多溴联苯醚肝脏代谢机理的模拟研究.pdf

申请代码：B0704 受理部门：收件日期：受理编号：国家自然科学基金 国家自然科学基金 申 请 书 申 请 书(2 0 0 9 版)(2 0 0 9 版)资助类别：面上项目 亚类说明：附注说明：项目名称：多溴联苯醚肝脏代谢机理的模拟研究 申 请 者：高士祥 电话：025-83596482 依托单位：南京大学 通讯地址：南京市汉口路 22 号 南京大学环境学院 邮政编码：210093 单位电话：025-83594532 电子邮件： 申报日期：2009年3月5日 国家自然科学基金委员会 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 2 页 版本 1.002.549 基本信息基本信息 tFkIi9vF 姓名 高高士祥 性别男 出生 年月 1962 年 7 月 民族 汉族 学位 博士 职称教授 主要研究领域 环境化学 电话 025-83596482 电子邮件 传真 国别或地区 中国 个 人 网 页 工 作 单 位 南京大学/环境学院 申 请 者 信 息 申 请 者 信 息 在研项目批准号 20677024 名称 南南京大学 21000801 联系人 高翔 电子邮件 依托单位信息 依托单位信息 电话 025-83594532 网站地址 单 位 名 称 合作单位信息 合作单位信息 项目名称 多多溴联苯醚肝脏代谢机理的模拟研究 资助类别 面上项目 亚 类 说 明 附注说明 申请代码 B0704:污染生态化学 B0707:化学环境污染与健康 基地类别 1991DA105443:污染控制与资源化研究国家重点实验室国家重点 预计研究年限 2010 年 1 月 2012 年 12 月 研究属性 基础研究 项 目 基 本 信 息项 目 基 本 信 息 申请经费 30.0000 万元 摘 要(限 400 字)：摘 要(限 400 字)：多溴联苯醚（PBDEs）是一类受到广泛关注的持久性有机污染物，能在生物体内积累、代谢并具有内分泌干扰毒性，其在生物体内代谢为 OH-PBDEs 等代谢产物是影响其毒性的关键过程，国内外虽然在其代谢产物的检测分析方面做了不少工作，但对代谢机理及其代谢活性与 PBDEs 分子结构之间的内在关系研究还非常缺乏。本课题以 2-10 取代的典型PBDEs 为研究对象，开展其肝脏组织体外模拟代谢研究，在对 PBDEs 代谢动力学和代谢产物进行分析的基础上，鉴定代谢过程涉及的关键代谢酶，通过三维分子模拟技术研究 PBDEs 在生物体内与相关代谢酶的相互作用过程，从分子水平上揭示其代谢机理，通过 PBDEs 结构与其代谢活性的三维定量结构-活性相关分析，预测 PBDEs 的结构与其体内代谢有效性的定量关系。其创新点体现在实验技术与理论模拟的有机结合阐明有机污染物的生物代谢机制。关 键 词关 键 词(用分号分开，最多 5 个)多溴联苯醚，肝脏代谢，CYP450 酶，分子模拟 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 3 页 版本 1.002.549 项目组主要参与者项目组主要参与者（注:项目组主要参与者不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。）编号 姓 名 出生年月 性别职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工 每年工作时间（月）1 毛毛亮 1984-02-06 男 博士生 学士 南京大学 025-83596482 代谢酶的分子模拟 10 2 沈沈梦楠 1984-02-27 男 博士生 硕士 南京大学 025-83596482 PBDE 肝 脏代谢10 3 陈陈杰 1984-2-21 女 博士生 硕士 南京大学 025-83596482 代谢产物分析10 4 吴吴剑锋 1984-2-21 男 硕士生 学士 南京大学 025-83596482 代谢酶制备 10 5 陈陈怡君 1985-07-24 女 硕士生 学士 南京大学 025-83596482 酶活性测定 10 6 赵赵志刚 1987-05-15 男 硕士生 学士 南京大学 025-83596482 3D-QSAR 模型10 7 8 9 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 7 1 0 0 0 3 3 说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。