高原世居藏族和移居汉族线粒体蛋白质组的比较研究 (2).doc

报告正文 （一）立项依据与研究内容： 1、 项目的立项依据 1)研究意义 我国是一个高原较多的国家，海拔3000m以上的高原、高山地区占国土总面积的1/6，主要分布在西藏、青海和新疆一带。随着国家西部大开发策略的逐步实施，这些高原地区无疑将成为今后开发的热点。因此，如何使平原人进入高原地区后迅速习服高原低氧环境，提高其生活质量和劳动能力，减少高原病的发生率，就成为目前亟待解决的重要课题。 高原低氧适应机制的研究对于认识高原低氧适应的规律有重要的理论意义，对于降低因习服不良而导致高原病的发生机率具有积极意义。同时，高原低氧适应机制的研究有助于扩展人类活动空间，对于人类更好地征服和利用高原有重要的实践意义，对于我国高原地区的经济和军事建设有巨大的推动作用。 2)国内外研究现状 高原低氧适应是指机体对高原低氧环境产生良好的整体功能的全面适应，而且作为生物学特性固定下来，通过遗传机制传给子孙后代。环境因素和遗传因素对人体的高原低氧适应能力均具有重要的影响。以往的研究多侧重于考察环境因素的作用，对遗传因素的影响研究很少。近年来这一问题引起了国内外学者的高度重视，国外个别实验室已开始着手进行这方面的工作，他们研究的对象主要是北美及南美的高原人群。世居高原藏族人群与其它高原世居人群相比，具有居住高原年代最长和较为封闭的特点，其对高原的适应能力亦明显高于南、北美高原世居人群，是研究人类高原低氧适应机制的极好的遗传学对象。目前有关世居高原藏族人群之高原低氧适应遗传机制的研究寥寥无几，国内研究几近空白，故亟待加强这方面的研究工作，以利于全面认识人类高原低氧适应的机理，为寻求促进移居者习服的措施提供新的线索。 世居高原藏族与移居高原汉族相比，具有更完善的氧运输和氧利用的能力[1,2]。其低氧通气反应能力较强、肺容量大、肌红蛋白浓度高、组织摄氧能力及最大运动能力强、胎儿在宫内发育迟缓少、婴儿出生体重较重、新生儿氧合效率高、肺动脉压和血红蛋白水平非常接近平原人群。藏族和汉族通婚的后代静息通气与藏族相似，而低氧通气反应则下降，提示遗传因素在藏族高原低氧适应机制中可能起重要作用。尽管已经认识到遗传因素涉及氧运输及利用过程的许多环节，但目前尚未能证实并定位待定位基因或基因复合物。 线粒体是机体氧利用的一个关键环节。机体通过呼吸系统和循环系统摄入氧并转运至细胞，最终在线粒体内通过氧化磷酸化作用生成ATP，以供给机体生命活动所需要的能量。机体耗能的90%以上来自于线粒体氧化磷酸化作用，因而线粒体被誉为细胞的“动力工厂”[3]。近年来，大量的研究表明，线粒体还具有多种重要的生理功能[4-7]，包括产生超氧阴离子等活性氧、调节氧化还原电势和细胞氧化还原信号转导、调控细胞凋亡和基因表达等，并在生物的生长、发育、衰老、疾病、死亡及生物进化等研究中都有重要意义，从而构成当前生命科学中的一个新生长点。 线粒体是一个由核DNA(nuclear DNA, nDNA)和线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)共同编码的细胞器[8]。人类mtDNA编码了13个氧化磷酸化相关的多肽(复合体Ｉ的 7个NADH脱氢酶复合体亚基 ND1、ND2、ND3、ND4Ｌ、ND4、ND5和ND6，复合体Ⅲ的 细胞色素ｂ亚基cytb，复合体IV的3个细胞色素C氧化酶亚基COⅠ、COⅡ、COⅢ，复合体Ｖ的2个ATP合成酶亚基ATPase6和ATPase8)，两组rRNA (编码12ＳrRNA和16ＳrRNA)和22个tRNA (编码20种tRNA)。线粒体拥有相对独立的DNA复制、转录和翻译系统，是半自主性细胞器。 由于线粒体是动物中唯一含有DNA和蛋白质合成系统的细胞器，是氧传送链的生理终点站，是细胞氧耗的主要位点，是一个细胞氧易感性和适应的自然选择者，因此关于线粒体适应(mitochondrial adaptation)的研究正在展开。我们的研究发现，线粒体结构和功能的改变是动物习服低氧环境的一个重要机制[9-12]。急性缺氧可以抑制mtDNA转录和翻译，损害线粒体的结构和功能，而慢性缺氧时线粒体损伤得到一定程度的恢复，细胞内线粒体数量增加，使长期暴露于低氧环境中的动物逐渐取得低氧习服。