴，李会宣，许冬倩，刘坤，张玉星鸭梨多酚氧化酶基因CDS区的克隆及表达.果树学报，2008,25(4):577-580 21.Bechem C W B,Spechmann G J,Vander Linde P C q et al.Antisense expression of polyphenol oxidase genes inhibits enzymatic browning in potato tubers.Bio-Technology,1994,12:1101-1105 22.Murata M,Haruta M,Murai N,et al.Transgenic apple(Males xdomestica)shoot showing low browning potential.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000,48:5243-5248 23.黄建安茶树分子遗传图谱构建及多酚氧化酶基因的 SNP研究湖南农业大学 2004 届博士论文，湖南长沙，2006，12 24.萧伟祥，钟瑾，胡耀武等双液相系统酶化学技术制取茶色素天然产物研究与开发,2001,13(5):49-52.25.Robertson Alastair.Effects of physical and chemical conditions on the in vitro oxidation of tea leaf catechins.Phytochemistry,1983,22(4):889896.26.Robertson A.The effect of catechin concentrations on the formatin of black tea ployphenols in vitro oxidation.Phytochemistry,1983,22:897-903 27.Subramanion N.,Purna Venkatesh,Shovan Ganguli et al.Role of polyphenol oxidase and peroxidase in the generation of black tea theaflavins.Journal of the Science of Food and Agriculture,1999,47:2571-2578 28.Takashi Tanaka,chie mine,kyoko inoue,miyuki matsuda,and isao kouno.Synthesis of Theaflavin from Epicatechin and Epigallocatechin by Plant Homogenates and Role of Epicatechin Quinone in the Synthesis and Degradation of Theaflavin.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50,国家自然科学基金申请书 2009 版 第 11 页 版本 1.015.615 2142-2148 29.Shengmin Sang,Joshua D.Lambert,Shiying Tian et al.Enzymatic synthesis of tea theaflavin derivatives and theiranti-inflammatory and cytotoxic activities.Bioorganic&Medicinal Chemistry,2004,12:459467 30.You-Ying Tu,Xin-Qing Xu,Hui-Long Xia,et al.Optimization of theaflavin biosynthesis from tea polyphenols using an immobilized enzyme system and response surface methodology.Biotechnology Letters,2005,27:269274 31.Kapil Sharma,Shamsher S.Bari,Harsh P.Singh.Biotransformation of tea catechins into theaflavins with immobilized polyphenol oxidase.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2009,56(4):253-258 32.吴红梅多酚氧化酶酶源筛选及酶法制取茶色素研究安徽农业大学 2004 届硕士论文，安徽合肥，2004，06 33.