人新基因EOLA1与MT2A相互作用 (2).doc

国家自然科学基金申请书 申请代码： 受理部门： 收件日期： 受理编号： 第 10 页 版本1.004.262 国家自然科学基金 申 请 书 您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:"中" 方法: Word菜单->工具->宏->安全性->安全级,设置为"中" (如果您是Word97用户，继续执行以下步骤) 2)关闭本文档，重新打开本文档 3)点击"启用宏"按钮，即可开始填写本文档或打印了 资助类别： 亚类说明： 附注说明： 项目名称： 申 请 者： 电话： 依托单位： 通讯地址： 邮政编码： 单位电话： 电子邮件： 申报日期： 2006年3月15日 国家自然科学基金委员会 基本信息3YpffSar 申 请 者 信 息 姓名 性别 出生 年月 年 月 民族 学位 职称 主要研究领域 电话 电子邮件 传真 个人网页 工作单位 在研项目批准号 依托单位信息 名称 代 码 联系人 电子邮件 电话 网站地址 合作单位信息 单 位 名 称 代 码 项 目 基 本 信 息 项目名称 资助类别 面上项目 亚类说明 自由申请项目 附注说明 申请代码 C03030308:创伤外科与烧伤外科学 基地类别 成都医学院中心实验室\部门开放 预计研究年限 2007年1月 — 2010年1月 研究属性 基础研究 摘 要 (限400字)：内皮活化相关新基因内皮高表达脂多糖相关因子1（endothelial-overexpressed LPS associated factor1，EOLA1）系2002年发现的人类新基因，初步的研究结果表明该基因的表达和LPS刺激血管内皮细胞有关，可能参与了血管内皮细胞的活化进而引起内皮细胞损伤的过程。阐明疾病相关新基因的功能是后基因组时代的一个重要研究方向。蛋白质相互作用研究是研究基因功能的一个有效途径。我们前期应用酵母双杂交技术发现EOLA1和金属硫蛋白2A（metallothionein 2A）存在相互作用关系。机体内的各种生物学过程最终要靠蛋白质之间的相互作用来完成，存在直接相互作用的蛋白质在功能上往往密切相关，深入研究EOLA1和MT2A的相互作用关系可以进一步了解人类新基因EOLA1的功能及其在内皮细胞活化过程中的功能角色，有助于深入了解内皮细胞的活化机制。 关 键 词(用分号分开，最多5个) 内皮细胞；新基因；蛋白质相互作用；金属硫蛋白 项目组主要成员（注: 项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。） 编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工 每年工作时间（月） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 6 1 3 2 说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。 经费申请表 （金额单位：万元） 科目 申请经费 备注（计算依据与说明） 一.研究经费 21.5000 1.科研业务费 6.0000 （1）测试/计算/分析费 4.0000 实验结果测试及数据处理 （2）能源/动力费 0.5000 水、电，设备磨损 （3）会议费/差旅费 0.5000 学术交流 （4）出版物/文献/信息传播费 0.5000 文献查新、复印、发表论文 （5）其它 0.5000 实验室卫生、垃圾处理等 2.实验材料费 10.0000 （1）原材料/试剂/药品购置费 10.0000 酵母双杂交系统、免疫共沉淀系统、单克隆抗体等试剂 （2）其它 3.仪器设备费 4.0000 （1）购置 4.0000 适当购置小型设备（如凝胶电泳耗材等） （2）试制 4.实验室改装费 1.0000 细胞培养及分子生物实验室维修 5.协作费 0.5000 二.国际合作与交流费 0.0000 1.项目组成员出国合作交流 2.境外专家来华合作交流 三.劳务费 2.5000 四.