脑功能的动态平衡调控 (2).doc

项目名称： 脑功能的动态平衡调控 首席科学家： 陈军 中国人民解放军第四军医大学 起止年限： 2006.1至2010.12 依托部门： 总后勤部卫生部 一、研究内容 总体研究内容 脑功能稳态是确保人类正常生命活动的首要基础，它是中枢神经系统在基因与细胞表面分子和胞内信号分子网络、突触网络、神经回路网络及脑各个系统网络等多个层次上对身体内外环境瞬息万变的复杂信息进行动态反馈调节，达到兴奋与抑制的可塑性稳态过程。该过程反映了脑是高度进化的产物，涉及基因与分子网络的稳态，神经元、神经胶质细胞与突触可塑性的稳态，神经回路的稳态，脑可塑性稳态等四个层面复杂的信息处理和精确的神经分析计算过程，任何水平上的错误信息处理和计算都可能导致这个平衡系统的失调和紊乱，因此在21世纪人类社会活动高度频繁和经济社会高度精神与躯体负担压力下，脑具有极强的功能失调易感性，造成人类疾病谱的排行首榜向神经与精神疾病转化，结果导致人的工作能力丧失、生活质量下降，给社会和家庭造成极大的经济和精神负担，恶化人类社会环境。脑功能紊乱与疾病（如慢性疼痛、药物成瘾、癫痫、精神分裂症、睡眠障碍、痴呆和脑高级功能障碍等）不仅是脑本身的健康问题，还会导致身体其它系统的疾病（如癌症、心血管疾病、胃溃疡和胃功能异常、内分泌紊乱和脑源性代谢病-糖尿病等）。系统深入地研究“脑功能的动态平衡调控”细胞分子机理将有助于在多个层次上理解脑功能，并为防治功能性脑疾病提供策略和方法，因此本项目具有重要的科学和社会意义，是国家重要的科学前沿问题。本项目将紧紧围绕“脑功能的动态平衡调控”这个关键的科学问题，在基因与分子网络的稳态，神经元、神经胶质细胞与突触可塑性的稳态，神经回路的稳态，脑可塑性稳态与行为等四个层面上，针对（1）电压门控离子通道的调控；（2）细胞分泌与内吞的调控机理；（3）抑制性突触及其可塑性；（4）神经信号的精确分析计算的机理；（5）视网膜神经回路的信息处理；（6）果蝇长时记忆的分子机理；（7）猴长时记忆的集群神经元编码；（8）应激行为与神经可塑性稳态等8个研究课题深入开展研究。 （1） 电压门控离子通道的调控：研究电压门控通道在神经细胞内外离子稳态、信号产生、信号传导、时序编码和调控上的功能特点具有重要的生物学意义。该课题拟采用电生理细胞外记录、膜片钳记录和爪蟾卵母细胞双电极记录，分子生物学新型离子通道的克隆与表达、基因修饰、杂合体构建，神经药理学－神经递质动态微透析检测、分子成像、相关神经毒素与离体膜离子通道标记结合、生物大分子相互作用实时检测，色谱分离纯化与鉴定，动物行为学以及免疫组化形态学等综合技术手段，并结合若干国产资源特异性钠或钾离子通道配体/调制剂，构建新型BmNa及其相关钠离子通道亚型以及BKca钾离子通道分子模板等，全面系统地研究电压门控钠离子通道和相关钾离子通道参与脑稳态神经信号处理过程的分子细胞调控机制、网络关联通径及其信息整合特征。在离子通道的突变与演化关联，相关离子通道/受体与特异性配体/调制剂相互识别结合的敏感度和靶位点的定位与突变等若干重大理论问题的探讨中，推进认同国产资源相关特异性离子通道/受体配体/调制剂的实际应用价值，增进了解电压门控通道在神经细胞内外离子稳态、信号产生、信号传导、时序编码和调控上的功能特点。同时注意研究非电压敏感性Na+通道和非选择性阳离子通道的结构与功能。 （2） 细胞分泌与内吞的调控机理：通过研究神经细胞离子通道、动作电位和细胞分泌(胞吞)的因果关系，揭示神经动作电位及其编码的分子机理，动作电位编码的信息内涵，及其编码与对神经递质分泌和心肌靶细胞调控的分子机制。因而这项研究有益于揭示神经信息传递及其神经对心脏调控的细胞机制。重点研究：1）影响动作电位编码的离子通道机制，重点研究钙离子通道、钠离子通道和K通道、SK通道以及配体门控的N型AChR通道和HCN起搏离子通道对单个动作电位和动作电位编码的影响；2）影响神经递质分泌的动作电位机制。研究不同动作电位编码对分泌的调控；3）研究DRG神经元上动作电位诱导的钙离子非依赖的细胞分泌CIVDS的分子机理。试图揭示电压直接诱导分泌的关键分子及其作用原理；4）电位编码对神经递质及其心脏靶子的调控。 （3） 抑制性突触及其可塑性：在注重观察兴奋性突触传递的同时，应该更加注重研究抑制性突触传递的问题，突触的稳态一定是兴奋和抑制相互作用的结果。