国家自然科学基金申请书 2009 版 第 4 页 版本 1.002.549 经费申请表经费申请表 （金额单位：万元）科目 申请经费 备注（计算依据与说明）一.研究经费 一.研究经费 22.0000 1.科研业务费 9.7000 （1）测试/计算/分析费 4.0000PBDE 及其代谢产物的分析测定，代谢酶的分析鉴定（2）能源/动力费 1.5000水电、实验室租金（3）会议费/差旅费 1.8000参加会议交流，文献调研等（4）出版物/文献/信息传播费 1.9000论文版面费、文献检索网络费、复印费等（5）其它 0.5000其他零星开支 2.实验材料费 6.0000 （1）原材料/试剂/药品购置费 5.5000生化试剂、化学试剂、标准样品、衍生化试剂购买（2）其它 0.5000消耗性玻璃仪器 3.仪器设备费 5.8000 （1）购置 5.8000更新天平、超净工作台、紫外分光光度计、电脑等（2）试制 4.实验室改装费 0.5000改善实验室工作条件 5.协作费 二.国际合作与交流费 二.国际合作与交流费 2.0000 1.项目组成员出国合作交流 2.0000赴美国佐治亚大学开展学术交流 2.境外专家来华合作交流 三.劳务费 三.劳务费 4.5000研究生助研费 四.管理费 四.管理费 1.5000学校提取管理费 合 计 合 计 30.0000 国家其他计划资助经费 30.0000其他经费资助（含部门匹配）与本项目相关的 其他经费来源 其他经费来源合计 其他经费来源合计 30.0000 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 5 页 版本 1.002.549 报告正文（一）立项依据与研究内容 报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：1.项目的立项依据项目的立项依据 多溴联苯醚（PBDEs）作为一种阻燃剂被广泛应用于电子、电器、化工、交通、建材、纺织、石油、采矿等领域中，添加量可达5%-30%。由于其有良好的阻燃效果，且短时期内很难找到合适的替代品，因此仍在世界范围内大量使用。目前PBDEs已经在各种环境介质中包括大气、水体、沉积物、土壤和各种生物体(海洋哺乳动物、鱼、鸟和蛋等）和人体(奶、血清和脂肪组织等)中被检测出来。PBDEs具有类似多氯联苯（PCBs）的结构，理论上有209种同族体。这类化合物亲脂性强，化学性质稳定，可以随着食物链生物富集和放大，并因其有一定的挥发性，可以散逸到空气中，随大气长距离迁移，属于持久性有机污染物。由于其持久性和潜在的危害性，对其环境问题的研究是当前环境科学的一大热点。近些年来，国内外学者对环境介质和生物体内的PBDEs污染状况做了大量的研究。随着研究的深入，在生物体内不仅检测出PBDEs的同系物，同时作为其代谢产物的羟基化多溴联苯醚（OH-PBDEs）和甲氧基化多溴联苯（MeO-PBDEs）也常常被检出。Marsh 等人在老鼠血浆内发现有16种OHPBDEs1。在底特律河鱼体中,检测出10种OH-PBDEs，其中主要同系物为6-OH-BDE47和微量的2-OH-BDE68,4-OH-BDE49和4-OH-BDE42。OH-PBDEs的范围在2.7-198 pg/g 湿重之间。研究发现，鱼体内的OH-PBDEs可能有两种来源：母体PBDEs在鱼体中代谢形成，然后富集在鱼体的血液当中；一部分OH-PBDEs也可能来自于PBDEs在环境中转化后富集在鱼体中2。在瑞典的某些物种中，如大西洋鲑、鲱鱼和一些经济鱼油中都检测出了OH-PBDEs 和 MeO-PBDEs34。Seija Sinkkonen等人对波罗的海、大西洋和北极地区14个生态区内的鱼和海鸟样品检测发现，除大西洋海鸟和淡水生态区内七鳃鳗幼虫体内以外，其他生态区的生物样品中均有四溴代的MeO-PBDEs被检出，但是这些生物体内的MeO-PBDEs来源尚不明确5。对PBDEs的内分泌干扰活性研究表明，在生物体内代谢形成的OH-PBDEs是其内分泌干扰活性的主要中间体，OH-PBDEs在人体内能与转甲状腺素蛋白竞争性结合而干扰甲状腺素的功能6。OH-PBDEs还能显著影响人体肾上腺皮质癌细胞中芳构化酶活性7。PBDEs在生物体内发生代谢后，不仅对其毒性产生影响，同时由于代谢产物亲脂性的改变，也会影响其生物积累和放大。因此对PBDEs的代谢过程及代谢产物形成机理进行系统深入的研究对更好的评价其生态和健康风险具有至关重要的意义。