青藏高原世居藏族在高原低氧环境下已经生活了50万年之久[13]，且由于历史上青藏高原地理环境的封闭性和藏族婚俗的对外隔离性，其遗传学特性可以很好地保存下来。我们推测，世居高原藏族线粒体对于低氧环境的适应性改变可能通过自然选择的作用固定下来，并由此获得了较其他高原世居人群和移居人群更好的对高原低氧环境的适应能力。不过，对于线粒体的研究多在实验动物上进行，而关于高原世居者线粒体结构和功能的研究更显匮乏。虽然藏族mtDNA没有表现出与其他种族相异的特性[14]，但我们知道，mtDNA仅仅编码了线粒体氧化磷酸化酶复合物的20%，其余80%的氧化磷酸化酶复合物、大量的结构蛋白、离子通道、信号蛋白和活性因子等均由nDNA编码，关于这些nDNA编码蛋白在世居高原藏族低氧适应机制中的作用以及mtDNA和nDNA编码蛋白之间的协调作用亟待研究。以前的研究多从已知蛋白着手，观察其在低氧适应过程中的变化。但是，由nDNA编码的线粒体蛋白约有1000~2000种[15]，并且不断有新的蛋白被发现。这些nDNA编码蛋白通过跨膜转运机制进入线粒体，通过多种反应途径参与低氧反应，若用逐一比较的研究方法来筛选低氧适应反应中的关键蛋白无疑犹如大海捞针，事倍功半。因此，我们尝试对世居高原藏族和移居高原汉族线粒体蛋白进行全面鉴定，通过比较两者线粒体蛋白表达谱的差异，以期更深入了解世居高原藏族高原低氧适应的机制。蛋白质组技术为实现这一研究思路提供了一个有力的工具。 蛋白质组技术是从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域。 随着现代质谱技术的进步和蛋白质组信息学的兴起，蛋白质高通量鉴定已经成为可能。由于蛋白质组技术在蛋白鉴定等许多方面的研究中具有无可比拟的优势，目前正被广泛地应用到许多领域的前沿性研究中。线粒体是一种相对独立的细胞器，易于高度纯化以用于蛋白阵列，且线粒体蛋白与细胞总蛋白相比，其数量有限，是进行蛋白质组研究的理想对象。目前国外已经建立了线粒体蛋白质组研究和线粒体蛋白鉴定的方法[16-18]，为我们比较研究世居高原藏族和移居高原汉族线粒体蛋白质谱奠定了基础。 为了深入认识世居高原藏族线粒体的分子组成及其在高原低氧适应机制中的作用，本研究拟采用蛋白质组技术，鉴定世居高原藏族线粒体的蛋白质谱，并将之与移居高原汉族相比较，从而从蛋白质水平揭示人类高原低氧适应机制。在本研究中，预期可能发现一些具有新蛋白序列的未知分子，还可能找到一些已知分子，但目前尚未阐明其在线粒体低氧反应中的作用。找到新分子或发现已知分子的未知功能，都将为我们进一步深入揭示人类高原低氧适应的分子遗传机制、更深入了解线粒体功能及其调控提供新的线索。 参考文献： 1. Moore LG, Armaza F, Villena M, et al. Comparative aspects of high-altitude adaptation in human populations. Adv Exp Med Biol. 2000; 475: 45-62 2. Moore LG. Human genetic adaptation to high altitude. High Alt Med Biol. 2001; 2(2): 257-279 3. Scheffler IE. Mitochondria. New York, NY: wiley-Liss; 1999 4. Melov S. Mitochondrial oxidative stress: physiologic consequences and potential for a role in aging. Ann N Y Acad Sci. 2000; 908: 219-225 5. Green DR, Reed JC. Mitochondria and apoptosis. Science. 1998; 281: 1309-1312 6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R, et al. mitochondria and cell death: mechanistic aspects and methodological issues. Eur J Biochem. 