移植物慢性排斥反应动脉硬化血管平滑肌细胞的形态及功能变化研究 (2).doc

ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书( 2005版) 第3页 同行评议组别 生理、病理及病理生理学 项目编号 Y205204 浙江省自然科学基金 申 请 书 申报类别: 一般项目 项目名称: 移植物慢性排斥反应动脉硬化血管平滑肌细胞的形态及功能变化研究 申 请 者: 王伟林 电 话: 0571-87236884 依托单位: 浙江大学/医学院 通信地址: 浙江大学医学院附属第一医院肝胆外科 邮政编码: 310003 E-mail : jiachk@ 申报日期: 2005-5-23 浙江省自然科学基金委员会 二OO五年制 基本信息 申请者信息 姓 名 王伟林 性别 男 出生日期 1963年06月05日 最终学位 硕士 获学位年份 1992 职称 教授 主要研究领域 肝胆胰疾病、肝脏移植、胰腺移植的临床与基础研究 E-mail jiachk@ 电 话 0571-87236884 个人网页 依托单位 浙江大学/医学院 证件类型 身份证 证件号码 330102630605121 申请者是否近三年调入在浙单位工作 否 调入时间 申请者曾主持的浙江省自然科学基金资助项目编号: 申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限: 项目基本信息 项目名称 移植物慢性排斥反应动脉硬化血管平滑肌细胞的形态及功能变化研究 申报类别 一般项目 研究属性 纯基础研究 同行评议组别 医药科学/生理、病理及病理生理学 依托基地名称 卫生部多器官联合移植研究重点实验室---浙江大学 预计研究年限 2006年01月－2008年12月 总经费预算 6.0万元 申请经费 6.0万元 项目研究目标、内容和意义简介(限400字) 通过体外、体内实验研究慢性排斥反应时同种移植物血管平滑肌细胞（VSMC）的形态及功能状态，探讨排斥与非排斥时VSMC分泌生长因子和膜上受体以及细胞外基质蛋白和血管活性物质等的表达情况，采用蛋白质组学技术分析排斥与非排斥时VSMC蛋白质表达上的差异，测序、筛选和鉴定与同种移植慢性排斥反应移植物动脉硬化相关的蛋白质，阐明血管平滑肌细胞从血管中层迁移至内膜层的发生机制，揭示器官移植动脉硬化的病理生理过程，为今后慢性排斥时动脉硬化的防治提供新的思路。并利用中药黄芪的抑制VSMC的活化与增殖及抗氧化作用，减轻移植物慢性排斥反应动脉硬化的发生，同时研究其抑制VSMC的活化与增殖作用的靶点，为中药治疗移植物慢性排斥反应提供进一步的理论支持。对防治慢性排斥反应导致移植物慢性失功具有重大的临床意义。 关键词（不超过4个） 慢性排斥反应；VSMC；动脉硬化；蛋白质组学 同行评议分组说明 细胞病理及病理生理学 重点资助方向 重要疾病机理及防治研究 申请书版本号：58504619 项目组主要成员 编号 姓名 出生日期 性别 职称 学位 单位名称 电话 项目分工 每年工作时间（月）（（(月) 1 王伟林 1963年06月05日 男 教授 硕士 浙江大学/医学院 0571-87236884 负责人 6 2 贾长库 1969.05.20 男 讲师 博士 浙江大学 0571-87236570 细胞培养 4 3 施邵华 1967.07.15 男 讲师 博士 浙江大学 0571-87236570 蛋白印迹 4 4 毛斐斐 1971.05.18 女 主管药师 学士 浙江大学 0571-85164196 分子生物 4 5 丁光超 1978.04.26 男 药师 其他 浙江大学 0571-85164196 中药药理 5 6 金晶 1980.05.24 男 硕士生 学士 浙江大学 0571-87236570 细胞培养 8 7 高磊 1980.11.18 男 硕士生 学士 浙江大学 0571-87236570 动物模型 8 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 参加单位数 7 1 3 1 0 0 2 1 说明：1.个人介绍部分申请者必须填写，其他人员可以不填写； 2.