目前PBDEs的生物代谢研究主要集中在体内原位代谢和体外模拟代谢两方面。体内OxBrBry 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 6 页 版本 1.002.549 原位代谢是研究活的生物体暴露于PBDEs后体内代谢产物和相关代谢酶的表达水平，主要利用C、N稳定同位素技术，将用14C或13C标记的PBDEs同系物利用口服、胃灌等方式注入动物体内，检测一定时间后PBDEs在生物体内的形态和结构变化，从而构建其在生物体内的代谢途径。如，Hakk等人发现BDE-99可以在大鼠体内代谢，产生2种五溴代BDE和2种四溴代OH-BDE8。而BDE-100可以在大鼠体内代谢产生5种五溴代OH-BDE和6种四溴代OH-BDE9。Goran Marsh等人将BDE-47以口服方式对大鼠进行染毒，采集1-5天的排泄物进行代谢产物的测定，检测出6种四溴代的OH-BDE和3种三溴代的BDE 10。体外模拟代谢是利用生物的代谢器官或组织进行体外模拟研究，主要是以肝脏为基础进行。肝脏是外源化合物生物转化的重要器官，含有参与物质代谢重要的酶系(主要是细胞色素P450酶CYP450)，该酶系参与药物及各种内源性和外源性化合物在体内的代谢过程。细胞色素P450属于混合功能氧化酶系统中的一种，由三十多种同工酶(亚型)组成，在哺乳动物体内主要有CYP1、CYP2、CYP3三大家族。P450同工酶可能存在于所有生命体内，在细胞内P450多位于线粒体、细胞核内膜及内质网。进入生物体内的外源物(如药物、食品添加剂、致癌物、环境污染物等)通常在代谢系统的作用下，先发生相反应（氧化、还原、水解）生成羟基化产物等中间体，相反应的产物进一步与一些内源性物质的活性基团结合（相反应），形成最终代谢物。例如，最常见的CYP1A的诱导物为多环芳烃、共平面PCB等平面芳香化合物，而CYP2B和 CYP3A可被邻位氯取代的PCB等球状分子诱导。各种污染物在不同生物体内对CYP1、CYP2和CYP3家族酶活性的诱导、活力及基质选择性是决定污染物及其同族物在生物组织中的存在形式、归趋和潜在毒性的关键因素。动物体外代谢研究可以较好地排除体内因素干扰，直接观察酶对底物代谢的选择性，为整体试验提供可靠的科学依据。以肝脏为基础的体外代谢系统主要包括肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞、肝组织切片及离体肝灌流。这些方法已经被用于PCBs、PBDEs等持久性有机污染物的模拟代谢研究。Melissa等人提取北极地区白鲸肝微粒体进行体外模拟代谢PCBs和PBDEs的研究，并与大鼠做对比。研究表明，经90分钟的体外模拟代谢实验，低溴代的BDE-15、BDE-28和BDE-47在白鲸肝微粒体内会迅速被代谢，代谢率分别为100%、11%和5%，对照组大鼠肝微粒体内BDE-28、BDE-49、BDE-99和 BDE-154的代谢率分别13%、44%、11%和17%。同时，羟基化BDE-15代谢产物也在水浴孵化后被检测出来11。Heather等人提取人体肝细胞进行PBDEs体外模拟代谢研究发现，BDE-99经过肝细胞体外代谢后产生了2，4，5-三溴苯酚、2种羟基化的PBDEs和1种不能够确定结构的四溴代代谢产物；而BDE-209经肝细胞代谢后没有出现羟基化和脱溴化的代谢产物，说明BDE-209在细胞内没有发生代谢变化，可能是因为形成了不可提取的共价蛋白代谢产物或者是因为实验暴露时间太短（24-72小时）还不足以使BDE-209进入细胞内进行代谢。而同时进行的基因表达测定观察到肝细胞暴露于BDE-99和BDE-209后均出现了细胞色素P450单加氧酶CYP1A2、CYP3A4、脱碘酶和谷胱甘肽S-国家自然科学基金申请书 2009 版 第 7 页 版本 1.002.549 转移酶M1的升高12。Heli Routti等人对斯瓦尔巴特群岛和波罗的海中的环斑海豹研究表明，进入海豹体内的PCBs对肝脏内的相单加氧酶系和相关相酶系都可以产生诱导作用，同时这些酶对进入体内的PCBs催化代谢形成羟基化或是甲氧基化代谢产物，从而对机体健康形成潜在的风险13。Roco F.Cantn等人研究发现，在利用H295R人肾上腺皮质癌细胞进行体外染毒实验过程中羟基化和甲氧基化的多溴联苯醚可以对CYP17活性有明显影响 14。虽然国际上已经对 PBDEs 的生物代谢进行了不少探索性研究，但 PBDEs有 209种同系物，难以对每一种同系物分别进行研究，而不同 PBDEs 同系物在肝脏中的代谢机理及其结构与代谢活性的关系尚未见报道。