该课题将以GABA能和甘氨酸能抑制性突触为对象，应用膜片钳电生理学、免疫组织化学和Western blot、神经细胞培养、Ca2＋成像、转基因小鼠等技术，在突触前递质释放（GABA和甘氨酸）、递质重摄取（GABA转运体GAT1）和突触后受体（GABAA和甘氨酸受体）以及Cl-稳态（KCC2）调节等不同层面上，研究抑制性突触及其可塑性在中枢神经信息处理中的作用，以及某些疾病（如脑缺血、癫痫、疼痛和药物成瘾等）条件下抑制性突触脱抑制对神经信息处理的影响，以期阐明抑制性突触可塑性的机理以及抑制性突触与正常细胞活动和细胞功能的病理性改变的关系，并为临床上进行药物干预和治疗提供分子靶点和药理信息。 （4） 神经信号的精确分析计算的机理：为了进一步澄清神经细胞突触动力学和神经信号精确分析计算过程的分子机理、及其在脑高级功能的程序编码中之作用，本项目将结合多学科的原理和技术（行为学、电生理学、细胞影像学、分子生物学和数学物理建模），重点分析脑功能、神经网络和神经细胞突触动力学、信号精确分析计算过程与特定分子的相关性。值得强调的是，在研究神经信号精确分析计算过程的细胞分子基础中，我们将以哺乳动物学习记忆细胞模型和视觉细胞动力学的研究为突破口。科学问题：1）探索与学习记忆行为相关的神经细胞和突触活动的动力学以及神经信号的精确分析计算过程，阐明其细胞学基础。2）利用分子生物学技术（转基因动物和siRNA基因沉默技术），分析鉴定与复杂行为、神经细胞和突触信号的分析计算过程相关的分子，阐明脑高级功能的分子机理。3）利用转基因动物的病理模型研究神经信号错误计算编码与脑功能疾病的分子机理。4）在研究脑功能相关信号的精确分析计算过程和脑疾病神经信号错误编码的细胞分子机理的基础上，研发并筛选增强脑高级功能和防治功能性脑疾病的中西药化合物。 （5） 视网膜神经回路的信息处理： 应用免疫组化、共聚焦显微镜、细胞内记录、膜片钳记录、Ca2＋成像等技术，在不同层次标本上(灌流视网膜铺片、视网膜薄片、单个分离视网膜细胞、细胞膜片)，研究双极细胞和神经节细胞的信息处理中具有重要意义的关键问题。从而对视网膜信号传递直通线上的两个关键神经元的活动的机制形成创新的理论认识。具体研究目标：1）确定视锥细胞终末的GABA受体如何介导水平细胞向视锥的反馈，进而调制双极细胞的活动；2）确定甘氨酸如何参与不同型双极细胞感受野的中心和周围反应；3）确定钠尿肽、褪黑激素对双极细胞、神经节细胞的调制及其机制；4）对Müller细胞如何通过谷氨酸、GABA转运体对递质的摄取和逆向释放以及由Ca2+通道介导，对双极细胞、神经节细胞活动的调制及其机制形成较深入的认识。 （6） 果蝇长时记忆的分子机理：通过综合运用遗传筛选、行为检测、免疫组化、电生理、基因芯片、RNA干扰等研究手段，确定几个Notch信号通路中参与长时程记忆形成的关键基因。在果蝇的长时程记忆形成过程中，将Notch过量表达后可易化果蝇长时记忆的形成；而将其突变后，可以抑制长时程记忆的形成。这说明Notch确实参与了果蝇学习记忆的过程。然而Notch在学习和记忆中的信号通路究竟是什么？Notch在发育过程中的信号通路是不是它在学习和记忆中的信号通路？目前，关于这一方面的认识还不是很完善。因此，我们将继续解决：1）通过对已知的突变体及筛选出来的突变体进行行为，生理，生化，免疫，分子，遗传学研究，从而确定哪一类Notch配体参与了长时程记忆的形成；2）通过对已知的突变体进行行为学分析，结合基因芯片分析受行为影响及Notch调控的基因，确定参与长时程记忆形成的Notch下游的候选基因；3）用免疫组织化学方法，确定Notch信号通路在突触结构可塑性中的作用。从而，验证我们所提出的假设：长时程记忆的形成也包含调控神经突触结构可塑性的Notch信号通路，最终揭示长时程记忆形成的分子细胞机理 （7） 猴长时记忆的集群神经元编码：大脑皮层相关区域的集群神经元是如何动态地组织起来，以实现记忆获得、巩固、储存和读取，是本课题拟解决的关键科学问题。多通道神经元放电慢性记录技术的成熟和应用，为回答这一关键科学问题奠定了基础。主要研究内容：以条件性场景或声音恐惧记忆、慢性病理性疼痛记忆、空间和物体记忆为切入点，研究大脑皮层相关区域（前扣带回、前额叶背外侧部和颞下回）集群神经元在长时记忆获得、巩固、储存和读取过程中的动态活动模式。 （8） 应激行为与神经可塑性稳态：注重比较急性应激因素与慢性应激因素对脑功能的动态平衡调控的影响效果，以往的研究大多偏重于急性应激，如大鼠足底电刺激、高台恐怖刺激、吗啡成瘾后加高台恐怖刺激等，但是缺乏如在持续几天至几个月的慢性病理性痛刺激（外周组织或神经损伤性痛）、慢性病理性痛刺激加精神恐怖刺激对动物负性习得性记忆行为（如条件位置回避性行为、条件位置偏爱性行为）和动物正性习得性记忆行为（如水迷宫实验）的效果有何差异？比较大脑皮层若干个与感觉认知和情绪相关脑区（大脑皮层SI区、SII区、岛叶、扣带回、海马、杏仁核）的神经可塑性稳态问题的研究，特别在应激条件下找出可以引起LTP或LTD改变的因素，及其脑区之间的相互影响。该课题拟分为两个独立课题内容，一方面（由徐 林负责）以精神应激（如恐惧条件反射、强迫游泳抑郁症、焦虑等）因素诱导的动物模型为主，采用诸如在体电生理技术、fMRI技术、膜片钳全细胞记录技术等探讨精神因素应激是否兴奋某一些脑区（如海马）而抑制另一些脑区（如杏仁核），应激是否导致海马依赖的记忆损伤或记忆提取损伤？这种效应是否是长时程的？研究精神应激是否导致习得性LTP？为寻找应激导致精神分裂症假说提供新证据。另一方面（由陈 军负责）以躯体应激（如外周组织或神经损伤造成的持续、慢性痛刺激）因素的动物模型为主，采用行为学（如条件位置回避性行为、条件位置偏爱性行为、水迷宫等）、在体麻醉动物场电位或胞外记录技术、离体脑-脊髓薄片单细胞胞外/全细胞膜片钳记录技术、离体脑-脊髓薄片微电极阵列（8x8 MED64道）技术和分子细胞生物学技术，研究：1）急慢性躯体应激因素是否引起诸如大脑皮层SI区、SII区、岛叶、扣带回、海马和杏仁核等脑核团发生细胞内在兴奋性或突触可塑性改变（LTP/LTD），如果有其细胞分子机制是什么？比较研究脊髓和上述大脑皮质对躯体应激因素反应的异同，探讨药物治疗的新分子靶点和策略。2）大脑皮层SI区、SII区、岛叶、扣带回、海马和杏仁核等脑核团的稳态或稳态失调对动物慢性身体应激造成的行为改变，脊髓感觉与运动的作用方式是否有调控作用？最终是比较精神应激和躯体应激对脑结构和功能可塑性影响是否一致。 分课题研究内容 （一）电压门控离子通道的调控： 1. 新型BmNa电压门控钠离子通道的完整基因编码及其功能特征 1.1. 选用节肢动物蝎神经索标本，克隆其钠离子通道基因(BmNa)，解读其完整的基因图谱编码特征。 1.2. 构建BmNa的完整嵌合体质粒以及在爪蟾卵母细胞中的有效表达体系及其双电极记录技术平台 1.3. 解析BmNa在钠离子通道蛋白家族中结构与功能的共性与独特个性，验证位点3和位点4重要区域的片段组合和关键性残基的定位及其相应定点突变体的活性功能存留或丧失。 拟解决的关键问题：从基因水平阐明在电压门控钠离子通道(VGSC)家族中为何节肢动物蝎神经元钠离子通道缺乏对自身分泌的靶位点3和靶位点4毒素敏感性的分子点突变和/或微结构域构像改变的根因。 2. VGSC药理基因组学 2.1. 以BmNa为分子模板构建系列基因突变体，同时相应地构建相关已知电压门控钠离子通道亚型(如rBNa2和Na-4等)的克隆通道基因库及其功能鉴定体系，并不失时机的不断扩充相关电压门控钠离子通道亚型的品种数量。 2.2. 记录并参照分析各BmNa基因突变体以及相关已知电压门控钠离子通道亚型表达产物的电生理活动特征，鉴别行使通道活化和失活化调控功能的分子区域与单元构件，不同亚型各靶受体位点的基因编码保守性与变异度及其对特异性毒素或药物的敏感性与结合亲和力。 2.3. 研究相关VGSC亚型在不同组织细胞和亚细胞膜上的特异分布与表达，以及BmNa基因突变体可能导致的整体动物病理行为学和在/离体细胞组织形态学表征。 2.4. 借助生物信息学的概念与技巧，探讨VGSC蛋白家族的古老基因分子及其可能的起源，个体成员天然突变与相互间演化的途径模式和规律。 拟解决的关键问题：将钠离子通道参与细胞分子网络和神经信号处理过程的研究推进到其蛋白家族药理基因组学的深度认识与解密。 3. VGSC介导生理和病理性痛觉传入与癫痫的细胞和分子机制及其信息处理途径 3.1. 运用各种化学刺激物(如角叉菜胶或福尔马林等)和相关钠离子通道调制剂构建各种急/慢性病理痛觉传入与癫痫动物模型，并验证其各项动物行为学特征指标。 3.2. 分别记录相关特异性VGSC调制剂(BmK I, BmK IT2和BmK AS等) 对外周传入纤维（Aβ、Ad、C纤维）的电生理特性。