ASM诱导大豆对恶性寄生杂草菟丝子的抗性研究.pdf

申请代码：C110408受理部门：收件日期：受理编号：解除保护国家自然科学基金国家自然科学基金申 请 书申 请 书(2 0 0 8版)(2 0 0 8版)资助类别：面上项目亚类说明：附注说明：项目名称：ASM 诱导大豆对恶性寄生杂草菟丝子的抗性研究申 请 者：范志伟电话：089823300557依托单位：中国热带农业科学院通讯地址：海南省儋州市宝岛新村邮政编码：571737单位电话：089823300496电子邮件：申报日期：2008 年 3 月 15 日国家自然科学基金委员会 国家自然科学基金申请书2008 版第 2 页版本 1.003.194基本信息基本信息 zYleU7IM申请者信息申请者信息姓名范志伟性别男出生年月1964 年 10 月民 族汉族学位博士职称副研究员主要研究领域杂草学与植物诱导抗性电话089823300557电子邮件传真089823300557个 人 网 页工 作 单 位中国热带农业科学院/环境与植物保护研究所在研项目批准号依托单位信息依托单位信息名称中国热带农业科学院代 码57173701联系人宋红艳电子邮件电话089823300496网站地址http:/合作合作单位信息单位信息单位名称代码在此录入修改在此录入修改项目基本信息项目基本信息项目名称ASM诱导大豆对恶性寄生杂草菟丝子的抗性研究资助类别面上项目亚 类 说 明附注说明申请代码C110408:杂草防治C1104:植物保护学基地类别预计研究年限2009 年 1 月 2011 年 12 月研究属性应用基础研究申请经费30.0000 万元摘摘要要(限 400 字)：(限 400 字)：大豆是重要的粮食作物和主要的油料、饲料作物。茎寄生恶性杂草-菟丝子对大豆的危害逐年加重，并难以防除，已成为大豆生产的主要生物限制因子之一。植物诱导抗性不仅可以防治作物病虫害，而且也可以控制寄生性杂草。ASM(通用名：acibenzolar-S-methyl，活化脂；化学名称：苯并噻二唑)是一种新型广谱植物抗性诱导剂，能够诱导作物对病、虫、寄生杂草的抗性。本项目通过研究 ASM 对大豆抗性的诱导，提高大豆自身天然免疫力，控制菟丝子的危害，为作物茎寄生杂草的防除提供新途径；同时对其诱导抗性的机制进行生物化学和分子生物学研究，测定诱导抗性化合物，并利用抑制性消减杂交(SSH)技术，构建 ASM 诱导大豆抗性基因差异表达 cDNA 文库，为建立 ASM 诱导大豆抗性的分子生物学打下基础。本项目结合大豆的生产问题，从绿色植保入手，对拓展有害生物综合植保体系具有特别重要的理论和实际意义。关 键 词关 键 词(用分号分开，最多 5 个)植物诱导抗性；大豆菟丝子；ASM；诱导效果、安全性与机理 国家自然科学基金申请书2008 版第 3 页版本 1.003.194项目组主要成员项目组主要成员（注:项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。）编号姓名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间（月）1沈奕德1964-11-20男副研究员学士中国热带农业科学院诱导效果与安全性评价62陆英1976-01-14女助理研究员硕士中国热带农业科学院诱导机理测定63贺春萍1974-2-23女助理研究员硕士中国热带农业科学院诱导机理测定64彭军1978-04-08男助理研究员硕士中国热带农业科学院诱导机理测定65张建华1978-11-25男硕士生学士中国热带农业科学院诱导效果与安全性评价76罗婵娟1983-09-19女硕士生学士中国热带农业科学院诱导机理测定77赵之亭1983-06-28男硕士生学士中国热带农业科学院诱导效果与安全性评价78在此录入修改9在此录入修改总人数高级中级初级博士后博士生硕士生8233说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。国家自然科学基金申请书2008 版第 4 页版本 1.003.194经费申请表经费申请表（金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费一.研究经费23.00001.科研业务费12.0000（1）测试/计算/分析费6.0000效果测定、生化分析和 cDNA 文库构建（2）能源/动力费1.5000水电费（3）会议费/差旅费3.0000国内交流和调研各 3 次（4）出版物/文献/信息传播费1.5000著作、论文发表、文献资料收集和信息交流（5）其它2.