1999; 264: 1-16 7. Kagan VE, Tyurina YY. Recycling and redox cycling of phenolic antioxidant. Ann N Y Acad Sci. 1998; 854: 425-434. 8. Schon EA. Mitochondrial genetics and disease. Trends Biochem Sci. 2000; 25: 555-560. 9. 高文祥; 柳君泽; 吴利平等 低氧大鼠脑线粒体体外转录活性的研究　中国应用生理学杂志 2001; 17: 323-326 10. 柳君泽; 高文祥; 蔡明春等　大鼠脑线粒体生物大分子合成过程中能量需求的研究　第三军医大学学报 2001; 23(12): 1414-1417 11. 高文祥; 柳君泽; 吴利平等 急、慢性缺氧对大鼠脑线粒体能量代谢的影响 中国病理生理学杂志2000; 16: 879-882 12. 蔡明春，柳君泽，吴利平等，急慢性低氧对大鼠脑线粒体蛋白翻译合成的影响　中国病理生理学杂志 2002; 18: 1038-1041 13. Morpurgo GP, Arese P, Bosia A, et al. Sherpas living permanently at high altitude: a new pattern of adaptation. Proc Natl Acad Sci USA. 1976; 73: 747-751 14. Torroni A, Miller JA, Moore LG, et al. Mitochondrial DNA analysis in Tibet: implications for the origin of the Tibetan population and its adaptation to high altitude. Am J Phys Anthropol. 1994; 93: 189-99. 15. Lopez MF, Kristal BS, Chernokalskaya E, et al. High-throughput profiling of the mitochondrial proteome using affinity fractionation and automation. Electrophoresis 2000; 21: 3427-3440 16. Taylor SW, Warnock DE, Glenn GM, et al. an alternative strategy to determine the mitochondrial proteome using sucrose gradient fractionation and 1D PAGE on highly purified human heart mitochondria. Journal of Proteome Research 2002; 1: 451-458 17. Taylor SW, Fahy E, Zhang B, et al. Characterization of the human heart mitochondrial proteome. Nature Biotechnology. 2003; 21: 281-286 18. Wzawa T, Sako Y, Sato M, et al. a genetic approach to identifying mitochondrial proteins. Nature Biotechnology. 2003; 21: 287-293 2、 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。 1)研究目标： 建立世居高原藏族和移居高原汉族骨骼肌线粒体的蛋白质谱，质谱鉴定并分析二者组成成分的差异，从线粒体蛋白的水平揭示人类高原低氧适应机制，为我们深入揭示人类高原低氧适应的分子遗传机制、更深入了解线粒体功能及其调控提供新的线索。 2)主要研究内容： 1) 对比研究青藏高原世居藏族和移居汉族骨骼肌线粒体蛋白质谱，找出其差异蛋白点； 2) 差异蛋白点的鉴定：质谱分析获得肽指纹图谱及部分氨基酸序列，属性化数据库比对得到蛋白质分子信息； 3) 辅助动物实验和细胞培养对新分子的生化和功能进行初步鉴定。 