运用全细胞膜片钳技术以及急性分离或培养的背根神经元细胞标本，鉴定各类钠通道调制剂对河豚毒素敏感 (TTX－S) 和河豚毒素不敏感 (TTX－R)钠电流的选择调制作用。分别采用微透析技术和免疫组化方法检测不同钠通道调制剂经周边或鞘内给药诱导脊髓背角或周边氨基酸及单胺类神经递质释放以及早信号基因和蛋白表达量的动态时空变化。另利用BIAcore系统，观察相关钠通道调制剂与大鼠坐骨神经轴突膜的药理结合特征。 3.3. 针对性地选择运用不同受体的抗体或激动剂与拮抗剂，观察检测正常或病理动物模型TTX-S 和TTX-R钠通道，相关受体及胞内第二信使，外周化学感受器蛋白以及配体门控受体的可塑性表达与特异组织分布时空变化，同时检验P物质和阿片类等内源性物质的可能参予因素。 拟解决的关键问题：阐明VGSC介导生理和病理性痛觉传入与癫痫的调控方式，诱发的病理性痛觉传入和癫痫类型及其整体动物行为学综合效应特征，被涉及到的通道亚型及其细胞与分子机制和网络途径。 4. Martentoxin调制BKca钾离子通道的细胞与分子机制 Martentoxin是由本实验室发现并已获知识发明专利的一个独特国产资源天然钾离子通道阻断剂。 4.1. 运用已程序化的色谱技术，分离纯化天然Martentoxin。另探索利用基因克隆工程的途径解决martentoxin的需求困扰。 4.2. 从离体神经元组织(例如脑海马细胞组织)，培养的细胞株以及特异克隆表达BKca通道的宿主细胞等不同层次上全面细致地研究Martentoxin阻遏BKca钾离子通道电生理活动的细胞与分子机制，包括其阻遏方式，调控靶通道的药理动力学特征，对BKca通道亚型及其他类型钾离子通道的选择性，BKca通道亚型的组织细胞分布及其生理调控功能特征等。 拟解决的关键问题：确定martentoxin 对BKca钾离子通道亚型的特异选择性及其细胞与分子的阻遏方式。 5．胶质瘤细胞调亡的相关钠和/或钾离子通道参与调控机制。 本实验室新近研究工作发现，富含钠/钾离子通道配体和调制剂成分的蝎粗毒可明显增强胶质瘤细胞的调亡。 5.1. 逐一验证每个已知钠/钾离子通道配体和调制剂成分对胶质瘤细胞生长的抑制效力。 5.2. 利用国产资源独特的钠/钾离子通道配体和调制剂，研究胶质瘤细胞的离子通道表达类型，细胞在生长发育过程中，相关离子通道的特异表达时空分布。 5.3. 研究胶质瘤细胞在生长发育过程中，相关离子通道的电生理活动特征，相关离子通道调控神经信息的网络与分子机制。 拟解决的关键问题：确定钠和/或钾离子通道参与肿瘤胶质细胞调亡的通道类型特征、参与方式与调控网络途径。 （二）细胞分泌与内吞的调控机理 1．影响动作电位编码的离子通道及其分泌调控 1.1. 动作电位编码对培养神经元胞体分泌的调控及其机制。这方面目前尚不清楚，与嗜铬细胞相比神经元有那些异同。在上一个973研究嗜铬细胞的基础上，研究DRG神经元胞体分泌与动作电位编码的关系，以及动作电位编码与离子通道的关系。 1.2. 动作电位编码对蓝斑（Locus Coeruleus）脑片神经元递质分泌的调控及其机制。由于培养神经元失去了与其它细胞的联系环境。因而其刺激分泌偶联的基本模式是否反应脑片神经元的行为尚需实验检测。蓝斑是控制觉醒的脑桥核团，这项研究将使我们过去10年在该领域的工作提高一个层次（从培养细胞推进到脑片水平）。 1.3. 动作电位编码对活体动物特定脑区递质分泌的调控及其机制。过去4年来我们一直在发展应用CFE在位记录纹状体中的多巴胺分泌。在此基础上研究动作电位编码刺激对多巴胺能神经元轴突在纹状体分泌的调控机制。这项在位（in vivo）研究将与脑片研究一起，进一步提升该领域研究的水平。 2. 神经元受体的激活及其内吞 在神经元轴突、树突及其胞体上，存在各种受体，特别是G蛋白偶联受体（GPCR）。在DRG胞体上，我们最近应用共聚焦成像技术发明了高效检测受体激活介导的小泡内吞检测技术（FEI）。应用FEI，并结合膜片钳技术，我们将研究受体内吞的动力学过程。由于没有合适的技术，应用生化方法检测只知道受体内吞所需时间小于2分钟。由于延迟时间对于神经的刺激分泌偶联和刺激内吞偶联至关重要（它决定神经传导的速度），因而实现实时记录小泡分泌和小泡内吞是动力学研究分泌的核心问题。在分泌方面，突触和胞体的延迟时间小于1ms。在小泡内吞方面，目前尚是未知数。 