实验材料费10.0000（1）原材料/试剂/药品购置费10.0000种子种苗、种植、试剂、药品和样品购置（2）其它3.仪器设备费0.0000（1）购置0.0000（2）试制0.00004.实验室改装费0.00005.协作费1.0000外单位协作测定费二.国际合作与交流费二.国际合作与交流费4.00001.项目组成员出国合作交流2.0000出国合作交流 1 人次2.境外专家来华合作交流2.0000邀请专家 1 人次三.劳务费三.劳务费2.0000研究生 5 人 x 1 万元/年 x 4 年四.管理费四.管理费1.0000按少于 5%计算合计合计30.0000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计其他经费来源合计0.0000 国家自然科学基金申请书2008 版第 5 页版本 1.003.194查看报告正文撰写提纲报告正文报告正文(一)立项依据与研究内容(一)立项依据与研究内容1.项目的立项依据1.项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）大豆(Glycine max)原产于我国，现为世界重要的粮食作物和主要的油料、饲料作物，产量长期居各类油料作物之首。大豆是我国最重要的四大粮食作物之一，各省市自治区均有种植，主产区在东北三省、黄淮海平原以及长江中下游地区。全国 2004 年大豆的播种面积和产量分别为 958.9 万公顷和 1740 万吨，均在美国、巴西和阿根廷之后，居世界第四位1。大豆在生长过程中受许多生物(病虫草害)和非生物(主要是环境)因子的影响，其中茎寄生恶性杂草菟丝子(Cuscuta)分布广，对大豆的危害逐年加重，难以防除，已成为大豆生产的主要生物限制因子之一2。菟丝子是菟丝子科(原旋花科)菟丝子属植物的通称，世界约有 170 种，许多种类被列入检疫杂草名单。我国现有 14 种，均为寄生性杂草，分布于各省市自治区。危害我国大豆的菟丝子主要有 3 种：中国菟丝子(Cuscutachinensis)、南方菟丝子(C.australis)和欧洲菟丝子(C.europaea)，被寄生的大豆植株生长矮小，结荚少，籽粒瘦秕或早期死亡，轻则减产 10-20%，重则 40-80%或颗粒无收3。目前国内外对菟丝子的防治方法主要有人工拔除、轮作换茬与深翻土壤、耐/抗性育种、化学除草剂(地乐胺、乙草胺等)和生物除草剂(鲁保 1 号)处理等方法4，5，但任何单一的防治方法都难以解决菟丝子的危害问题，只有采取综合防治措施。植物诱导抗性是从被保护作物入手，用诱导剂激活作物自身天然免疫系统，提高免疫力，抵抗侵染和胁迫。这种新型植保体系具有广谱性、持效性、无抗药性和环保等优点，越来越受到人们的重视，已成为植保综合防治体系的有效措施之一。传统植保体系主要是从有害生物病虫草入手，大量使用农药，杀灭有害生物。虽然化学农药目前在有害生物防控中起着无可替代的作用，但有害生物不仅难以灭除，还易产生抗药性，天敌减少，造成危害更猖獗，也给生物多样性、环境和人类健康带来严重威胁6。植物抗性诱导剂可以是生物和非生物因子，其本身对有害生物无作用，但能刺激植物生产抗性；或者兼有杀除和诱抗作用(如氟乐灵、乙灵铝等)7。ASM(通用名：国家自然科学基金申请书2008 版第 6 页版本 1.003.194acibenzolar-S-methyl，活化脂；化学名称：苯并噻二唑，BTH)是一种新型植物抗性诱导剂，可以诱导植物产生系统获得抗性(systemic acquired resistance，SAR)，不仅可以防治作物多种病害，而且也可以防治作物寄生杂草。ASM 诱导的作物抗病性自 1995年报道以来，已迅速由实验室推广应用于生产，防治许多作物病害8,9。但 ASM 诱导的作物抗寄生杂草只是于 2002 年由 Sauerborn 等首次报道，他们用 ASM 处理向日葵种子，诱导向日葵抗根寄生杂草向日葵列当(Orobanche cumana)获得成功10。同年，本人师从 Sauerborn 博士、教授，在其实验室攻读博士学位，对 ASM 诱导向日葵抗列当进行系统研究：在温室，从施药浓度、方法(喷叶或灌根)和次数及其结合生防菌(Fusariumoxysporumf.sp.orthoceras)等单一与综合防治方法进行试验研究，取得可喜的结果，为下一步的田间试验和生产应用打下基础；同时，也对 ASM 诱导向日葵抗列当的机制进行初步研究，测定了诱导抗性化合物，确定了 ASM 诱导向日葵抗寄生杂草和抗病的机制相似，都是走 SAR 途径，积累酚类化合物、植保素和抗性相关酶等，但在诱导抗寄生杂草中，没有测到显著积累木质素。