李适.微生物多酚氧化酶酶源筛选及其在茶黄素合成中的应用湖南农业大学 2006届硕士论文，湖南长沙，2006，06 34.赵淑娟微生物多酚氧化酶有效菌种的筛选、发酵、性质及其在茶黄素合成中的应用湖南农业大学硕士论文，2007，06 35.王坤波，刘仲华，赵淑娟，黄建安，傅冬和多酚氧化酶同工酶组成及其对茶黄素合成的影响农业现代化研究，2007,28(5):618-621 (二二)项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题 1.研究内容研究内容 1.1 目的多酚氧化酶基因的筛选、工程菌的构建及高效表达体系的建立目的多酚氧化酶基因的筛选、工程菌的构建及高效表达体系的建立 筛选出高表达或特异表达的多酚氧化酶基因，使该基因能够表达出高活性的多酚氧化酶且能高效催化儿茶素合成茶黄素，并克隆其全长基因。将目的多酚氧化酶基因与表达载体进行体外重组，再转入受体细胞，实现多酚氧化酶基因在受体细胞内高效正确表达。构建多种表达多酚氧化酶的基因工程菌，考察宿主(酵母菌)与质粒的适应性，筛选得到高效表达多酚氧化酶的重组子。1.2 利用工程菌高效生产多酚氧化酶的条件优化利用工程菌高效生产多酚氧化酶的条件优化 建立工程菌高效生产多酚氧化酶的优化体系，对培养基、pH 值、金属离子、温度和诱导剂等进行实验，建立工程菌发酵过程中以酶活和细胞生长量为目标函数的数学模 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 12 页 版本 1.015.615 型。1.3 多酚氧化酶同工酶的分离纯化及酶学性质研究多酚氧化酶同工酶的分离纯化及酶学性质研究 利用蛋白质层析系统、快速蛋白质纯化液相色谱和柱色谱技术，分离纯化多酚氧化酶同工酶，利用 SDS 等电聚焦电泳技术测定酶蛋白的亚基组成、分子量和等电点，并进行蛋白质的肽质量指纹分析。研究底物类型、底物浓度、酶浓度、pH、温度、离子强度对酶催化反应速率的影响，建立酶催化反应动力学关系。1.4 多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素的机理多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素的机理 研究儿茶素组成、底物浓度、pH、时间、温度、效应剂对儿茶素酶促合成茶黄素的影响。同时研究分子量大小不同的多酚氧化酶同工酶氧化儿茶素合成茶黄素的专一性，探讨多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素的机理。2.研究目标研究目标 2.1 筛选出能高效表达且能高效催化儿茶素合成茶黄素的多酚氧化酶基因，并克隆其全长基因。2.2 构建基因工程菌，利用工程菌高效生产多酚氧化酶，高效生物合成茶黄素。2.3 揭示多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素的机理。3.拟解决的关键问题拟解决的关键问题 3.1 目的多酚氧化酶基因的筛选目的多酚氧化酶基因的筛选 如何从植物或微生物中筛选能高效表达且能高效催化儿茶素合成茶黄素的多酚氧化酶基因，是本研究的关键问题之一。3.2 多酚氧化酶基因的体外高效表达多酚氧化酶基因的体外高效表达 如何实现目的多酚氧化酶基因体外高效表达，是本研究需要解决的核心问题。3.3 多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素的机理多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素的机理 利用数学模型和其它分析手段相结合，研究多酚氧化酶底物(儿茶素)产物(茶黄素)三者相对应的关系，揭示多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素的机理，也是本研究亟待解决的关键问题。(三三)拟采取的研究方案及可行性分析拟采取的研究方案及可行性分析 1.技术路线技术路线 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 13 页 版本 1.015.615 茶叶、梨、苹果等富含多酚和多酚氧化酶的植物多酚氧化酶酶活性和同工酶谱比较合成茶黄素能力比较筛选目的多酚氧化酶基因克隆多酚氧化酶基因全长工程菌和高效表达体系的构建工程菌培养条件优化多酚氧化酶同工酶的分离纯化茶黄素的合成多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素的机理比对目的PPO基因与其它植物或微生物PPO基因的差异，并比较相关蛋白质组的差异底物、诱导剂等因子对细胞生长、酶活性的影响比较多酚氧化酶体内外表达的差异分析多酚氧化酶的功能域启动子的强度、mRNA的二级结构、质粒的拷贝数和稳定性、寄主细胞等因子对目的基因表达效率的影响 2研究方法、实验手段和关键技术研究方法、实验手段和关键技术 2.1 研究方法与实验手段研究方法与实验手段 2.1.1 目的多酚氧化酶基因的筛选、工程菌的构建及高效表达体系的建立目的多酚氧化酶基因的筛选、工程菌的构建及高效表达体系的建立 目的多酚氧化酶基因的筛选 目的多酚氧化酶基因的筛选：本课题组通过对多种植物或微生物多酚氧化酶的比较研究，发现梨等多种植物多酚氧化酶活性比茶叶多酚氧化酶大，且能高效合成茶黄素3,35。