由于缺少实时和高效的活体检测方法，关于受体内吞后在胞体的转运过程和转运途径一直无法实时观察。我们将应用FEI研究特定GPCR受体（例如ATP受体P2Y）经内吞后在胞体内的转运过程和转运途径。以此揭示GPCR这一最重要的细胞膜信号分子在激活和失活后发生在细胞内的一些基本的未知机制。 3. 神经递质分泌的机制 3.1. 在神经模型细胞上研究神经元分泌机制 在DRG神经元胞体上动作电位导致的分泌存在两种形式，经典的钙离子敏感形CDS， 和非经典的钙离子不敏感形CIVDS。在同一细胞上分析CDS和CIVDS的动力学，以及它们对细胞总体分泌的相对贡献。研究胞体分泌的生理意义，确定主要分泌递质，以及DRG神经元的自受体。根据掌握的CIVDS特性，探讨CIVDS的分子机制。 3.2. 发展检测神经调质（包括神经营养因子）的微电极 预实验证明抗体电极对其受体有特异响应。为了研制对特异神经营养因子敏感的微电极，将开展以下工作： （1） 对基本ProCFE微电极尖端进行特殊工艺的物理和化学处理，制成对特异底物敏感的电极。在ProCFE表面涂敷一种神经肽（例如胰岛素）的抗体，使电极对该神经肽敏感（神经肽和抗体的特异结合使抗体的构象改变，电极检测到的移位电流就是检测信号）； （2） 对特异多肽电极的灵敏度、选择性和退化性质进行测定，对测量信号定标； （3）作为细胞实验的第一步，应用上述胰岛素电极，在培养胰腺β细胞上检测β细胞分泌的胰岛素；作为细胞实验的第二步，制作一种垂体多肽电极，在新鲜脑切片细胞上检测多肽的释放。 （四）神经信号的精确分析计算的机理 1. 利用动物认知学习记忆的行为模型，研究比较学习训练和非训练动物神经细胞突触信号分析计算过程的差异及其分子基础。分析脑认知学习记忆动物的神经细胞内基因表达谱。 2．建立siRNA基因沉默动物模型。研究siRNA特定基因沉默动物神经细胞突触信号分析计算过程以及行为的改变，并进行相关性分析。 3．在转基因动物分析研究特定基因与神经细胞突触信号精确分析计算过程的相关性。 4．在转基因动物病理模型（例如，老年痴呆和精神焦虑）研究神经信号错误计算编码所导致脑功能疾病的分子机理。 5．在研究脑功能相关神经信号分析计算过程的细胞分子机理基础上，研发并筛选增强脑高级功能的中西药化合物。通过这五个层面的实验，在行为学、神经网络、神经细胞突触动力学及其分子水平，阐明神经信号精确分析计算过程的细胞分子机理 （五）视网膜神经回路的信息处理 1.由GABA受体介导的自水平细胞至视锥的信号负反馈对双极细胞活动的调制，确定视锥终末独特的离子型GABA受体的特性，包括所介导电流的离子成分和逆转电位，Bicuculline对GABA电流增强效应的EC50 等各种药理学特性，以及此受体的单通道特性；离子型GABA受体和GABAB 受体介导的负反馈对双极细胞活动的调制及其机制。通过激活和阻断这些受体介导的反馈通路，分析双极细胞对光反应特性的变化。 2. 研究双极细胞上甘氨酸受体特性及其功能，研究内源性神经调质对树突和轴突部位甘氨酸受体的调制，及其对双极细胞感受野中心或周围光反应的影响；在视网膜铺片上，研究甘氨酸对视杆或视锥信号驱动的ON型和OFF型双极细胞感受野中心、周围反应的影响，并确定介导这些影响的甘氨酸受体亚型。 3. 研究Müller细胞对双极细胞活动的调制，包括Müller细胞上谷氨酸、GABA转运体不同亚型的表达，明暗对表达模式的调制，以及与双极细胞活动的相关；在应用Western blot技术检验抗体的特异性基础上，用免疫荧光双重标记方法研究双极细胞的 Ca2+通道的亚基组成和亚细胞分布，同时在分离的双极细胞、视网膜薄片上用膜片钳技术研究它们所表达的Ca2+通道类型及特性；分析Müller细胞以及双极细胞的胞内Ca2+ 浓度、Ca2+波的变化，并进一步用Müller细胞特异性抑制剂抑制其代谢，以Ca2+浓度变化为指标，研究其对双极细胞谷氨酸、GABA诱导电流以及光反应特性的影响。 4. 探讨褪黑激素和钠尿肽对视网膜神经元活动的调制，研究褪黑激素和钠尿肽受体在视网膜水平细胞、双极细胞和无长突细胞上的表达；在分离、灌流的视网膜铺片标本，研究褪黑激素和钠尿肽对水平细胞、双极细胞的对光反应的影响；在分离的单个水平细胞、双极细胞和无长突细胞以及视网膜薄片标本上，研究褪黑激素和钠尿肽对谷氨酸、GABA、甘氨酸诱导电流的调制及其机制。 （六）果蝇长时记忆的分子机理 1.