管理费 1.0000 合 计 25.0000 与本项目相关的 其他经费来源 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配） 其他经费来源合计 0.0000 报告正文 1.立项依据与研究内容 1.1项目的立项依据 大量的研究结果表明血管内皮细胞损伤既是诱发机体发生凝血障碍、休克和多脏器损伤等严重病症的重要因素，又是这些疾病的基本病理改变之一。内皮细胞过度活化引起的失控性炎症反应是血管内皮细胞损伤的病理基础[1]。目前已经知道缺血、缺氧及内毒素等刺激都可以使内皮细胞处于应激状态，但对于内皮细胞的活化及其调控机制还不清楚。内皮活化相关新基因内皮高表达脂多糖相关因子1（endothelial-overexpressed LPS associated factor1，EOLA1）系2002年发现的人类新基因，初步的研究结果表明该基因的表达和LPS刺激血管内皮细胞有关，可能参与了血管内皮细胞的活化进而引起内皮细胞损伤的过程[2]。 阐明疾病相关新基因的功能是后基因组时代的一个重要研究方向。蛋白质相互作用研究是研究基因功能的一个有效途径[3]。我们前期应用酵母双杂交技术发现EOLA1和金属硫蛋白2A（metallothionein; MT2A）存在相互作用，并应用免疫共沉淀技术对其相互作用关系进行了验证。金属硫蛋白是体内比较保守的蛋白质家族，这些蛋白的诱导和表达和机体抗DNA损伤、氧化应激保护及细胞凋亡调控有关。目前的研究表明MT2A还与细胞的增殖分化存在紧密的联系，在多种癌组织中发现MT2A过度表达，MT2A有可能成为新的肿瘤标志物[4]。 机体内的各种生物学过程最终要靠蛋白质之间的相互作用来完成，存在直接相互作用的蛋白质在功能上往往密切相关，深入研究EOLA1和MT2A的相互作用关系可以进一步了解人类新基因EOLA1的功能及其在内皮细胞活化过程中的功能角色，有助于深入了解内皮细胞的活化机制。 近年来蛋白质相互作用研究技术有了长足发展，其中酵母双杂交技术以其简便、灵敏、高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点在基因功能的研究中得到了广泛的应用。以酵母双杂交技术为基础发展起来的高通量生物学技术使得绘制蛋白质相互作用图谱成为可能。 酵母双杂交为蛋白质功能研究提供了巨大帮助，继酵母双杂交之后，人类又发现了RNA干扰现象，为研究蛋白质功能又提供了一有力工具。从2001年《Nature》杂志上首家报道在哺乳动物培养细胞中通过siRNA成功诱导了特异性靶基因表达沉默后，RNA干扰技术就作为一项特异性基因沉默的有效工具从低等生物成功进军哺乳动物领域。2003年Rubinson DA等又在Nature Genetics上报道用病毒系统在原代哺乳动物细胞，干细胞和转基因小鼠上都取得了RNA干扰成功，更大大扩展了这项技术的应用范围[5]。研究者们可以利用这项技术对目标基因进行特异性地表达沉默，通过观察其表达被抑制后细胞以至生物体从形态到各项生理生化的变化，对该基因的功能及参与的信号网络进行研究。这比传统的基因敲除方法要简单而且方便得多，因此短短几年，就有了很多突破性的成果。其中研究得最多的是跟疾病相关的一些基因，不仅对疾病机制及相关代谢网络有了进一步认识，也为基因治疗及药物筛选提供了一些借鉴。充分利用当前蛋白质功能研究技术可以从多方面对一新基因的功能进行探讨，从而为揭示其功能奠定基础。 1.2项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题 1.2.1 研究内容和研究目标 1.2.1.1 EOLA1与MT2A相互作用位点及其在细胞内的共定位情况 　　应用酵母双杂交系统确定EOLA1与MT2A相互作用位点，通过位点基因序列推导出其对应的氨基酸序列，了解其相互作用位点模式，从而为了解EOLA1功能提供信息。利用绿色荧光蛋白载体（EGFP）构建EGFP-EOLA1共表达载体，转染人脐带血管内皮细胞，双抗染色后在激光共聚焦下观察其在细胞内的定位。 