有必要在对文献数据进行系统分析的基础上，开展典型 PBDEs 的生物代谢机理分析，并利用现代计算机技术对 PBDEs 的分子结构进行表征，找出 PBDEs 生物代谢性与分子结构之间的内在联系，以便用有限的 PBDEs同族物生物代谢性的数据和预测其余同族物的生物体内代谢行为，而这方面的研究可以借助于三维定量结构-活性相关（3D-QSAR）和三维分子模拟技术进行。鉴于肝脏及其 CYP450 酶系对生物体代谢外源化合物的重要性，目前已经积累了大量的 CYP450酶结构、活性及其代谢机制的数据，已经建立了多种 3D-QSAR 模型用于CYP450 底物或抑制剂研究。3D-QSAR 以化合物分子的三维结构特征为基础处理污染物分子三维空间中静电分布、立体性、氢键和疏水键等与生物活性之间的定量依存关系。广泛应用的 3D-QSAR 计算方法之一是比较分子场分析法(CoMFA),其理论依据为化合物分子与受体的相互作用是可逆的、非共价结合的弱作用力,如静电引力、氢键、疏水作用和范德华力等。系列化合物在与同一受体结合时,上述力场具有相似性。3D-QSAR 在酶的晶体结构还未知的情况下可以对酶的活性部位进行解释和考察。与传统的 QSAR方法相比，3D-QSAR 考虑了生物活性分子的三维构象性质，即在 QSAR 中引入与生物活性分子三维结构信息有关的参数作为变元，因而能精确地反映生物活性分子与受体作用的真实情况，更深刻地揭示污染物与受体的相互作用机制。同源分子模拟是一种快速模拟蛋白质的三级结构的生物大分子模拟方法，该方法主要是利用现有的结构作为模板，应用计算机建立三维分子模型来模拟分子结构及行为，进而模拟分子体系各种物理和化学性质。一般认为，目标蛋白质序列和模板之间的相似性越高，所模拟结构的正确性和可信度也越高。3D-QSAR 和同源分子模拟等方法相结合可以深入探讨 CYP450 酶系作用机制(包括酶的催化活性中心、酶促反应的限速步骤、酶与底物的共价结构等)。同源分子模拟方法可根据 CYP450 原型模板，建立应用于其他有关吸收、分布、代谢、排泄的模型。例如，同源分子模拟可利用已知晶体结构的细菌 CYP102 和兔 CYP2C5 血红蛋白为模板来构建人 CYP450 的分子模型15。Wang 等建立了 PBDEs 与芳烃受体作用的3D-QSAR 模型，指出 PBDEs 的活性/毒性受构象改变分子中原子反应和分子静电势场的影响16。这些先导型工作为深入开展 PBDEs 生物代谢机理和结构-活性关系研究奠定了基础。国家自然科学基金申请书 2009 版 第 8 页 版本 1.002.549 针对PBDEs生物代谢研究中同族物众多而代谢机制不明的问题，本课题拟选择2-10取代的典型 PBDEs 同族物，在进行 PBDEs 在哺乳动物和鱼类肝脏组织体外模拟代谢研究的基础上，筛选确定与 PBDEs 代谢相关的 CYP450 酶，运用先进的三维分子模拟、分子对接及 3D-QSAR技术，研究 PBDEs 与 CYP450 酶在三维空间中的相互作用，揭示其代谢 PBDEs 的机理，分析不同结构的 PBDEs 代谢活性和代谢产物的差异，构建 PBDEs在生物体内代谢有效性的定量预测模型。为探索 PBDEs 在生物体内代谢后的毒性和积累性变化规律提供理论依据。参考文献：参考文献：1 Tina Malmberg,Maria Athanasiadou,Goran Marsh,et.,“Identification of Hydroxylated Polybrominated Diphenyl Ether Metabolites in Blood Plasma from Polybrominated Diphenyl Ether Exposed Rats”.Environ.Sci.Technol.,2005;39:5342-5348 2 Karlis Valters,Hongxia Li,Mehran Alaee,et.，“Polybrominated diphenyl ethers and hydroxylated and methoxylated brominated and chlorinated analogues in the plasma of fish from the detroit river”,Envrion.Sci.Technol.,2005;39:5612-5619.3 Asplund,L.;Athanasiadou,M.;Sjodin,A.;Bergman,.,Borjeson,H.;“Organohalogen substances in muscle,egg and blood from healthy Baltic salmon(Salmo salar)and Baltic salmon that produced offspring with the M74 syndrome”,Ambio,1999,28,67-76.4 Haglund,PS,Zook,D.R.;Buser,H.