这说明 ASM 诱导向日葵抗列当是通过直接产生抗性化合物来抵御寄生，而不是通过组织结构的加固来防御寄生；另外，还筛选出了新的抗寄生杂草诱导剂，为推动诱导抗性防治寄生杂草打下坚实基础11，12，13，14。Gonsior 博士生(导师也是 Sauerborn 博士、教授)等于 2004 年报道了 ASM 诱导烟草(Nicotiana tabacum)与大麻(Cannabis sativa)抗分枝列当(O.ramosa)的效果15。Prez-de-Luque 等(2004)报道了 ASM 诱导豌豆(Pisum sativum)抗锯齿列当(O.crenata)的效果16。这都充分证明诱导抗性可以防治根寄生杂草。但诱导抗性对茎寄生杂草(如菟丝子)的效果如何，还未见报道；而且诱导抗性的机制也只是从生化水平进行研究，未深入到分子水平。大豆具有完善的诱导抗性体系，不论是病原菌，还是创伤、胁迫或诱导剂处理都能诱导大豆产生抗性反应，表达病程相关基因，合成抗性蛋白酶，积累植保素、类黄酮等，抵抗侵染和/或胁迫17，18，19。Dann等(1998)报道，在温室和田间，用ASM对大豆进行喷雾处理，可以诱导大豆抗菌核病(Sclerotinia sclerotiorum),田间的危害率降低20-60%，还增加大豆产量20。Meyer等(2006)报道，在温室，用ASM喷施大豆，可诱导大豆对立枯病的抗性21。Knrzer等(1999)报道，在大豆细胞培养液中加入ASM，可以诱导提高抗坏血酸盐(ascorbate)和谷胱甘肽(glutathione)两种抗氧化剂水平及其相关还原酶活性，并增强大豆对除草剂伤害的抗性22。ASM还能诱导提高大豆根的过氧化物酶及其同工酶的活性23。所以，ASM对大豆具有良好的诱导作用。但ASM诱导大豆抗性，防治寄生杂草 国家自然科学基金申请书2008 版第 7 页版本 1.003.194菟丝子还未见报道。ASM诱导大豆抗性基因差异表达的cDNA文库的构建对阐明ASM诱导大豆抗性分子机制有着至关重要的意义，也为进一步的基因克隆和功能分析打下基础。抑制性消减杂交(SSH)技术作为一种较为有效的分离差异表达基因的方法，已经在植物抗病性机理研究上被广泛应用，并取得了较好的进展24。饶志明等(2004)利用差异显示技术获得ASM诱导水稻抗稻瘟病的cDNA片段，并对其进行分析和定位25。Jansen等(2005)利用SSH技术鉴定了大麦白粉病和ASM诱导的基因cDNA片段26。在大豆研究方面，Liao等(2003)利用SSH技术，分离鉴定了大豆盐胁迫基因GmPAP3，并对其功能和表达进行了初步分析27。刘春燕等(2005)利用SSH技术，构建了大豆花叶病毒诱导表达的cDNA文库，并对其进行初步分析28。这些都是对大豆抗性品种的抗性基因进行分离和分析，而对大豆敏感品种的ASM诱抗基因的研究还未见有报道。敏感品种的诱导抗性比抗性品种的选育，相对说来要简易和快速，而且诱导的抗性具有广谱性。本研究项目瞄准世界前沿，结合我国重要的粮食和主要的油料作物大豆的生产问题，从绿色植保入手，诱导大豆对恶性寄生杂草菟丝子的抗性，控制菟丝子对我国大豆的危害，提高大豆产量，为作物茎寄生杂草防治开辟一条新途经；同时，也从生物化学和分子生物学水平阐明其诱导抗性机制，构建ASM诱抗基因差异表达cDNA文库，为ASM诱导大豆抗性的分子生物学建立和进一步的基因克隆与功能分析打下基础。本研究项目在理论和实践方面都具有特别重要的意义。参考文献参考文献1 中国农业年鉴编辑委员会.中国农业年鉴 2005.中国农业出版社,2005:182,480-4822 钱希,徐芝华.大豆菟丝子的发生为害及化学防除研究.杂草科学,1996,(2):32-353 李扬汉主编.中国杂草志.中国农业出版社,1998:481-4894 史殿军,崔良刚,程义美,林峰.大豆田菟丝子的防治.吉林农业,2004,(11):205 周建明.美国对菟丝子的研究与防治.国外畜牧学草原与牧草,1995,(2):9-116 Edreva A.A novel strategy for plant protection:Induced resistance.Journal of Celland Molecular Biology,2004,3(2):61-697 林丽,张春宇,李楠,范海延.