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成； 3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。 ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005版） 第17页 个人介绍： 王伟林：男，42岁，外科学教授，硕士生导师。1992年获浙江医科大学外科学硕士学位，1997年1月-1999年8月在香港大学玛丽医院外科研修。多年来从事肝胆胰疾病、肝脏移植、胰腺移植及肝肾联合移植与胰肾联合移植的临床与基础研究，积累了丰富的临床经验，具有较强的临床与科研组织实施能力。其肝肾联合移植的临床研究获浙江省科技进步一等奖（本人排名7/16）。发表了多篇高质量的研究论文。 1.Wang WL, Yang ZF, Lo CM. Intracerebral hemorrhage after liver transplantation. Liver Transplantation. 2000, 6: 345-348. 2.Cheung ST, Tsui TY, Wang WL. Liver as an ideal target for gene therapy: Expression of CTLA4Ig by retroviral gene transfer. J Gastroenterol Hepatol. 2002, 17:1008-1014. 3.王伟林，范上达. 活体肝移植的供肝切取手术40例临床分析. 中华普通外科杂志. 2000，5：521-523. 4.王伟林，范上达. 肝移植受体感染的相关因素分析。中华肝胆外科杂志. 1999，5：163-167. 5.范上达，王伟林. 活体肝移植外科处理. 中华肝胆外科杂志. 2000，6：253-255. 6.季峰，王伟林，杨自力，厉有名,　黄怀德,　陈卫东. 基质金属蛋白酶-2mRNA在胃癌中的表达. 中华消化杂志. 1999，19: 318-320. 7.杨振帆，王伟林，卢宠茂，　吴吕爱莲, 　范上达. 肝移植的急性排斥反应. 中华器官移植杂志. 1999，20：237-239. 8.范上达，王伟林，杨振帆. 95例次肝移植临床分析. 中华实用外科杂志. 1999，19：532-534. 贾长库：男，35岁，讲师。2003年6月获浙江大学外科学博士学位，多年来一直从事器官移植方面的临床和基础研究工作，了解并掌握了器官移植学、分子生物学、细胞生物学及免疫学的基础理论，擅长大鼠心脏移植和肝脏移植技术，能够熟练运用如原位杂交、Western blot、EMSA、质谱分析、基因转染及分子克隆等多种实验方法和实验技术进行相关研究，具有丰富的科研工作经验。曾作为助理研究员于2003年1月前往香港大学进行合作研究。 1.Jia CK, Zheng SS, Xie HY. CsA downregulates IFN-gamma gene transcription after liver transplantation by inhibiting NF-kappaB activity. Chin Med J. 2003, 116(11):1668-1672. 2.Jia CK, Zheng SS, Li QY, Zhang AB. Immunotolerance of liver allotransplantation induced by intrathymic inoculation of donor soluble liver specific antigen. World J Gastroenterol. 2003, 9(4):759-764 3.Jia CK, Zheng SS, Zhu YF. Intrathymic inoculation of liver specific antigen alleviates liver transplant rejection. Chin Med Sci J. 2004, 19(1):38-43. 