-R.;Hu,J.“Identification and quantification of polybrominated diphenyl ethers and methoxy-polybrominated diphenyl ethers in Baltic biota”,Environ.Sci.Technol.,1997,31:3281-3287.5 Seija Sinkkonen,Anna-Lea Rantalainen,Jaakko Paasivirta,et,“Polybrominated methoxy diphenyl ethers(MeO-PBDEs)in fish and guillemot of Baltic,Atlantic and Arctic environments”Chemosphere,2004,56:767775 6 Hamers T,Kamstra JH,Sonneveld E,Murk AJ,Kester MHA,Andersson PL,et al.,“In vitro profiling of the endocrine-disrupting potency of brominated flame retardants”.Toxicol.Sci.,2006,92(1):157173 7 Canton RF,Sanderson JT,Letcher RJ,Bergman A,van den Berg M.,“Inhibition and induction of aromatase(CYP19)activity by brominated flame retardants in H295R human adrenocortical carcinoma cells”.Toxicol.Sci.,2005,88(2):447-455 8 Hakk H,Larsen G,Klasson Wehler E.,“Tissue disposition,excretion and metabolism of 2,2,4,4,5-pentabromodiphenyl ether(BDE-99)in the male Sprague-Dawley rat”,Xenobiotica,2002,32:369382.9 Hakk H,Huwe J,Low M,Rutherford D,Larsen G.,“Tissue disposition,excretion and metabolism of 2,2,4,4,6-pentabromodiphenyl ether(BDE-100)in male Sprague-Dawley rats”.Xenobiotica,2006,36:7994.10 MarshG,AthanasiadouM,Athanassiadis I,Sandholm A.,“Identification of hydroxylated metabolites in 2,2,4,4-tetrabromodiphenyl ether exposed rats”Chemosphere,2006,63:690697.11 Melissa A.McKinney,Sylvain De Guise,Daniel Martineau,et.,“Biotransformation of polybrominated diphenyl ethers and polychlorinated biphenyls in beluga whale(Delphinapterus leucas)and rat mammalian model using an in vitro hepatic microsomal assay”,Aquatic Toxicology,2006,77:8797 12 Heather M.Stapleton,Shannon M.Kelly,Ruoting Pei,Robert J.Letcher,Claudia