植物抗病诱导剂的研究进展.安徽农业科学,2006,34(22):5912-59148 范志金,刘秀峰,刘凤丽,鲍丽丽,张永刚.植物抗病激活剂诱导植物抗病性的研究进展.植物保护学报,2005,32(1):88-899 Vallad G.E.,R.M.Goodman.Systemic Acquired Resistance and Induced SystemicResistance in Conventional Agriculture.Crop Science,2004,44:1920-193410 Sauerborn J,H Buschmann,K Ghiasvand Ghiasi,K.-H.Kogel.Benzothiazole activates 国家自然科学基金申请书2008 版第 8 页版本 1.003.194resistance in sunflower(Helianthus annuus)to the root-parasitic weedOrobanche cumana.Phytopathology,2002,92(1):59-6411 Fan Z.-W.(范志伟)Induced resistance and its combination with a biocontrol fungusto protect sunflower(Helianthus annuusL.)against the root parasitic weedOrobanchecumanaWallr.Verlag Grauer,Beuren,Stuttgart,Germany,2005:112pp12 Buschmann H.,Z.-W.Fan(范志伟),J.Sauerborn.Effect of resistance inducing agentson sunflower(Helianthus annuusL.)and its infestation with the parasitic weedOrobanchecumanaWallr.Journal of Plant Diseases and Protection,2005,112:386-39713 Fan Z.-W.(范志伟),H.Buschmann,J.Sauerborn.Prohexadione-calcium inducessunflower(Helianthus annuus)resistance against the root parasitic weedOrobanche cumana.Weed Research,2007 47(1):34-4314 Fan Z.-W.(范志伟),H.Buschmann,J.Sauerborn.Main effects and interactions amongacibenzolar-S-methyl,a biocontrol fungus and sunflower cultivar on control ofOrobanchecumanaWallr.Journal of Plant Diseases and Protection,2007,114(2)(in press)15 Gonsior G.,H.Buschmann,O.Spring,J.Sauerborn.Induced resistance an innovativeapproach to manage branched broomrape(Orobanche ramose)in hemp and tobacco.Weed Science,2004,52:1050-105316 Prez-de-Luque A,J.V.Jorrn,D.Rubiales.Crenate broomrape control in pea by foliarapplication of benzothiadiazole(BTH).Phytoparasitica,2004,32(1):21-2917 张淑珍,徐鹏飞,韩英鹏,张大勇,李文滨.大豆疫霉菌毒素处理大豆品种后几丁质酶活性的变化.