确定参与长时程记忆形成的Notch配体 通过研究已知的突变体，如Delta温度敏感型突变体Dl6B、Dl9Q、分泌型的Delta和Serrate突变体，再用行为学方法对这些突变体进行长时程记忆分析，从而确定出哪一种配体参与了长时程记忆的形成。 1.1. 用P因子插入方法筛选出突变体#816013，其P因子插入位点位于基因ptp10d的内部。基因ptp10d编码一个蛋白质酪氨酸磷酸酶，此磷酸酶通过去磷酸化糖蛋白gp150，从而调节gp150下游的基因，而gp150可以调节Notch信号通路和Notch的表达。通过行为学分析研究ptp10d，gp150和Delta是否参与长时程记忆的形成，以及gp150是否通过调节Delta起作用，从而进一步确认ptp10d在长时程记忆中的作用。 1.2. 确定Notch下游参与长时程记忆形成的候选基因。对已知的Notch下游基因E(spl)bHLH，E(spl)m4，single-minded，vestigial(vg)，pax2/sparkling和 Su(H)的突变体进行行为学研究，确定对长时程记忆有影响的候选基因；对有长时程记忆缺陷的突变体进行进一步分析并研究每个基因所编码蛋白的结构及相关的功能。到目前为止筛选出11个记忆功能缺陷突变体的基因（插入位点已确认），拟鉴定Notch下游参与长时程记忆形成的候选基因。 1.3. 确定Notch信号通路在突触结构可塑性中的作用，通过调控cAMP通路改变细胞黏连分子的表达水平，从而调节神经突触结构的可塑性。 2．确定Highwire和Notch之间的作用以及与学习记忆之间的关系 2.1. 对突变体highwire进行行为学分析，从而将该突变体与长时记忆联系起来。并且利用遗传互补行为学实验进一步证明该基因特异性与长时记忆相关。 2.2. 利用研究神经可塑性的经典模型-神经肌肉接点通过双电极电压钳和免疫染色的方法来分析该基因是通过功能上还是结构上的变化来影响长时记忆的形成。 2.3. 利用免疫染色的方法来分析该基因产物在果蝇脑中的分布，从而将它结构性分布与功能联系起来。 2.4. 利用研究神经可塑性的经典模型-神经肌肉接点通过双电极电压钳和免疫染色的方法来分析该基因是通过功能上还是结构上的变化来影响长时记忆的形成。 2.5. 通过遗传学方法来获得既包含双突变体果蝇，结合电生理，行为学，以及免疫染色的方法，分析highwire和Notch通路相互作用，从而参与到学习记忆过程。 3．A激酶锚定蛋白影响长时记忆的机理探讨 3.1. 果蝇神经肌肉节点是研究神经可塑性的经典模型，通过电生理研究手段，以及免疫组化的手段来获得该基因参与长时记忆形成是通过功能上（EJC和mEJC）还是通过结构性的变化(神经肌肉节点神经末梢分枝数目以及bouton数目的变化)来实现的。 3.2. 制备荧光标记寡核苷酸探针和该基因编码蛋白的某个多肽片断（N端或C端多肽片段）的抗体，用原位杂交和免疫组化的研究手段来研究该基因转录产生的mRNA和编码产物在脑中的分布，从而将功能研究和结构上的研究联系起来，从而能够为A激酶锚定蛋白参与学习记忆过程的独特作用提供一种学说来解释。 3.3. 通过置换的遗传学方法获得包含GFP的p因子插入突变体果蝇来替代原来包含lacZ的p因子插入突变体，利用共聚焦三维成像技术来分析该基因在脑中的表达模式。 3.4. 利用行为学，生物化学以及遗传学方法进一步的探讨另一种A激酶锚定蛋白（rugose）和Notch蛋白之间的相互作用在记忆形成中的扮演的角色，然后进一步分析与rugose可以相互作用的A激酶，从而为鉴定Notch蛋白参与长时记忆形成所需要的具体A激酶（PKA）奠定基础，同时也将cAMP通路的组分与目前与学习记忆有关,但机理仍不清楚的Notch通路联系起来，从而有助于我们分析参与新发现的长时记忆形成有关与Notch信号通路有关的相互作用网络。 （七）猴长时记忆的集群神经元编码 1. 长时记忆获得、巩固和读取过程中大脑皮层集群神经元的动态活动 1.1. 场景和听觉恐惧记忆的前扣带回集群神经元编码 1.2. 慢性病理性疼痛记忆的前扣带回集群神经元编码 1.3. 空间记忆和物体记忆的前额叶或颞下回集群神经元编码 2. 痛厌恶情绪和相关记忆形成过程中前扣带回可塑性变化及细胞机制 2.1. 确定痛厌恶情绪及其相关记忆的形成是否伴有前扣带回兴奋性突触传递和可塑性（LTP）的改变 2.2. 