3)拟解决的关键问题： 1) 建立蛋白质组学技术平台，获得线粒体蛋白良好的阵列图谱； 2) 实现多个蛋白质点的鉴定； 3、 拟采取的研究方案及可行性分析。 1)技术路线: (见图一) 制备高纯度线粒体样品 线粒体蛋白进行凝胶电泳 蛋白点表观分子量 肽脂纹图谱、 部分氨基酸序列测定 数据库搜索 获得已知或未知的蛋白序列 分子生物学和功能实验进一步鉴定新分子 骨骼肌样品 世居高原藏族　　　　移居高原汉族 图一 技术路线 蔗糖溶液梯度离心 分层收集蛋白组分 蛋白质在胶消化 凝胶染色、图像分析 2)研究方法和研究内容： 第一部分　标本采集 ① 志愿受试者分为两组：A.世居高原藏族组；B.移居高原汉族组。世居高原藏族组为世代居住3000m以上高原的藏族，未到过平原地区；移居高原汉族组为世代居住平原地区的汉族，移居高原1年以上，对高原低氧环境已取得良好习服。两组受试者在性别、年龄、身体条件等方面均良好匹配。 ② 在海拔3658m高原（拉萨）收集世居高原藏族和移居高原汉族活体腓肠肌标本，迅速放入冰冷的匀浆介质中，剪碎，匀浆。 ③ 4℃离心1500g×5min两次，取上清。4℃离心8000g×15min两次，沉淀即骨骼肌线粒体粗提物。 第二部分　线粒体纯化 ① 超高速不连续梯度离心纯化线粒体：线粒体粗提物用MSHE介质悬浮，铺在6%Percoll配制的35%/17% 泛影葡胺溶液上，用SW40转子4℃离心19000rpm×45min，收集35%/17%界面的线粒体层，用MSHE介质洗一次，沉淀用MSHE介质悬浮。 ② 线粒体蛋白定量。 ③ 线粒体鉴定：用Western blot方法。用抗actin、dynamin II、KDEL和LAMP1的单克隆抗体检测以排除来自胞浆、细胞膜、内质网和溶酶体的污染；用抗呼吸链成分的单克隆抗体混合物检测以鉴定线粒体完整性。 第三部分　凝胶电泳 ① 蔗糖梯度离心：提纯的线粒体加入1% n-十二烷基-β-D-麦芽苷，冰上孵育25min，用SW40转子4℃离心14000rpm×20min，沉淀用液氮速冻后-80℃保存，上清调蔗糖浓度至5%用于蔗糖梯度离心。蔗糖梯度为35%、32.5%、30%、27.5%、25%、22.5%、20%、17.5%、15%和10%，用SW40转子4℃离心38000rpm×16.5hr，收集各层线粒体蛋白，液氮速冻后-80℃保存。 ② 用4-12% NuPAGE预制胶电泳阵列线粒体蛋白。 ③ 鉴定蛋白分布：用Western blot方法，用抗呼吸链成分的单克隆抗体混合物检测以鉴定各层蔗糖梯度样品中的线粒体蛋白分布。 ④ 染色，图像采集，匹配分析、比较世居高原藏族和移居高原汉族线粒体蛋白质谱的差异。 第四部分 蛋白质的鉴定 重点为世居高原藏族和移居高原汉族差异表达的蛋白点。 ① 蛋白在胶消化：从胶上取下蛋白点，ACN脱水两次，重复再水化和脱水1次，加入含12.5ng/μl 的测序级胰蛋白酶37°C消化16hr，回收消化液。 ② 质谱分析获得肽指纹图谱及部分氨基酸顺序 ③ 数据库检索：将肽指纹图谱、部分氨基酸顺序及分子量等参数提交蛋白质属性化数据库进行搜索，鉴定蛋白点。 第五部分 分子生物学方法和功能实验初步鉴定感兴趣的目的蛋白 ① 克隆鉴定出的新分子的完整cDNA，用RT-PCR和Northern blot方法检测该分子mRNA表达，观察其在世居高原藏族和移居高原汉族骨骼肌细胞中表达量的差异。 ② 对于筛选出的已知分子，则根据不同分子的自身特点，辅助动物实验和细胞培养，进一步探讨该分子参与高原低氧适应的可能机制。 3)可行性分析： ① 申请者所在实验室长期从事高原生理和缺氧的病理生理研究，与高原地区的研究单位建立了长期友好的合作关系，可保证本实验所需的高原现场工作顺利进行； ② 本研究选取人体骨骼肌作为研究对象，是较易取得的人体活体标本，研究所需标本能够保证获得； ③ 本实验所需方法均为成熟可靠的分子生物学方法。申请者所在实验室已进行部分前期实验，初步建立了稳定的骨骼肌线粒体提取和蛋白质组研究的方法； ④ 申请者所在实验室具备蛋白质组研究中所需的全部上、下游仪器设备，包括不同型号的垂直板电泳系统、图像捕捉设备、液-质联用分析仪、二维图像分析软件等，学校中心实验室有Beckman低温超高速离心机可供利用，能够保证所有指标的测试； ⑤ 本研究所需的分子生物学试剂和抗体均有巿售，电泳所需的NuPAGE可购买Invitrogen公司的预制胶，能够大大减少工作量，提高蛋白阵列的效果和重复性； ⑥ 申请者已获得医学博士学位（病理学专业），具有扎实的缺氧病理生理学理论知识，了解国内外发展动态，掌握了病理生理学、分子生物学、细胞生物学及生物化学的基本实验技能。