作物杂志,2006，(3):17-1918 Graham M.Y.,J.Weidner,K.Wheeler,M.J.Pelow,T.L.Graham.Induced expression ofpathogenesis-related protein genes in soybean by wounding and thePhytophthora sojaecellwall glucan elicitor.Physiological and Molecular Plant Pathology,2003,63:14114919 Shen H.,L.F.He,T.Sasaki,Y.Yamamoto,S.J.Zheng,A.Ligaba,X.L.Yan,S.J.Ahn,M.Yamaguchi,S.Hideo,.H.Matsumoto.Citrate secretion coupled with the modulationof soybean root tip under aluminum stress.Plant Physiology,2005,138:28729620 Dann E,B Diers,J.Byrum:Effect of treating soybean with 2,6-dichloroisonicotinicacid(INA)and benzothiadiazole(BTH)on seed yields and the level of disease caused bySclerotinia sclerotiorumin field and greenhouse studies.European Journal of PlantPathology,1998，104:271-27821 Meyer M.C.,C.J.Bueno,N.L.de Souza,J.T.Yorinori.Effect of doses of fungicidesand plant resistance activators on the control of Rhizoctonia foliar blight of soybean,and onRhizoctonia solaniAG1IA in vitro development.Crop Protection,2006,25(8):848-85422 Knrzer O.C.,B.Lederer,J.Durner,P.Bger：Antioxidative defense activation insoybean cells.Physiologia Plantarum，1999,107(3),29430223 Hoffmann L.V.,M.T.V.Carvalho,E.J.B.Nogueira Cardoso.Differential expressionof peroxidase isoenzymes in soybean roots treated with the benzothiadiazole.BiologiaPlantarum，2003,46(3),451-45324 黄鑫,戴思兰,孟丽,郑国生.抑制性差减杂交(SSH)技术在分离植物差异表达基因中的应用.分子植物育种，2006，4(5):735-74625 饶志明,董海涛,庄杰云,柴荣耀,李德葆,郑康乐.BTH 诱导水稻对稻瘟病系统获得抗性的 mRNA差别显示分析.无锡轻工大学学报,2004,23(1):25-29 国家自然科学基金申请书2008 版第 9 页版本 1.003.19426 Jansen C.,M.Korell,C.Eckey,D.Biedenkopf,K.-H.Kogel.Identification andtranscriptional analysis of powdery mildew-induced barley genes.Plant Science,2005,168:37338027 Liao H.,F.-L.Wong,T.-H.Phang,M.-Y.Cheung,W.-Y.F.Li,G.H.Shao,X.L.Yan,H.-M.Lam.GmPAP3,a novel purple acid phosphatase-like gene in soybean induced by NaClstress but not phosphorus deficiency.Gene,2003,(318):103-11128 刘春燕,王伟权,陈庆山,杨翠平,李文滨,辛大伟,金振国,宋英博.大豆花叶病毒诱导的消减文库构建及初步分析.生物工程学报,2005,21(2):320-3222.