4.Jia CK, Zheng SS, Zhang AB.Intrathymic inoculation of donor liver specific antigen alleviates rejection of liver allotransplantation.J Zhejiang Univ Sci. 2003, 4(4):485-490. 5.Jia CK, Wang Y, Zheng SS, Xu SH, Ye J. Allolymphocyte apoptosis induced by soluble liver specific antigen.Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2003, 2(2):184-190. 6.贾长库，郑树森，万云乐，赵志成，尉建锋，施邵华，谢海洋，蒋国平，宋朋红.肝特异抗原的同种异体免疫原性.中华器官移植杂志.2002，23（6）：353-356 7.贾长库，郑树森，施邵华，徐世国，章爱斌，王慧萍.胸腺接种肝特异抗原对同种肝移植排斥反应的作用.中华器官移植杂志.2004，25（2）：103-105 8.贾长库，郑树森，施邵华，章爱斌，谢海洋. 肝移植后环孢素对核因子κB活性和γ干扰素基因转录表达的影响.中华外科杂志.2004，42(17)：1052－1055 申请经费预算 6.0 万元 计划开支项目名称 计算根据及理由 金额（万元） 1．信息费 信息检索、购买参考书、复印、数据统计分析，论文发表等 0.5 2．专题学术活动费 会议费、差旅费等 0.5 3．仪器和设备购置费 0.0 4．能源材料费 实验近交系大鼠、各种抗体、引物合成、细胞培养、蛋白质组学试剂及Western blot检测等各种试剂 4.1 5．计划管理费 总经费的5％ 0.3 6．人员费 总经费的10％ 0.6 注：开支范围和标准参见《浙江省省级科技项目经费管理暂行办法》（浙财教字[2002]20号）。 申请者承诺： 我保证： （1）申请书内容是真实的； （2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则； （3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作； （4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限； （5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。 若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。 签字： 日期： 项目依托单位承诺: 已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。 依托单位公章 日期 . 移植物慢性排斥反应动脉硬化血管平滑肌细胞的形态及功能变化研究 一、项目研究意义 由于移植免疫研究的深入和新型免疫抑制剂如环孢素A和FK506的临床应用，同种移植短期存活率已经得到明显的提高，但同种移植物长期存活率却未取得类似的改善[1,2]。慢性排斥反应导致移植物慢性失功，一直是影响移植物长期存活的主要原因之一[3]，随访4至5年30%肾移植患者具有慢性排斥反应的临床病理表现，心脏移植患者1年冠状动脉硬化发生率6%-18%，术后2 年23%，5年达50%；对大宗成人肝移植病例的5 年和5 年以上的晚期死亡率分析表明，慢性排斥反应者占5%-19%[1,2]。 慢性排斥反应的临床症状，因移植器官类型的不同而有相应表现，但具有一个共同组织学表现即移植物动脉硬化[4]，其特征是泡沫细胞性闭塞性动脉病变，如动脉内膜增厚、内膜的单核细胞和巨噬细胞浸润、内膜下无细胞基质的聚积、管腔狭窄、中膜萎缩及间质纤维化。继发于闭塞性动脉病变所致的移植物缺血缺氧，可引起移植肾肾小球硬化、间质纤维化、肾小管萎缩、终致肾梗死，移植肝的胆管消失和肝纤维化，移植心的缺血缺氧而致心绞痛、心肌梗死与猝死[5]。近年来，尽管在移植器官的保存、免疫抑制治疗等方面取得了巨大进步，但临床上移植物3年动脉硬化的累积发生率仍达40％，5年则高达50％[6]，故深入研究移植物动脉硬化的发生机制，对防治慢性排斥反应导致移植物慢性失功具有重大的临床意义。 