申请者在攻读硕士和博士学位期间致力于研究缺氧对线粒体转录功能的影响和比较研究青藏高原世居藏族和移居汉族缺氧诱导因子-1表达，本研究为以往研究的延续，有很好的研究基础，有能力完成全部内容。 4、 本项目的特色与创新之处。 1） 高原低氧遗传性适应机制是高原低氧适应性研究的重要方向。环境因素和遗传因素对人体对高原低氧环境的适应能力均有重要的影响。以往的研究多侧重于考察环境因素的作用，而本研究则从遗传因素的角度探讨高原低氧适应机制。 2） 世居高原藏族居住高原时间长，相对较为封闭，其对高原低氧环境的适应能力亦明显高于其他高原世居人群和移居人群，是研究人类高原低氧适应机制的极好的遗传学对象。本研究以世居高原藏族作为研究对象，以之与移居高原汉族相比较，结果具有说服力，无疑将为深入了解高原低氧遗传性适应的机制提供新的理论和实验依据。 3） 目前关于世居高原藏族低氧适应的研究多停留在生理表型的水平，对其分子遗传机制研究很少。本研究利用先进的蛋白质组研究方法和策略，从比较研究已取得良好高原适应和对高原适应不良的不同种族的遗传因素入手，在蛋白质水平深入探讨世居高原藏族低氧适应的分子遗传机制。 4） 以前的研究多是从已知的蛋白着手，观察其在低氧适应过程中的变化，但用这样的方法来筛选世居藏族低氧适应反应中的关键蛋白无疑犹如大海捞针，事倍功半。本研究拟对世居高原藏族和移居高原汉族线粒体蛋白进行全面鉴定，通过比较两者线粒体蛋白表达谱的差异，以期更深入了解世居高原藏族低氧适应的机制。 5） 本研究拟采用蔗糖梯度离心＋1D-PAGE的方法阵列线粒体蛋白，这种方法和常用的2D-PAGE方法相比，其工作量有所减轻，而蛋白阵列效果更好。 5、 年度研究计划及预期研究结果。 1）年度研究计划： 2004.01~2004.06 实验准备（包括试剂订购、方法建立与完善、小型实验设备的制备等），及部分预实验 2004.07~2004.12 世居高原藏族和移居高原汉族骨骼肌线粒体制备 2005.01~2005.12 蛋白电泳，获得高质量的世居高原藏族和移居高原汉族骨骼肌线粒体蛋白质谱 2006.01~2006.09 差异蛋白点的质谱鉴定和新分子的功能鉴定 2006.10~2006.12 总结资料，撰写论文 2）预期研究结果： ①得到世居高原藏族和移居高原汉族骨骼肌线粒体良好的蛋白质谱； ②鉴定出一定数量的世居高原藏族和移居高原汉族骨骼肌线粒体差异表达的蛋白质组分，其中可能包括一些未知新分子； ③成果以论文形式表达，在国内核心刊物上发表3-5篇文章，在国外有影响的刊物上发表2-3篇。 （二）研究基础与工作条件 1、 工作基础 申请者所在研究室长期从事高原生理和缺氧的病理生理学研究。数十年来从整体、器官和细胞层次上对高原缺氧的病理生理变化和机制进行了深入系统的研究，并比较研究了世居高原藏族与移居高原汉族在呼吸、循环和血液系统等方面的功能差异，先后获得国家科技进步三等奖一项、军队科技进步二等奖四项。另外，我室承担了国家自然科学基金重点项目“缺氧习服-适应机制”的研究工作，着重观察了缺氧时循环系统、呼吸系统和能量代谢的适应性反应。在上述项目的研究过程中，已建立了稳定的缺氧实验模型，实验条件和设施完备。 申请者在攻读硕士和博士学位期间致力于研究缺氧对线粒体转录功能的影响和比较研究青藏高原世居藏族和移居汉族缺氧诱导因子-1表达，本研究为以往研究的延续。申请者所在实验室已进行部分前期实验，建立了稳定的骨骼肌线粒体提取和蛋白质组研究的方法，有能力胜任本课题的全部研究工作。 2、 工作条件 1） 本研究室拥有条件完备的分子生物学实验室，具备蛋白质组研究中所需的全部上、下游仪器设备，包括不同型号的垂直板电泳系统、图像捕捉设备、液-质联用分析仪、二维图像分析软件等。 2） 学校中心仪器室可提供强有力的支持，包括Beckman低温超高速离心机等设备。 3） 所需试剂、抗体、蛋白凝胶电泳所用的NuPAGE等有市售；对于研究中所需的蛋白质分析可利用Internet网上资源。 本实验所用实验方法已初步建立。技术人员训练有素，工作条件能得到充分保证，能按期完成本项目研究任务。