Gunsch,“Metabolism of Polybrominated Diphenyl Ethers(PBDEs)by Human Hepatocytes in Vitro”,Environmental Health Perspectives,2009,117:197-202 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 9 页 版本 1.002.549 13 Heli Routti,Robert J.Letcher,Augustine Arukwe,Bert van Bavel,Nigel G.Yoccoz,Shaogang Chu,and Geir W.Gabrielsen,“Biotransformation of PCBs in Relation to Phase I andII Xenobiotic-Metabolizing Enzyme Activities in Ringed Seals(Phoca hispida)from Svalbard and the Baltic Sea”,Environ.Sci.Technol.,2008,42(23):8952-8958 14 Roco F.Cantn,J.Thomas Sanderson,Sandra Nijmeijer,ke Bergman,Robert J.Letcher,Martin van den Berg，“In vitro effects of brominated flame retardants and metabolites on CYP17 catalytic activity:A novel mechanism of action?”Toxicology and Applied Pharmacology,2006,216:274281 15 Lewis DF.,“Homology modeling of human CYP2 family enzymes based on the CYP2C5 crystal structure”.Xenobiotica,2002,32(4):305-323 16 Wang YW,Zhao CY,Ma WP,Liu HX,Wang T,Jiang GB,“Quantitative structure-activity relationship for prediction of the toxicity of polybrominated diphenyl ether(PBDE)cingeners”,Chemoshere,2006,64(4):515-524 2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）研究内容 研究内容 本课题以 2-10 取代的典型 PBDEs 为研究对象，开展其肝脏组织体外模拟代谢研究，在对PBDEs代谢动力学和代谢产物进行分析的基础上，鉴定代谢过程涉及的关键代谢酶，通过三维分子模拟技术研究 PBDEs 在生物体内与相关代谢酶的相互作用过程，通过PBDEs 结构与其代谢活性的三维定量结构-活性相关分析，预测 PBDEs 的结构与其体内代谢有效性的定量关系。主要研究内容如下：1）PBDEs 在生物肝脏组织中代谢过程的体外模拟 1）PBDEs 在生物肝脏组织中代谢过程的体外模拟 由于 PBDEs 在生物体内代谢过程研究尚不充分，许多关键代谢过程不能从文献中获得，本课题将开展 PBDEs 在水生生物和哺乳动物肝脏组织中代谢的体外模拟实验研究。将高溴代的 BDE-209、四溴代的 BDE-47、五溴代的 BDE-99 等作为重点研究对象，选取鲫鱼作为水生生物的代表，小鼠作为哺乳动物的代表。利用活体肝细胞和肝微粒体体外代谢法模拟 PBDEs 的代谢过程，测定其代谢动力学；分析鉴定代谢产物的结构并比较其与母体 PBDEs 的毒性差异。重点分析鉴定 PBDEs 的羟基（HO-）、甲氧基（MeO-）和甲磺基（MeSO2-）等代谢产物，构建 PBDEs 在生物体内的代谢途径。2)PBDEs 模拟代谢过程中关键代谢酶的确定 2)PBDEs 模拟代谢过程中关键代谢酶的确定 根据文献已经报道的生物肝脏组织内与外源污染物代谢有关的酶，以 CYP450 酶系为研究对象，筛选鲫鱼和小鼠肝组织内存在的主要 CPY450 酶系种类；根据 CYP450 酶不同亚型的代谢差异选择特异性底物，建立主要代谢酶活性的测定方法；测定 PBDEs 模拟代谢过程中各种酶活性的变化，分析酶活性与 PBDEs 代谢动力学的内在联系，确定代谢 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 10 页 版本 1.002.549 PBDEs 涉及的关键酶。