迄今为止，同种移植物动脉硬化的发生机理尚不十分明了，可能是一个涉及VSMC功能及形态发生改变的多因素参与的联级反应过程。细胞免疫与体液免疫、氧化应激、CMV感染、AngII及生长因子等，在同种移植慢性排斥反应时VSMC增殖与迁移、VSMC凋亡和细胞外基质形成的过程中发挥重要作用。ROS、核因子-κB（NF-κB）、粘附分子等可能参与慢性排斥反应时血管内膜增厚和血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡的过程[7]，而移植物动脉硬化早期即有明显的VSMC凋亡，并且VSMC凋亡与血管内膜增厚、移植物动脉硬化相关[8,9]，器官移植缺血再灌注时或炎症反应时均有ROS的形成，ROS氧化应激引起IκB磷酸化、泛素化及其降解有关，最终激活NF-κB[10]。体外研究发现CMV感染VSMC，引起VSMC产生ROS及NF-κB的活化，使VSMC活化和增殖[11]。应用环孢素A或FK506的器官移植患者高血压发生率达82%[12]，高血压患者常伴有血管紧张素（Ang ΙI） 水平升高，Ang ΙI 经NADH氧化酶或线粒体途径促进血管细胞产生ROS[13]，Ang ΙI介导血管内皮细胞氧化应激而促进内皮细胞 NF-κB活化与VCAM-1表达[14]。应用糖皮质激素与环孢素A或FK506等的移植患者常有血糖、血脂的代谢紊乱，高血糖可致糖基化终未产物（AGEs）形成，AGEs与其受体结合引起血管内皮细胞ROS产生与NF-κB激活，高血糖促进血管内皮细胞上调表达ICAM-1，亦诱导NF-κB的激活[15]，促进动脉硬化的发生。移植血管内和循环中的TNF-α和IFN-γ等细胞因子均可介导移植物动脉硬化的发生，而血红素环加氧酶-1（HO-1）和A20等保护基因的高表达则可抑制TNF-α和IFN-γ，从而减轻移植物的动脉硬化[16,17,18]。血管内皮细胞、平滑肌细胞及浸润于血管壁的单核细胞、巨噬细胞可分泌细胞因子与生长因子参与移植物动脉硬化，如IL-1是VSMC与成纤维细胞的丝裂原，血小板源性生长因子（PDGF）可刺激VSMC增殖并上调表达PDGF-β受体，表皮生长因子（EGF）、硷性成纤维细胞生长因子（bFGF）、IL-1和TNF 等调节VSMC 内PDGF mRNA表达，内皮素-1经上调PDGF-β受体和PDGF-BB链表达之方式促进同种移植心动脉硬化的发展[19]。PDGF是间充质起源的细胞如VSMC与成纤维细胞的主要丝裂原，PDGF及其受体参与移植物动脉病变，动脉移植慢性排斥时内膜PDGF-β受体轻中度表达，PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂则减轻移植动脉硬化[20]。 胰岛素样生长因子（IGF-I）对同种动脉移植慢性排斥反应发生起促进作用[21]，IGF-I反义寡核苷酸则抑制VSMC的DNA合成与增殖，显著减少PDGF与bFGF对VSMC的增殖反应。同种移植慢性排斥反应时移植物血栓素B2 和PGF1α 水平明显升高，血栓素合成酶抑制剂与PGI类似物能抑制同种移植动脉硬化[22]。同种心脏移植慢性排斥反应时，动脉内膜层与中层MMP(基质金属蛋白酶)-2与MMP-9的表达明显上调，而TIMP(金属蛋白酶组织抑制因子)-1与TIMP-2表达下调[23]，MMP-9与TIMP-1比例失调可能亦参与肺移植慢性排斥反应[24]，MMP-9表达促进内膜基底层和细胞外基质降解，有助于VSMC迁移。VSMC是移植物动脉硬化发病中的主要效应细胞，因此研究移植物慢性排斥反应动脉硬化VSMC的作用和功能变化，通过各种手段干预VSMC的活化与增殖是目前治疗移植物慢性排斥反应的具有重要价值的研究方向和研究热点[25]。 VSMC是血管壁的主要细胞成分之一，它是决定血管活性和血管构型的重要因素，VSMC功能状态的改变在慢性排斥反应时移植物动脉硬化中发挥重要的作用。但是迄今为止，在慢性排斥反应时（1）移植物动脉平滑肌细胞的功能状态及其蛋白合成功能的改变，（2）在排斥反应的不同时段VSMC以自分泌和/或旁分泌形式分泌的生长因子如PDGF、bFGF、IGF-I、PLA、细胞外基质蛋白和血管活性物质如AngII等的表达情况，（3）VSMC膜上受体表达情况如PDGF受体、IGF-I受体、β1和β3整合素受体、AngII受体，（4）VSMC从血管中层迁移至内膜层的发生机制，（5）VSMC迁移时细胞内信号传导通路等方面国内外均无深入研究。