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题（此部分为重点阐述内容）研究内容：研究内容：(1)ASM 诱导大豆抗性防治菟丝子的效果 从施药浓度、方法(喷施或灌根)和次数(1-3 次)入手，用 ASM 处理大豆，用清水处理作对照，然后等量接种(种子或茎)菟丝子，观测防治效果；防治效果(%)=对照大豆上菟丝子的鲜重(干重)处理大豆上菟丝子的鲜重(干重)100/对照大豆上菟丝子的鲜重(干重)(2)ASM 对菟丝子种子萌发和侵染力的影响 用 ASM 处理菟丝子种子，用清水处理作对照，然后观测种子萌发率；用 ASM 处理菟丝子茎段，清水处理为对照，然后接种侵染大豆，观测菟丝子对大豆的侵染力和生物量；萌发率(%)=萌发种子数 100/种子总数；侵染力用强、中、弱表示：强 侵染快，生长迅速；中 可以侵染，生长发育正常；弱 可以侵染，但生长发育不正常或不能侵染；生物量用鲜重或干重表示。(3)ASM 诱导大豆抗性化合物的分析测定 用 ASM 处理大豆，清水处理为对照，不同时间采集叶片分析测定酚类化合物、木质素、黄酮类、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质酶的变化动态；酚类化合物 可溶性酚用甲醇提取，不可溶性酚用 NaOH 皂化，Folin 试剂法比色测定；木质素 用巯基乙酸反应，紫外分光光度计测定；黄酮类 甲醇提取，紫外分光光度计测定；过氧化物酶 用愈创木醇法测定酶活性；苯丙氨酸解氨酶 用硼酸缓冲液提取，L-苯丙氨酸反应，测定酶活性；几丁质总酶 用柠檬酸缓冲液提取，壳聚糖和醋酸钠缓冲液处理，在磷酸缓冲液和蜗牛酶反应，测定总酶活性；(4)ASM 诱导大豆抗性基因差异表达的 cDNA 文库构建 以 ASM 处理大豆为试验组(tester)，对照大豆为驱动组(driver)，用抑制性消减杂交法构建 ASM 诱导的大豆抗性基因 cDNA 文库。国家自然科学基金申请书2008 版第 10 页版本 1.003.194研究目标：研究目标：从实践应用和理论着手，诱导大豆抗性防治菟丝子，并从生物化学和分子生物学水平阐明其机制，为作物茎寄生杂草防除提供新途径，为 ASM 诱导抗性基因的分子生物学建立和进一步的基因克隆与功能分析打下基础。拟解决的关键问题：拟解决的关键问题：大豆菟丝子接种侵染问题 大豆菟丝子种子的萌发时间和量可能不一致，造成侵染大豆的量不同，给施药和诱导效果评估带来困难。我们拟采取的措施是：菟丝子种子预萌发，用大豆根浸出液诱发；用菟丝子茎段等量接种。ASM 诱导大豆抗性的植保素检测 如果单用紫外分光光度计难以检测,则采用紫外分光光度计和高效液相色谱联合检测。cDNA 酶 切 后 的 连 接 效 率用 特 异 引 物 鉴 定，引 物 序 列 为：F：CTTCGCCGCTTCCTTCAAC；R：GAGTCCCGTGGCAGCAGAG3.拟采取的研究方案及可行性分析3.拟采取的研究方案及可行性分析（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）研究方案：研究方案：(1)以杂草科学的研究方法评价 ASM 诱导大豆抗菟丝子的效果，用菟丝子种子或茎段接种侵染，技术路线如下：试验一：盆栽大豆(含菟丝子种子)菟丝子萌发侵染前，用 ASM 处理大豆 评价效果；盆栽大豆(含菟丝子种子)菟丝子萌发侵染前，用清水处理大豆 对照；盆栽大豆(无菟丝子种子)用清水处理大豆 空白对照；试验二：盆栽大豆 菟丝子茎段接种，在侵染前，用 ASM 处理大豆 评价效果；盆栽大豆 菟丝子茎段接种，在侵染前，用清水处理大豆 对照；盆栽大豆 用清水处理大豆 空白对照；(2)ASM 诱导大豆抗性化合物的分析测定采用成熟的生化实验技术，其中一些技术有所改进，技术线路如下：可溶性和不可溶性酚与木质素提取：大豆叶样(ASM 处理或对照)液氮研磨 甲醇提取可溶性酚 沉淀物 1 NaOH 皂化提取不可溶性酚 沉淀物 2 蒸馏水洗 2次和甲醇洗 1 次 沉淀物 2 干燥秤重 巯基乙酸和 HCL 热水浴 沉淀物 3 加 NaOH摇动提取木质素；可溶性和不可溶性酚测定：酚提取液 Folin 试剂、Na2CO3和蒸溜水 在 725nm比色测定；国家自然科学基金申请书2008 版第 11 页版本 1.003.194木质素测定：在 280nm 比色测定。黄酮类提取与测定：大豆叶样(ASM 处理或对照)液氮研磨 甲醇提取液 三氯乙酸、浓盐酸和 ZnCl2 在 390nm 比色测定。