1.2.1.2 EOLA1与MT2A的上下游关系 　　应用强制表达技术和RNA干扰（RNAi）技术建立人脐带血管内皮细胞EOLA1强制表达和下调表达模型，分别检测两模型MT2A的表达情况，根据两细胞模型MT2A的表达情况确定EOLA1是否参与调解MT2A的表达。采用同样手段了解MT2A是否参与调解EOLA1的表达。通过上述研究来了解EOLA1和MT2A的上下游关系。 1.2.1.3 EOLA1是否参与了内皮细胞的应激反应过程 用LPS刺激人脐带血管内皮细胞EOLA1强制表达和下调表达模型及未经转染的内皮细胞，应用ELISA技术检测三类细胞相关炎症因子的表达强度，从而推测EOLA1是否参与了LPS激活内皮细胞的过程。 1.2.1.4 EOLA1和MT2A的相互作用和内皮细胞凋亡、分化及增殖的关系 很多文献表明MT2A参与调解细胞周期，与细胞凋亡、分化和增殖关系密切。EOLA1与MT2A存在相互作用，他们之间的相互作用是否参与了细胞凋亡、分化和增殖的调解。 1.2.2 拟解决的关键问题 拟通过本研究明确EOLA1与MT2A之间的相互作用位点和相关作用模式，确定EOLA1是否参与了内皮细胞的应激反应过程，了解EOLA1是否参与了细胞周期的调控，从而为明确EOLA1的功能打下基础。 1.3拟采取的研究方案及可行性分析 技术路线 1.3.1 构建一系列EOLA1截短体融合表达诱饵载体，利用酵母双杂交技术确定EOLA1和MT2A相互作用位点； 1.3.2 构建绿色荧光蛋白EOLA1融合表达载体并转染内皮细胞，双抗染色后在激光共聚焦显微镜下观察EOLA1和MT2A共定位情况； 1.3.3 构建EOLA1和MT2A可控强制表达载体并转染内皮细胞，等剂量LPS分别刺激EOLA1强制表达细胞和正常表达细胞，ELISA检测TNF-α、IL-6等细胞因子的表达情况；同时应用RT-PCR和Western blot技术检测两组细胞MT2A的表达情况； 1.3.4 应用RNAi（RNA干扰）技术，建立EOLA1和MT2A下调表达内皮细胞株，等剂量LPS分别刺激EOLA1下调表达株和正常表达株，检测TNF-α、IL-6等细胞因子的表达情况；同时检测两组细胞MT2A的表达情况； 1.3.5 应用构建的载体分别建立EOLA1下调表达－MT2A正常表达、EOLA1强制表达－MT2A正常表达、EOLA1下调表达－MT2A强制表达、EOLA1下调表达－MT2A下调表达等细胞模型，应用细胞计数和流式细胞仪的方法观察这些模型细胞周期的改变，应用DNA电泳的方法观察细胞凋亡情况。 主要技术路线示意图： （1）MT2A与EOLA1相互作用位点的确定 (2) EOLA1和MT2A共定位 EGFP EOLA1 EGFP-EOLA1融合表达载体 转染 内皮细胞 GFP抗体 MT2A抗体 双抗染色 激光共聚焦观察EOLA1与MT2A定位 (3)RNA干扰模型的建立和相关炎症因子的检测 可行性分析 近年来的大量文献表明酵母双杂交和RNAi是研究基因功能的有效分子生物学技术，为认识人类新基因的功能发挥了巨大贡献，因此应用酵母双杂交和RNAi来研究EOLA1的功能和其相互作用关系从理论上讲是可行的。项目组成员有从事基础研究的经历，各有专长，工作时间有保证，能够满足项目实施的要求。本项目所涉及到的实验试剂均为成熟的商品，实验技术绝大多数为常规分子生物学技术，bbb中心实验室拥有分子生物学实验和细胞培养所需的常规设备，基本上可以满足本课题的需要。对于实验所用到的少数大型实验设备，如激光共聚焦显微镜，可与合作单位实验室协商解决。因此我们的研究方案从理论到实践都是可行的，可以达到预期的研究目标。 1. 4本项目的特色与创新之处 本项目拟研究对象为人新基因EOLA1，以往初步的研究结果证实EOLA1可能参与了内皮细胞的活化，并且和MT2A存在相互作用关系。本项目从MT2A与EOLA1相互作用关系入手，从多个方面、多角度探讨EOLA1可能的功能角色，为全面了解EOLA1的功能奠定基础。 