确定ERK-CREB信号通路的激活是否为前扣带回LTP、痛厌恶情绪和相关记忆产生的必要条件 2.3. 分析ERK-CREB的上游调节因子和下游靶基因的激活在前扣带回LTP、痛厌恶情绪和相关记忆形成中的作用 1. （八）应激行为与神经可塑性稳态 1. 第一部分,精神应激因素对神经可塑性稳态的影响（徐林负责） 1.1. 精神应激在那些大脑皮层如记忆脑区和情绪脑区导致习得性突触可塑性。拟采用高台应激、强迫游泳、奖励等待、奖励和惩罚冲突、恐惧条件反射、发育早期母婴隔离和产前应激等精神应激动物模型，模拟临床精神疾病：抑郁症、焦虑、强迫症、精神分裂症、创伤后应激综合症(PTSD)、成瘾行为等的某些方面。经历精神应激的大鼠、基因敲除小鼠迅速取脑，制作成脑片。利用膜片钳全细胞记录技术或胞外场电位记录技术记录突触可塑性LTP/LTD的改变。利用膜片钳全细胞记录技术记录分离的NMDA和AMPA受体介导的兴奋性电流，用它们的比例探索记忆脑区海马，杏仁核和奖励中枢腹侧背盖区是否有习得性LTP产生。 1.2. 经历精神应激的大鼠、基因敲除小鼠迅速取脑，制作成脑片。采用我们实验室创建的双通路记录模式，研究精神应激对海马Schaffer通路和PP通路的突触可塑性影响是否有差异，以及导致的含NR2A和NR2B的NMDA受体在海马CA1区神经元的表达和分布影响。并探索改变的LTP/LTD是否伴随着NMDA和AMPA受体亚型的改变。 1.3. 创伤后应激综合症(PTSD)是最典型的精神应激相关脑疾病。利用视觉呈现灾难性图片进行fMRI研究，分析与情绪和记忆相关脑区的活动差异。重点将集中火灾导致的PTSD，在进行恐惧记忆提取时那些脑区参与，这些脑区灰质密度的变化、波谱反映的神经元代谢的变化。分析PTSD病人单氨类神经递质的变化。并且进行治疗前后的疗效和fMRI反映的功能可塑性变化的比较。 1.4. 海马信息处理被认为是群起编码和组合突触可塑性编码。因此，不是每个神经元在同样的行为应激模型下均发生相同的变化。比较单细胞突触可塑性稳态和多细胞突触可塑性稳态的差异和相同性，就可为病理性记忆的产生机理提供实验证据。在海马脑片中记录长电位的突触可塑性和全细胞的突触可塑性LTP/LTD，比较它们的相同性和区别。 1.5. 经历行为应激的动物，记录海马或杏仁核的突触可塑性LTP/LTD，比较海马和杏仁核突触可塑性稳态的差异和相同性。分别通过电损毁背侧海马或杏仁核研究行为应激模型的建立或提取是否受影响。利用基因敲除动物如5-HT神经递质敲除动物，研究行为应激模型的建立或维持的区别，并记录这些动物的海马和杏仁核突触可塑性，研究LTP/LTD的平衡是否出现改变，从而为脑功能的稳态调控提供直接证据。 1.6. 利用动物产前应激对青春期脑功能可塑性的影响，进行脑失稳态的研究，寻找发育中精神应激导致精神分裂症假说的新证据。对临床已诊断为阴性和阳性症状的精神分裂症病人进行fMRI研究，分析静息条件下各个脑区的活动情况，比较治疗前后应激激素水平的高低，研究具有高密度应激激素受体的脑区，如前额叶、杏仁核和海马等区域的治疗改变。同时拟检测血样中，应激激素受体基因位点的多态性。 1.7. 行为应激动物模型中，海马内注射拮抗剂选择性地阻断LTP和LTD，研究恐惧条件反射PTSD模型是否还能建立、强迫游泳的抑郁症模型是否还能建立；建立恐惧记忆或负性情绪记忆后是否还能提取或巩固这些记忆。由于KCC2是发育中控制着神经细胞抑制性系统效率的重要转运体，研究行为应激动物模型中KCC2的RNAi是否能影响行为应激动物模型的建立和维持，是否影响海马突触可塑性的平衡和平衡的维持。 1.8. 在行为应激动物模型中应用临床抗精神分裂症、抗抑郁症等药物进行干预，研究行为应激动物模型的建立、维持的影响。同时记录这些动物的海马脑片的突触可塑性，研究失去平衡的可塑性稳态的恢复情况。利用丰富环境，让动物接触更多的新鲜事物和玩具，观测对行为应激动物模型的影响和对海马突触可塑性的影响。为寻找新途径和方法治疗这些应激相关脑疾病提供理论依据和分子靶点。 1.9.利用建立的精神应激动物模型，筛选天然活性成分，应用于开发抗急慢性精神应激药物的临床前研究与开发。 2. 第二部分,躯体应激因素对神经可塑性稳态的影响（陈军负责） 以躯体应激（如外周组织或神经损伤造成的持续、慢性痛刺激）因素的动物模型为主，采用行为学（如条件位置回避性行为、条件位置偏爱性行为、水迷宫、恐惧条件反射、疼痛阈值等动物模型）、在体麻醉动物场电位或胞外记录技术、离体脑-脊髓薄片单细胞胞外/全细胞膜片钳记录技术、离体脑-脊髓薄片微电极阵列（8x8 MED64道）技术和分子细胞生物学技术，研究： 2.1. 