因此有望从植物中筛选得到目的多酚氧化酶基因，使该基因能够表达出高活性的多酚氧化酶且能高效氧化儿茶素合成茶黄素。多酚氧化酶基因工程菌的构建多酚氧化酶基因工程菌的构建：以富含目的多酚氧化酶基因的新梢作材料，建立cDNA 基因文库。根据多酚氧化酶基因结合区的保守序列设计 2 个寡核苷酸简并引 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 14 页 版本 1.015.615 物，利用 nest-PCR 技术，分离获得高活性 PPO基因的部分序列。采用快速扩增 cDNA末端技术，分别进行 3-RACE 和 5-RACE，以获得全长的 PPO cDNA。根据 PPO cDNA序列设计引物，对高活性多酚氧化酶的基因组 DNA进行扩增，分离获得全长的 PPO cDNA。获取多酚氧化酶全长序列，比对目的 PPO基因与其它植物或微生物PPO基因的差异。采用生物质谱、固相 pH梯度等点聚焦电泳(IEF)、SDS-PAGE 等方法，并结合 BLASTp 软件将该基因推导的蛋白质序列与蛋白质公共数据库 Swissprot进行比对，研究相关蛋白质组的差异。工程菌高效表达体系的建立工程菌高效表达体系的建立：将多酚氧化酶基因与表达载体进行体外重组，再转入受体细胞，实现多酚氧化酶基因在受体细胞内高效正确表达。构建多种表达多酚氧化酶的重组子，考察宿主(酵母菌)与质粒的适应性，特别是不同宿主中质粒稳定性及多酚氧化酶基因的表达活力等，筛选能高效表达多酚氧化酶的重组子。2.1.2 利用工程菌高效生产多酚氧化酶的条件优化利用工程菌高效生产多酚氧化酶的条件优化 已进行两年前期研究工作，建立了微生物产多酚氧化酶的优化体系33,34。本研究在前期研究的基础上，拟进一步对工程菌产多酚氧化酶的培养基、pH 值、金属离子、温度、诱导剂等进行单因素实验和正交回归组合设计实验，使工程菌产多酚氧化酶活力达到 50 U/ml,同时使得合成茶黄素的纯度达到 60%以上，底物儿茶素转化率达到 80%以上；建立多酚氧化酶发酵过程中以酶活和细胞生长量为目标函数的数学模型。2.1.3 多酚氧化酶同工酶的分离纯化及酶学性质研究多酚氧化酶同工酶的分离纯化及酶学性质研究 多酚氧化酶同工酶的分离纯化多酚氧化酶同工酶的分离纯化：利用蛋白质层析系统和快速蛋白质纯化液相色谱，分离纯化多酚氧化酶同工酶，利用 SDS等电聚焦电泳技术测定酶蛋白的亚基组成、分子量和等电点。并采用生物质谱(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱,MALDI-TOF-MS)、固相 pH梯度等点聚焦电泳(IEF)、SDS-PAGE 等方法，进行蛋白质的肽质量指纹分析。多酚氧化酶同工酶酶学性质研究多酚氧化酶同工酶酶学性质研究：研究底物类型、底物浓度、酶浓度、pH、温度、离子强度对酶催化反应速率的影响，建立酶催化反应动力学关系。2.1.4 多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素机理的研究多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素机理的研究 茶黄素合成条件的优化茶黄素合成条件的优化：采用正交实验设计，研究底物儿茶素组成、底物浓度、pH、国家自然科学基金申请书 2009 版 第 15 页 版本 1.015.615 时间、温度、效应剂对茶黄素合成的影响，优化茶黄素的合成条件。茶黄素分析方法的建立茶黄素分析方法的建立：采用实验经验法、均匀设计法与 PRISM 优选法相结合，建立茶黄素的高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)、毛细管电色谱(PCEC)和高效薄层色谱(HPTLC)分析方法。多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素的机理多酚氧化酶催化儿茶素形成茶黄素的机理：在 Patrick A.Riley8初步建立的研究多酚氧化酶催化氧化机理的数学模型的基础上，同时通过电子自旋共振仪(ESR)在线监控多酚氧化酶催化儿茶素合成