因此，本课题欲研究慢性排斥反应过程中VSMC的形态及功能状态，探讨排斥与非排斥时其分泌细胞因子及蛋白合成的改变，阐明慢性排斥时动脉硬化发生的机制，为今后慢性排斥时动脉硬化的防治提供新的思路；并利用中药黄芪的抑制VSMC的活化与增殖及抗氧化作用，减轻移植物慢性排斥反应动脉硬化的发生，同时研究其抑制VSMC的活化与增殖作用的靶点，为中药治疗移植物慢性排斥反应提供进一步的理论支持。 我省的肝移植中心已成为国内规模最大肝移植中心之一、病人来源从来自于省内扩展到全国包括香港、台湾地区在内的二十多个省份和意大利等欧洲国家，在国内移植领域处于领先地位。但同国内及世界其它的肝移植中心一样，急慢性排斥反应仍是目前困扰肝移植效果、亟待解决的课题之一。着眼于VSMC的研究，探讨VSMC在移植物慢性排斥反应动脉硬化时的形态及功能变化，阐明慢性排斥时动脉硬化发生的机制，并寻求对策以获得同种移植免疫耐受，对防治慢性排斥反应导致移植物慢性失功具有重大的临床意义，必将大力推动我省乃至我国器官移植领域的进步，并产生巨大的社会效益和经济效益。 二、 目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系； 本课题的研究目标是通过体外、体内实验，研究慢性排斥反应时同种移植物血管平滑肌细胞（VSMC）的形态及功能状态，探讨排斥与非排斥时VSMC分泌生长因子和膜上受体以及细胞外基质蛋白和血管活性物质等的表达情况，采用蛋白质组学技术分析排斥与非排斥时VSMC蛋白质表达上的差异，测序、筛选和鉴定与同种移植慢性排斥反应移植物动脉硬化相关的蛋白质，阐明血管平滑肌细胞从血管中层迁移至内膜层的发生机制，揭示器官移植动脉硬化的病理生理过程，为今后慢性排斥时动脉硬化的防治提供新的思路。并利用中药黄芪的抑制VSMC的活化与增殖及抗氧化作用，减轻移植物慢性排斥反应动脉硬化的发生，同时研究其抑制VSMC的活化与增殖作用的靶点，为中药治疗移植物慢性排斥反应提供进一步的理论支持。这对防治慢性排斥反应导致移植物慢性失功具有重大的临床意义。 申请者的研究工作长期目标是揭示器官移植动脉硬化的病理生理过程，探讨临床应用的免疫制剂及其他药物或免疫调节因子对器官移植动脉硬化和移植物慢性失功的作用；揭示移植物慢性失功高发和早发的免疫/非免疫学分子基础和作用机理；寻找移植物慢性失功的有效干预或调节措施，为今后慢性排斥时动脉硬化的防治提供新的思路，并最终使其应用于临床，获得人同种肝移植的免疫耐受，减少CsA等免疫抑制剂的用量和毒副作用，以及解决昂贵的治疗费用等一系列问题，为诱导肝移植免疫耐受开拓新的途径。 因此，本课题是研究工作长期目标的一个组成部分，本课题的顺利进行必将为长期目标的完成打下坚实的基础，最终推动我省乃至我国器官移植领域的进步。 三、 目研究内容，研究方案和进度安排 研究内容 1 分离Lewis大鼠腹主动脉VSMC，并成功传代。α-actin抗体对平滑肌细胞进行免疫荧光化学的鉴定。 2 内皮素－1(ET-1)体外和Lewis大鼠VSMC共同培养12小时，刺激VSMC活化和增殖。ET-1和VSMC共同培养前不同剂量（低、中和高剂量组）的黄芪注射液与VSMC共同培养6小时作为处理组。培养后取各组相应时间的VSMC作如下研究。 3 Boyden双腔系统测定细胞迁移率和3H–胸腺嘧啶掺入检测平滑肌细胞增殖状态；病理学与电镜观察平滑肌细胞形态结构与其超微结构（如微丝、核糖体、内质网和高尔基体）的改变，以了解平滑肌细胞的功能状态；ELISA和免疫组织化学法观察平滑肌细胞膜受体、生长因子、细胞外基质等的表达情况，如PDGF受体、IGF-I受体、β1和β3整合素受体、AngII受体、PDGF、bFGF、IGF-I、PLA和血管活性物质如Ang II；与未受血清处理的平滑肌细胞相比较，通过双向电泳和质谱分析等蛋白质组学技术分析平滑肌细胞蛋白质表达上的差异，筛选出可能与病变相关的蛋白质。 4 建立同种大鼠原位腹主动脉移植（Lewis→BN）的慢性排斥反应动物模型，移植血管在肾动脉水平以下两侧髂总动脉水平以上。 