急慢性身体应激因素是否引起诸如大脑皮层SI区、SII区、岛叶、扣带回、海马和杏仁核等脑核团发生细胞内在兴奋性或突触可塑性改变（LTP/LTD），如果有其细胞分子机制是什么？同时也研究这些脑区抑制性突触可塑性的改变（I-LTP和I-LTD）。比较研究脊髓和上述大脑皮质对躯体应激因素反应的异同，干预躯体应激的感受和传递，探讨药物治疗的新分子靶点和策略。 2.2. 在躯体应激行为动物模型中，通过药理学方法和RNAi技术干预受体和基因表达，观测躯体应激如何能被阻断、躯体应激影响的大脑皮质那些脑区的可塑性能否被逆转或不能够逆转，尤其是参与疼痛和情绪以及记忆的大脑皮层是那些脑区，以及疼痛感受的关系还是与疼痛记忆的关系。比较不同躯体应激的方式是否具有共同的细胞和分子生物学机理。 2.3. 在躯体应激行为动物模型中，研究中枢大脑皮质区域比如扣带回等对疼痛感受和调控作用，探索躯体应激行为如何导致精神应激与慢性疼痛的敏感化的细胞分子生物学机理。 2.4. 与躯体应激有着密切关联的大脑皮层SI区、SII区、岛叶、扣带回、海马和杏仁核等脑核团，在神经可塑性稳态或稳态失调对动物慢性躯体应激造成的行为改变，脊髓感觉与运动的作用方式是否有调控作用？疼痛应激的敏感化和赖受性的细胞和分子生物学机理。这些脑区的结构与功能可塑性是否直接影响疼痛的感受和疼痛阈值。 2.5.比较精神应激和躯体应激对脑结构和功能可塑性影响是否一致。比较同时存在精神应激和躯体应激海马、杏仁核等脑区是否存在比较精神应激和躯体应激对脑结构和功能可塑性影响是否一致？以此探讨在精神与躯体两种应激状态下，是否存在治疗上的共性或个性？在应用基础研究方面，通过与中南大学精神卫生研究所和第四军医大学功能性脑疾病研究所（挂靠在唐都医院神经外科）的紧密合作，制订研究评估临床精神性疾病、慢性疼痛、药物成瘾手术干预治疗病人功能脑影像（EEG/ERP、fMRI 等）研究方案和部门或国家标准。 2.6.利用建立的躯体应激动物模型，筛选天然活性成分，应用于开发抗急慢性躯体应激药物的临床前研究与开发。 二、预期目标 总体目标、五年预期目标 （一） 项目总体目标： 通过在基因与分子网络的稳态，神经元、神经胶质细胞与突触可塑性的稳态，神经回路的稳态，脑可塑性稳态与行为等四个层面上，紧紧围绕“脑功能的动态平衡调控”这个关键的科学问题，针对（1）电压门控离子通道的调控；（2）细胞分泌与内吞的调控机理；（3）抑制性突触及其可塑性；（4）神经信号的精确分析计算的机理；（5）视网膜神经回路的信息处理；（6）果蝇长时记忆的分子机理；（7）猴长时记忆的集群神经元编码；（8）应激行为与神经可塑性稳态等8个方向课题的深入研究，本项目拟逐步完善“脑功能的动态平衡调控”理论，在上述四个层面和8个方向上取得突破性成果（成果以国际高影响因子的SCI期刊收录论文为标志）；同时结合21世纪我国神经与精神疾病在疾病谱中的严重地位，创造一套适合临床需求的治疗参考理论方案，在这个理论的指导下尝试研制几个用于治疗如慢性疼痛、癫痫、精神分裂、痴呆和其它感觉与运动功能障碍的一类或二类新药（成果以国家发明专利、新药临床研究证书等为标志）。 （二） 五年预期目标： 1． 在基因与分子网络稳态的层面上，已经通过筛选在3000多个果蝇基因突变体中，发现11个与记忆和记忆缺陷有关的新基因，以Notch信号通路为突破口，了解长时记忆分子网络机理，应用果蝇突变体模式动物模型筛选几个增强学习记忆能力的新药。 2． 在神经元、神经胶质细胞与突触可塑性稳态的层面上，通过对神经细胞内外环境稳态与失稳态机制、神经递质与调质代谢的稳态与失稳态机制、神经细胞表面分子如受体、通道和膜脂质信号分子的稳态与失稳态机制、细胞分泌与内吞的调控机理机制、胞内信号转导分子网络稳态与失稳态机制等方面的深入综合探讨，揭示维持神经元、神经胶质与突触可塑性稳态的细胞分子机理。应用这个层面上的多种细胞模型筛选调控神经元、神经胶质细胞与突触可塑性稳态的分子药理学新作用靶点。在中华蝎毒素等生物毒素中寻找调控离子通道的具有我国知识产权的新工具药。 3． 在神经回路稳态的层面上，以视网膜神经回路和脊髓伤害性屈肌反射回路为模型，通过对神经细胞内外环境稳态机