3）PBDEs 肝脏代谢过程的理论模拟 3）PBDEs 肝脏代谢过程的理论模拟 收集文献及 PDB 库中与 CYP450 酶相关的酶结构数据，优先采用晶体结构已经确定的可靠结构数据，应用同源模建方法结合量子化学、分子力学和分子动力学等手段模拟生物体内代谢 PBDEs 的关键酶的三维结构，通过分子对接技术考察 PBDEs 与关键酶在三维空间的结合过程，在分析 PBDEs 与酶结合的活性点位和电子传递转移过程的基础上，结合鉴定出的代谢产物的结构，研究 PBDEs 的代谢机理和代谢途径。4）PBDEs 结构与其代谢有效性三维定量结构-活性预测模型的构建 4）PBDEs 结构与其代谢有效性三维定量结构-活性预测模型的构建 PBDEs 有 209 种同族体，对每一种同族体分别进行研究是一项费时费力的工作，而利用现代计算机技术对 PBDEs 的分子结构进行表征，找出 PBDEs 生物代谢有效性与分子结构之间的内在联系，就可以用已知的少量 PBDEs 生物代谢活性的数据预测其余同族体的在生物体内的代谢行为。本课题将用 Tripos 公司的 Sybyl7.3 软件包对 PBDEs 的三维分子结构进行模拟和表征，分析典型 PBDEs 与代谢酶作用过程的关键影响因子，如分子量、极性、疏水性、偶极矩等分子结构参数和温度、时间、污染物浓度等环境因素，结合代谢动力学和代谢机理的研究结果，分析其结构及形态差异与生物代谢有效性的关系，发展 PBDEs 在生物体内代谢过程的 QSAR 理论预测模型，并从分子水平上解释 PBDEs生物代谢活性与其结构之间的内在关系。研究目标：研究目标：针对 PBDEs 在生物体内代谢为羟基化产物后内分泌干扰活性增加的问题，采用体外模拟 PBDEs 肝组织代谢过程，结合三维分子模拟手段，确定 PBDEs 代谢涉及的关键酶，阐明典型 PBDEs 在生物体内的代谢机理，建立其在生物体内代谢活性的预测模型。为PBDEs 的生态与健康风险评价提供科学依据。拟解决的关键科学问题 拟解决的关键科学问题 1.确定 PBDEs 在肝组织中代谢有效性及关键代谢酶的；2.阐明 PBDEs 在生物体内的代谢机理；3.建立不同结构 PBDEs 在生物体内代谢活性预测的三维 QASAR 预测模型。3拟采取的研究方案及可行性分析。3拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）研究方案：研究方案：1)PBDEs 在生物体内代谢过程的体外模拟 1)PBDEs 在生物体内代谢过程的体外模拟 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 11 页 版本 1.002.549 PBDEs 在水生生物和哺乳动物的体外模拟代谢实验研究中,水生生物以鲫鱼为主代表，哺乳动物则选取小鼠为主要研究对象。采用活体肝细胞和肝微粒体分别进行模拟代谢研究。在肝细胞代谢实验中，鲫鱼和小鼠在实验室驯化培养一段时间后，取出其肝脏组织，灌流、预孵育制备原代肝细胞，测定肝细胞活力，PBDEs 溶于 DMSO 溶液中，稀释至适当浓度进行代谢实验，在不同代谢时间内取样测定 PBDEs 浓度和 P450 酶活性；肝微粒体实验采用差速离心法分别制备鲫鱼和小鼠的肝微粒体，将 PBDEs 加入肝微粒体中进行孵育模拟体内代谢过程。采用 Bradford 法检测肝微粒体蛋白浓度，用分光光度法检测 P450 酶系含量及活性。利用 GC-MS 等测定 PBDEs 及其代谢产物含量、鉴定代谢产物并且分析其毒性。2)PBDEs 模拟代谢过程中关键代谢酶的确定 2)PBDEs 模拟代谢过程中关键代谢酶的确定 CYP450 酶系有三十多种亚型，不同亚型的代谢底物和代谢活性不同，在 PBDE 模拟代谢过程中涉及的不同亚型的 CYP450 酶通过采用特异性的底物可以对不同亚型 P450酶的活性进行测定，重点关注与 PBDEs 代谢有关的 CYP1A2、CYP3A4 等亚型，考察肝微粒体的制备和孵育条件对酶活性的影响，确保在代谢实验过程酶活性的稳定表达和准确测定。测定 PBDEs 模拟代谢过程中各种 CYP 亚型酶活性的变化，分析酶活性与 PBDEs代谢动力学的内在联系，确定代谢 PBDEs 涉及的关键酶。