5 静脉给予同种腹主动脉移植（Lewis→BN）的受体大鼠黄芪注射液（低剂量组、中剂量组和高剂量组），移植后7、14、21、28和56天分别取慢性排斥组和各实验组受体大鼠外周血，检测肌酐、尿素氮水平，反应移植血管硬化及狭窄情况，ELISA检测外周血TNF-α,IFN-γ等介导动脉硬化的细胞因子表达情况。 6 取各组移植相应时间段的移植血管， ELISA检测组织匀浆中TNF-α,IFN-γ等介导动脉硬化的细胞因子表达情况。病理学与电镜观察移植血管内膜与中层形态变化特点，免疫组织化学分析移植血管内膜与中层平滑肌细胞含量的变化；免疫组织化学和western blot法观察平滑肌细胞膜受体、生长因子、细胞外基质蛋白等的表达情况，通过双向电泳和质谱分析等蛋白质组学技术分析平滑肌细胞蛋白质表达上的差异，测序、筛选和鉴定与病变有关的蛋白质。 拟采取的研究方案 第一部分 体外实验 1 分离BN大鼠腹主动脉VSMC，并用α- actin抗体对已分离的平滑肌细胞进行免疫荧光化学法的鉴定，及传代培养。 2 内皮素－1(ET-1)体外和Lewis大鼠VSMC共同培养12小时，刺激VSMC活化和增殖。ET-1和VSMC共同培养前不同剂量的黄芪注射液与VSMC共同培养6小时，培养体系黄芪终浓度分别为0.5mg/ml，5mg/ml和50mg/ml作为实验组。 3 取培养12小时后对照组及各处理组Lewis大鼠VSMC，Boyden双腔系统测定细胞迁移率和3H – 胸腺嘧啶掺入检测平滑肌细胞增殖状况；病理学与电镜观察平滑肌细胞形态结构与其超微结构的改变；ELISA和免疫组织化学法观察平滑肌细胞膜受体、生长因子、细胞外基质和血管活性物质等的表达情况，比较蛋白质组学分析的平滑肌细胞蛋白质表达上的差异，筛选可能与疾病相关的蛋白质。技术路线见下图： 平滑肌细胞迁移和增殖状态 病理与电镜 ELISA和免疫组化 双向电泳、质谱分析等蛋白质组学 平滑肌细胞形态及其超微结构的改变 平滑肌细胞细胞膜受体、生长因子、细胞外基质等的表达 分析平滑细胞蛋白质表达上的差异 Boyden双腔系统与3H-胸腺嘧啶掺入检测 Lewis大鼠VSMC Lewis大鼠VSMC+ET-1 各组黄芪＋Lewis大鼠VSMC+ET-1 第二部分 动物实验 1 建立大鼠同种腹主动脉移植模型。 2 实验组为移植当日起受体大鼠每日分别静脉注射黄芪注射液5g/kg处理组（低剂量组），10g/kg处理组（中剂量组）和20g/kg处理组（高剂量组），BN→BN为同基因移植组，Lewis→BN为慢性排斥对照组。 3 移植后不同时段取外周血，检测肌酐、尿素氮水平，反应移植血管硬化及狭窄情况，ELISA检测外周血TNF-α,IFN-γ等介导动脉硬化的细胞因子表达情况。 4 取各组移植相应时间段的移植血管，ELISA检测组织匀浆中TNF-α,IFN-γ等介导动脉硬化的细胞因子表达情况。病理学与电镜观察移植血管内膜与中层形态变化特点，免疫组织化学分析移植血管内膜与中层平滑肌细胞含量的变化；免疫组织化学和western blot法观察平滑肌细胞膜受体、生长因子、细胞外基质蛋白等的表达情况。 5 通过双向电泳和质谱分析等蛋白质组学技术分析平滑肌细胞蛋白质表达上的差异，测序、筛选和鉴定与病变有关的蛋白质。同种腹主动脉移植实验分组见下表： 组别 n 处 理 方 式 1 30 BN→BN同基因移植组 2 30 Lewis→BN慢性排斥组 3 30 Lewis→BN移植受体静脉注射黄芪注射液5g/kg/d处理组 4 30 Lewis→BN移植受体静脉注射黄芪注射液10g/kg/d处理组 5 30 Lewis→BN移植受体静脉注射黄芪注射液20g/kg/d处理组 平滑肌细胞形态结构的变化 移植血管内膜层和中层 平滑肌细胞含量的变化 免疫组织化学 免疫组化和western blot 平滑肌细胞的细胞膜受体、生长因子、细胞外基质等的表达 病理与电镜 肌酐、尿素氮水平，反应移植血管硬化及狭窄情况 蛋白质组学 质谱分析 测序、筛选、鉴定与慢排移 植物动脉硬化相关的蛋白质 移 植 血 管 ELISA 组织匀浆 TNF-α,IFN-γ的表达 受体外周血 肾功能检测 各移植组 每组又分移植后7、14、21、28和56天时间段各6只5个亚组，在移植后相应时段取外周血和移植血管，用以实验指标的检测。