1.5 年度研究计划及预期研究结果 2007年1月-2007年3月 查阅文献、准备开题报告、购买相关试剂、准备实验器材； 2007年4月-2008年3月 构建EGFP－EOLA1融合表达载体，应用GFP和MT2A单克隆抗体双抗染色确定MT2A与EOLA1在细胞内共定位情况；构建系列EOLA1截短体融合表达诱饵载体、完成酵母双杂交实验，确定EOLA1与MT2A相互作用位点； 2008年03月-2008年09月 构建EOLA1和MT2A可控强制表达载体并转染内皮细胞，建立EOLA1与MT2A可控强制表达内皮细胞模型，应用RT－PCR和Western Blot技术检测EOLA1和MT2A的表达情况； 2008年10月-2009年04月 构建EOLA1和MT2A的RNAi载体并转染内皮细胞，建立EOLA1与MT2A下调表达内皮细胞模型，应用RT－PCR和Western Blot技术检测EOLA1和MT2A的表达情况； 2009年5月-2009年09月 应用构建的载体分别建立EOLA1下调表达－MT2A正常表达、EOLA1强制表达－MT2A正常表达、EOLA1下调表达－MT2A强制表达、EOLA1下调表达－MT2A下调表达等细胞模型，应用细胞计数和流式细胞仪的方法观察这些模型细胞周期的改变，应用DNA电泳的方法观察细胞凋亡情况； 2009年10月-2009年12月 整理实验结果，撰写论文。 本研究拟总结4-6篇科研论文，参加全国性学术会议交流，并在国内外重要核心刊物上发表。 参考文献： 1. 2.研究基础与工作条件 2.1工作基础 我们前期的研究表明LPS刺激使EOLA1在人血管内皮细胞株中的表达增强；亚细胞定位研究显示EOLA1为细胞内蛋白，呈全细胞分布，胞核稍多于胞浆；酵母双杂交实验发现EOLA1与MT2A存在相互作用，免疫共沉淀实验验证了EOLA1与MT2A的相互作用关系。目前我们已经构建了EOLA1融合表达诱饵载体－pGBKT7/EOLA1、EOLA1增强型绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-N2/EOLA1、针对EOLA1两个靶点的特异性小干扰RNA表达载体siEOLA1-1和siEOLA1-2，均经过了测序验证。其中我们还转染了siEOLA1质粒到人脐静脉血管内皮细胞株，RT-PCR检测发现siEOLA1-1可以明显降低EOLA1 mRNA的表达。 2.2工作条件 我院中心实验室已有细胞培养室、免疫实验室、分子生物实验室和生化实验室，具有低温高速离心机、梯度PCR仪、水平电泳槽、PAGE电泳仪、电泳转膜仪、凝胶图像分析仪、酶联免疫测定仪、CO2培养箱、倒置显微镜、超低温冰箱、实时荧光PCR仪。可以满足常规分子生物学、分子免疫和细胞培养等实验的要求。 2.3申请人简历 签字和盖章页(此页自动生成,打印后签字盖章) 申 请 者： 依托单位： 项目名称：人新基因EOLA1与MT2A相互作用关系研究 资助类别：面上项目 亚类说明：自由申请项目 附注说明： 申请者承诺： 我保证申请书内容的真实性。如果获得基金资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实和违反规定，本人将承担全部责任。 签字： 项目组主要成员承诺： 我保证有关申报内容的真实性。如果获得基金资助，我将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，加强合作、信息资源共享，认真开展工作，及时向项目负责人报送有关材料。若个人信息失实、执行项目中违反规定，本人将承担相关责任。 编号 姓 名 工作单位名称 项目分工 每年工作时间(月) 签 字 1 2 3 4 5 6 7 8 9 依托单位及合作单位承诺： 已按填报说明对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对研究计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守国家自然科学基金委员会有关规定，督促项目负责人和项目组成员以及本单位项目管理部门按照国家自然科学基金委员会的规定及时报送有关材料。 依托单位公章 合作单位公章1 合作单位公章2 日期： 日期： 日期：