3)PBDEs 生物体内代谢过程的理论模拟 3)PBDEs 生物体内代谢过程的理论模拟 以蛋白质数据库(PDB)中与 PBDEs 代谢有关的关键酶的 X-ray 晶体结构为基础，结合PDB 库中各种 CYP450 亚型的蛋白质测序结果，利用 Tripos 公司的 SYBYL7.3 软件包中的 FUGUE 模块进行代谢 PBDEs 涉及的各种亚型 CYP450 酶三维分子结构的同源模建，进行 PBDEs 配体分子三维结构的构建、能量优化、构象分析与活性构象的搜索，通过 Dock、GOLD、Surflex 等程序模拟 PBDEs 与关键酶在三维空间的结合过程，研究 PBDEs 生物代谢转化的动态过程。在分析 PBDEs 与酶结合的活性点位和电子传递转移过程的基础上，结合代谢产物的结构，研究 PBDEs 的代谢机理和代谢途径。4)PBDEs 结构与其代谢有效性三维定量结构-活性预测模型的构建 4)PBDEs 结构与其代谢有效性三维定量结构-活性预测模型的构建 根据分子对接过程中确定的柔性分子叠合规则，利用 SYBYL7.3 软件包中的 CoMFA和CoMSIA模块，分别研究典型PBDEs与CYP450不同亚型结合活性的三维分子构效关系，阐明不同受体与典型 PBDEs 进行选择性结合的分子基础，建立基于三维分子结构的代谢活性预测模型。分析 PBDEs 与代谢酶作用过程的关键影响因子，如分子量、极性、疏水性、偶极矩等分子结构参数和温度、时间、污染物浓度等环境因素。利用 DRAGON 等量化计算软件选择和确定表征 PBDEs 结构及其与生物代谢有关的主要参数如 EHOMO 和ELUMO 等，分析其结构及形态差异与生物代谢有效性的关系，发展体内有效形态的预测方法和相关生物代谢过程的 QSAR 理论预测模型。国家自然科学基金申请书 2009 版 第 12 页 版本 1.002.549 技术路线：技术路线：可行性分析：可行性分析：国内外在POPs生物体内代谢的研究方面已开展了大量的工作，尤其是对与PBDEs结构相似的PCBs的研究已经开展了很多年。对PBDEs生物体内代谢研究国外也已有一些探索性研究报道，积累了较多的基础数据。这些工作都为本课题提供了较好的参考资料。肝脏组织体外模拟代谢是药效学研究中常用的手段，方法比较成熟，在用于PBDEs的代谢研究中只要根据PBDEs的性质进行适当的条件优化与调整即可，因此研究方法完全可行。申请人长期从事环境中有机污染物迁移转化行为的研究，近些年来在对PBDEs的环境行为、生物降解性等方面已经进行了一系列的研究工作，在国家自然科学基金项目“白腐菌降解多溴二苯醚的机理研究”工作中对白腐菌及其过氧化物酶降解PBDE的机理进行了较深入的研究，对木素过氧化物酶的三维分子结构及其与PBDE作用过程的三维分子模拟开展了研究，掌握了酶促降解代谢有机污染物的实验和理论模拟技术，已有多篇相关论文在SCI刊物上发表，为承担本课题的研究积累了丰富的经验，完全具备承担本项目研究工作的能力。申请人所在研究组拥有用于三维分子模拟和3D-QSAR研究的Sybyl7.3软件包和相关硬件设备，在课题的研究过程中还可依托“污染控制和资源化国家重点实验室”的仪器设备和研究条件，为研究工作提供有力的保障和支持。文献查阅与数据收集体外模拟实验 制备原代肝细胞和肝微粒体 PBDEs 生物机理和代谢途径 代谢过程理论模拟 分子动力学手段 构建 PBDEs结构与代谢有效性定量预测模型 揭示 PBDEs分子生物代谢和积累机制代谢产物含量、结构测定 P450 酶系含 量及活性测定 国家自然科学基金申请书 2009 版 第 13 页 版本 1.002.549 3.3.本项目的特色与创新之处。本项目的特色与创新之处。PBDEs 在生物体内代谢为 OH-PBDEs 等代谢产物是影响其毒性的关键过程，国内外虽然在其代谢产物体的检测分析方面做了不少工作，但对代谢机理及其代谢活性与PBDEs 分子结构的内在关系研究方面还非常缺乏。本课题的特色在于将 PBDEs 的肝脏组织体外模拟代谢研究与三维分子模拟技术相结合，在确定代谢PBDEs的关键酶的基础上，借助计算机技术模拟 PBDEs 分子与酶的相互作用过程，从分子水平上揭示其代谢机理，建立从 PBDEs 的分子结构预测其生物代谢性的三维 QSAR 模型。其创新点体现在实验技术与理论模拟的有机结合阐明有机污染物的生物代谢机制。4.4.年度研究计划及预期研究结果。年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）年度研究计划 年度研究计划 本课题拟用三年时间