苯丙氨酸解氨酶提取与测定：大豆叶样(ASM 处理或对照)液氮研磨 硼酸缓冲液提取酶液 L-苯丙氨酸反应 在 290 测定。几丁质总酶提取与测定：大豆叶样(ASM 处理或对照)液氮研磨 用柠檬酸缓冲液提取酶液 壳聚糖和醋酸钠缓冲液处理，在磷酸缓冲液和蜗牛酶反应 在 530nm测定总酶活性。(3)构建 ASM 诱导的大豆抗性基因 cDNA 文库，用抑制性消减杂交法构建差异表达的 cDNA 文库，是在转录水平上研究基因表达的技术,具有稳定、高效、可靠等特点，技术路线如下：第一次消减杂交：以 ASM 处理大豆为试验组(tester)，对照大豆为驱动组(driver)，提取总 RNA，分离纯化 mRNA，反转录为 cDNA，分别用同一种识别四碱基序列的限制酶(如 Rsa)消化 cDNA，以产生大小适当的平头末端 cDNA 片段；将 tester cDNA分成均等的两份，分别接上接头 1(Adapter1)和接头 2R(Adapter2R)，接头是由一长链和一短链组成的一端是平端的双链 DNA 片段。然后分别与过量的 driver cDNA 变性后退火杂交。第二次差减杂交：合并两份杂交产物，再加上新的变性的 driver 单链，再次退火杂交。第一次 PCR：先用 DNA 聚合酶将 cDNA 链上的接头上的粘性末端补齐，然后加入根据接头长链序列设计的外侧引物 P1、P2，进行 PCR 扩增。第二次 PCR：取第一次 PCR 扩增的产物稀释后，加入根据接头长链序列设计的内侧引物 PN1、PN2，进行巢式 PCR，进一步扩增具有差别表达的序列，增强其特异性扩增。所得到的 PCR 产物可直接与克隆载体的 T/A 位点相连，并转化入大肠杆菌，从而完成抑制性差减文库的构建。可行性分析：可行性分析：(1)申请者在德国攻读博士学位其间，从事诱导抗性防治根寄生杂草研究，做了大量试验，收集了许多相关资料，从理论与实践方面都积累了丰富经验；(2)在国内收集了大豆对菟丝子敏感品种 4 份、抗性品种 6 份，大豆菟丝子 3 种，为研究工作打下基础；(3)本项目涉及的杂草学和诱导抗性的生物化学与分子生物学的研究方法和手段都很成熟，有些还进行了改进，如菟丝子茎段接种侵染技术；(4)ASM 是目前应用广泛的诱导抗性剂，对许多作物(单子叶和双子叶)的多种病害、根寄生杂草都有诱导抗性作用；大豆具有良好的诱导抗性体系，易诱导产生酚类化合物、植保素、酶等抗性物质。所以，用大豆-菟丝子模式研究 ASM 的诱导抗性，是确实可行；(5)本研究室实验室和所公共实验室已具备实验需要条件：有温室和植物气候培养 国家自然科学基金申请书2008 版第 12 页版本 1.003.194箱供盆栽试验，植物生理生化实验室供抗性化合物的提取测定，分子生物学实验室供cDNA 文库构建；(6)项目组成员有长期从事杂草科学研究的，也有长期从事分子生物学和分子植物病理学的；有高、中级研究人员，也有博士、硕士、学士和研究生，搭配合理，可确保项目的顺利完成。4.本项目的特色与创新之处4.本项目的特色与创新之处首次应用诱导抗性防治茎寄生杂草，建立大豆菟丝子防治新体系；首次构建 ASM 诱导大豆抗性基因差异表达 cDNA 文库，建立 ASM 诱导大豆抗性机制的分子生物学基础。5.年度研究计划及预期研究结果5.年度研究计划及预期研究结果年度研究计划：年度研究计划：2009 年度：完成 ASM 诱导大豆抗性防治菟丝子的效果和 ASM 对菟丝子种子萌发和侵染力的影响测定；2010 年度：完成 ASM 诱导大豆抗性化合物的分析测定和抑制消减杂交，获得第二次PCR 产物；2011 年度：完成 ASM 诱导大豆抗性基因差异表达的 cDNA 文库构建。其间拟组织交流会 1 次，参加国际或国内交流会 2-3 次，竭力促成与德国霍恩海姆大学(University of Hohenheim)的 Sauerborn 博士、教授实验室的合作与交流。预期研究结果：预期研究结果：建立诱导抗性防治茎寄生杂草的理论和技术体系，解决生产问题；构建 cDNA 文库；可望获得专利或成果 1-2 项；发表 SCI 论文 1-2 篇，国内核心刊物论文 2-3 篇；培养青年技术骨干 3 名，研究生 3-5 名。(二)研究基础与工作条件(二)研究基础与工作条件1.1.