取材、检测指标及相应检测方法见下图: 进度安排（本项目研究时间三年从2006.1-2008.12） 2006．1-2006．12 1 分离Lewis大鼠腹主动脉血管平滑肌细胞，α- 平滑肌肌动蛋白抗体对平滑肌细胞进行免疫荧光化学的鉴定，传代培养。 2 内皮素－1(ET-1)体外和Lewis大鼠VSMC共同培养，刺激VSMC活化和增殖。ET-1和VSMC共同培养前不同剂量（低、中和高剂量组）的黄芪注射液与VSMC共同培养。 3 取培养后对照组及各处理组Lewis大鼠VSMC，Boyden双腔系统测定不同时段的细胞迁移率和3H –胸腺嘧啶掺入检测平滑肌细胞增殖状况；病理学与电镜观察不同时段的平滑肌细胞形态结构与其超微结构的改变；免疫组织化学和ELISA法观察不同时段的平滑肌细胞膜受体、生长因子、细胞外基质和血管活性物质等的表达情况。 2007．1-2007．12 1 与未受ET-1和黄芪处理的平滑肌细胞相比较，蛋白质组学分析不同时段的平滑肌细胞蛋白质表达上的差异，筛选出可能与病变有关的蛋白质。 2 建立同种大鼠动脉移植（Lewis→BN）的慢性排斥反应动物模型，获取不同时段的受体外周血和移植血管。 3 检测外周血肌酐、尿素氮水平， TNF-α,IFN-γ等介导动脉硬化的细胞因子表达情况。 4 检测组织匀浆中TNF-α,IFN-γ等介导动脉硬化的细胞因子表达情况。 5 病理学与电镜观察不同时段的移植血管内膜与中层形态结构、及平滑肌细胞超微构的改变；免疫组织化学分析不同时段的移植血管内膜与中层平滑肌细胞含量的变化。 2008．1-2008．12 1 免疫组织化学和western blot法观察不同时段的移植血管平滑肌细胞膜受体、生长因子、细胞外基质蛋白、血管活性物质等的表达情况。 2 与正常血管平滑肌组织相比较，比较蛋白质组学分析平滑肌细胞蛋白质表达上的差 异，进一步筛选、核实与病变相关的蛋白质。 3 实验收尾工作，分析实验结果，撰写论文。 四、 项目创新之处 近年来，尽管在移植器官的保存、免疫抑制治疗等方面取得了巨大进步，但临床上移植物3年动脉硬化的累积发生率仍达40％，5年则高达50％，故深入研究移植物动脉硬化的发生机制，对防治慢性排斥反应导致移植物慢性失功具有重大的临床意义。 VSMC功能状态的改变在慢性排斥反应时移植物动脉硬化中发挥重要的作用，但是迄今为止，在慢性排斥反应时（1）移植物动脉平滑肌细胞的功能状态及其蛋白合成功能的改变，（2）在排斥反应的不同时段VSMC以自分泌和/或旁分泌形式分泌的生长因子的表达情况，（3）VSMC膜上受体表达情况如PDGF受体、IGF-I受体、β1和β3整合素受体、AngII受体，（4）VSMC从血管中层迁移至内膜层的发生机制，（5）VSMC迁移时细胞内信号传导通路等方面国内外均无深入研究。因此，本课题： 1） 从体外、体内两方面研究入手，从不同时段观察同种移植慢性排斥反应时平滑肌细胞形态结构与其超微结构的改变，及观察平滑肌细胞膜受体、细胞外基质蛋白、生长因子、血管活性物质等的表达状况，通过双向电泳与质谱分析等蛋白质组学技术分析平滑肌细胞蛋白质表达上的差异，筛选、核实与同种移植慢性排斥反应移植物动脉硬化相关的蛋白质，从理论上初步阐明血管平滑肌细胞迁移的发生机制，揭示器官移植动脉硬化的病理生理过程，为慢性排斥时动脉硬化的防治提供新的手段和方案。 2） 利用中药黄芪的抑制VSMC的活化与增殖及抗氧化作用，减轻移植物慢性排斥反应动脉硬化的发生，同时研究其抑制VSMC的活化与增殖作用的靶点，为中药治疗移植物慢性排斥反应提供进一步的理论支持。这些都是本研究的特色，亦为本研究的创新之处。 五、 工作基础与工作条件 工作基础 本课题组申请者和主要成员多年来一直从事肝移植、肾移植临床工作，在移植免疫、免疫抑制药物的毒性、同种血管移植及中草药对同种血管移植慢性排斥反应的抑制作用等方面的研究基础，积累了较丰富的实践经验和技术资料。 已成功分离和传代Lewis大鼠腹主动脉血管平滑肌细胞，已建立大鼠（Lewis→BN）慢性排斥反应的肾或异位心脏移植动物模型，已建立大鼠（Lewis→BN）慢性排斥反应的血管移植动物模型。 本课题组申请者和主要成员熟练掌握了分子生物学、细胞生物学及免疫学的基础理论和实验方法，熟练运用如RT-PCR，原位杂交，蛋白质分离纯化及鉴定，二维凝胶电泳和质谱分析技术，免疫组化，western blot，EMSA，细胞培养，质粒提取，细胞及分子克隆，基因转染等多种实验方法进行相关研究，并在国内、外刊物发表相关论文。 