工作基础工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）在杂草科学方面：本杂草研究室自 1956 年以来，长期从事杂草科学的研究工作，在橡胶等热带作物种植园杂草生物生态与防治的研究中取得显著成绩，获国家发明专利1 项，国家、部省级科技进步奖 8 项，发表专著、编著 10 多部，发表论文 100 多篇；特别是在橡胶树桑寄生的研究中积累了丰富资源，为本项目的研究可提供大量借鉴经验。国家自然科学基金申请书2008 版第 13 页版本 1.003.194在植物诱导抗性方面：申请者于 2002 年至 2005 年其间，在德国霍恩海姆大学(University of Hohenheim)攻读博士学位，师从植物对寄生植物诱导抗性奠基人Sauerborn 博士、教授，以植物诱导抗性为研究方向，对 ASM 诱导向日葵抗根寄生杂草进行深入系统研究，并筛选出新诱导剂调环酸，取得可喜的结果，填补了植物对植物抗性的多项空白，发表了博士论文专著和 3 篇 SCI 学术论文，获得了博士学位，为进一步的研究工作奠定了坚实的基础。从 2006 年起，申请者带领研究组成员进行了 ASM 诱导橡胶树、芒果和番木瓜等的抗性研究，并取得初步结果。在分子植物病理学和分子生物学方面：研究组成员进行了有关基因克隆、转化和 DNA的提取、分离等分子生物学研究工作，并形成了独特的研究方法，为本项目的研究打下坚实基础。2.2.工作条件工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况。）本杂草研究室从事杂草科学研究工作逾 50 年，积累了丰厚的资源，现有科研人员 5名(高级职称 2 名，中级职称 3 名；博士 1 名，硕士 3 名，学士 1 名)，研究生 3 名，建立了完备的杂草学实验条件和设施；本研究所也建立了公共开放实验室和分子生物学实验室，项目所需的仪器设备完全具备，如超速低温离心机、电泳仪、PCR 仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、高效液相色谱仪等。3.3.申请人简历申请人简历（包括申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务。论著目录要求详细列出所有作者、论著题目、期刊名或出版社名、年、卷（期）、起止页码等；奖励情况也须详细列出全部受奖人员、奖励名称等级、授奖年等）范志伟范志伟，男，博士，博导，副研究员(聘研究员)，1986 年获华南热带农业大学植保专业农学学士学位，2002 年获德国哥庭根大学(University of Goettingen)农学硕士学位，2005 年获德国霍恩海姆大学(University of Hohenheim)农学博士学位；自 1986年至今一直在现单位从事杂草科学和植物诱导抗性的研究工作，其间 1999 年至 2005 年获德国学术交流中心(DAAD)奖学金资助，由单位公派赴德国留学，获博士学位；先后主持或参加部省级重点项目、省自然科学基金项目、德国 DFG 和 DBU 项目等 10 多项；获国家发明专利 1 项，部省级科技进步奖 3 项，发表专著、编著 6 部，发表论文 60 篇(其中 SCI 论文 3 篇)。现主持教育部留学回国人员科研启动基金和本院科技基金项目“橡胶树等热带作物诱导抗性的研究”等多项项目。相关编著/论著目录：相关编著/论著目录：Fan Zh.-W.2005.Induced resistance and its combination with a biocontrol fungus to protectsunflower(Helianthus annuus L.)against the root parasitic weed Orobanche cumana Wallr.VerlagGrauer,Beuren,Germany.112 pages.(ISBN 3-86186-495-9)朱朝华,范志伟范志伟,杨叶,编著.热带农田杂草生态与管理.中国农业大学出版社,2007相关论文目录：相关论文目录：Fan Zh.-W.,H.Buschmann,J.Sauerborn.2007.Prohexadione-calcium induces sunflower(Helianthus annuus)resistance against the root parasitic weed Orobanche cumana.WeedResearch 47(1):34-43(2006:IF 1.705;7/49 Agronomy;41/147 Pl