课题组申请者和主要成员熟练掌握了分子生物学、细胞生物学及免疫学的基础理论和实验方法，熟练运用如RT-PCR，原位杂交，蛋白质分离、纯化及鉴定，二维凝胶电泳和质谱分析技术，免疫组化，western blot，EMSA，细胞培养，细胞及分子克隆，基因转染等多种实验方法，并发表相关的研究论文，为本课题的顺利开展和完成打下了坚实的基础。 工作条件 本单位拥有卫生部重点实验室，配备先进的实验仪器和设备，实验所需的仪器设备已基本齐备，如全自动显微注射操作系统、程序冷冻干燥系统、全波长分光光度系统、流式细胞仪、DNA测序仪、荧光显微镜、Bechman 超速离心机、 MegBace 核酸测序仪等分子生物学方面实验仪器，及先进的蛋白质组学研究仪器如 Akata Explorer蛋白纯化系统、双向电泳系统、Vayager-DE STR 质谱仪等，浙江大学拥有性能优良的扫描电镜、透射电镜，并拥有符合SPF条件的动物实验中心，实验所需的试剂均可从国内、外代理商均能提供。因此，已具备完成本研究课题的实验条件。 六、 预期研究结果及其利用研究结果的计划和今后发展的思路 预期研究成果 1. 从离体、整体实验两方面入手，通过分析平滑肌细胞形态结构与分泌功能，证实平滑肌细胞表型的改变（收缩表型→合成表型）和其分泌多种蛋白质参与移植血管硬化过程。 2. 通过分析不同时段的移植血管结构和平滑肌细胞超微结构的改变、及不同时段的平滑肌细胞膜受体、生长因子、细胞外基质蛋白、血管活性物质等的表达情况，初步阐明慢性排斥反应移植物动脉平滑肌细胞迁移的机制。 3. 从离体与整体研究两方面入手，通过双向电泳和质谱分析等蛋白质组学技术分析平滑肌细胞蛋白质表达上的差异，筛选、鉴定与慢性排斥反应移植物血管硬化相关的蛋白质，揭示器官移植动脉硬化的病理生理过程，为今后慢性排斥反应的防治提供新的手段和方案。 4. 中药黄芪具有抑制VSMC的活化与增殖及抗氧化作用，能减轻移植物慢性排斥反应动脉硬化的发生，并且初步阐明其抑制VSMC的活化与增殖作用的靶点，为中药治疗移植物慢性排斥反应提供进一步的理论支持。 5. 有望在国外专业杂志发表2篇有关同种移植慢性排斥反应时平滑肌细胞在移植物动脉硬化中作用的论文，在国内核心期刊发表2篇以上相关论文。 今后发展的思路 利用本课题的实验成果，进一步探讨临床应用的免疫制剂及其他药物或免疫调节因子对器官移植动脉硬化和移植物慢性失功的作用；揭示移植物慢性失功高发和早发的免疫/非免疫学分子基础和作用机理，寻找移植物慢性失功的有效干预或调节措施。为今后慢性排斥时动脉硬化的防治提供新的思路，并最终使其应用于临床，获得人同种肝移植的免疫耐受，减少CsA等免疫抑制剂的用量和毒副作用，以及解决昂贵的治疗费用等一系列问题，为诱导肝移植免疫耐受开拓新的途径。在完成本课题的研究内容后，将申报国家自然科学基金以获得资金资助，使研究工作继续发展，推动我省乃至我国器官移植领域的进步。 七、 参考文献 1. Neuberger J. Liver transplantation. J Hepatol. 2000, 32:198-207. 2. Conraads V, Lahaye I, Rademakers F, et al. Cardiac graft vasculopathy: aetiologic factors and therapeutic approaches. Acta Cardiol. 1998, 53:37-43. 3. Shimizu H, Takahashi M, Takeda S, et al. Mycophenolate mofetil prevents transplant arteriosclerosis by direct inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation.Transplantation. 2004, 77:1661-1667. 4. Häyry P. Chronic rejection: new potential venues of thera