壳聚糖载体固定化高效亚油酸异构酶及其酶学特性的研究 (2).doc

ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书( 2005版) 第3页 同行评议组别 食品（农产品、水产品）加工与储藏 项目编号 Y305315 浙江省自然科学基金 申 请 书 申报类别: 一般项目 项目名称: 壳聚糖载体固定化高效亚油酸异构酶及其酶学特性的研究 申 请 者: 桑卫国 电 话: 0574 87835957 依托单位: 宁波大学 通信地址: 浙江省 宁波市 镇宁路 宁波大学 66信箱 邮政编码: 315211 E-mail : sangweiguo@ 申报日期: 2005-5-27 浙江省自然科学基金委员会 二OO五年制 基本信息 申请者信息 姓 名 桑卫国 性别 男 出生日期 1955年10月18日 最终学位 硕士 获学位年份 1987 职称 副教授 主要研究领域 食品微生物学，新型生物活性物质研制，饲料与饵料加工新技术。 E-mail sangweiguo@ 电 话 0574 87835957 个人网页 依托单位 宁波大学 证件类型 身份证 证件号码 310110551018011 申请者是否近三年调入在浙单位工作 否 调入时间 申请者曾主持的浙江省自然科学基金资助项目编号: 申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限: （无） 项目基本信息 项目名称 壳聚糖载体固定化高效亚油酸异构酶及其酶学特性的研究 申报类别 一般项目 研究属性 支撑性应用基础研究 同行评议组别 农业科学及生物技术/食品（农产品、水产品）加工与储 依托基地名称 宁波市海洋生物工程重点实验室---宁波大学 预计研究年限 2006年01月－2007年12月 总经费预算 6.0万元 申请经费 6.0万元 项目研究目标、内容和意义简介(限400字) 共轭亚油酸是亚油酸位置和几何异构体，具有抗癌，抗氧化，抑制脂肪积累等许多重要生理作用。本课题将嗜酸乳杆菌菌丝中的共轭亚油酸高效异构酶分离、纯化，用无毒、堆积密度小、比表面大的壳聚糖作为载体将该酶固定化后，在无溶剂体系中直接将亚油酸转化为共轭亚油酸。本研究的目标为酶法清洁化生产富含共轭亚油酸的植物油。含70-85%共轭亚油酸的葵花籽油胶囊国际市场价约为每盒15美元(规格: 30粒/盒; 每粒含共轭亚油酸600毫克)。本课题成果具有能将植物油增值几百倍的潜力。本课题的研究为国内外首创并使我国的共轭亚油酸应用研究处于国际先进水平。因此，本课题的研究成果对实现酶法转化亚油酸为共轭亚油酸的产业化，促进浙江省绿色化工产业的建立与发展和提高人民生活的质量有重大的意义，并能促进我省的水产品和蚕丝业的综合利用的发展，有利于环境保护和经济的可持续发展，产生巨大的社会效益和经济效益。 关键词（不超过4个） 壳聚糖；共轭亚油酸；固定化；亚油酸异构酶 同行评议分组说明 食品加工的副产品加工与利用 重点资助方向 农业资源产业生物技术研究 申请书版本号：73089175 项目组主要成员 编号 姓名 出生日期 性别 职称 学位 单位名称 电话 项目分工 每年工作时间（月）（（(月) 1 桑卫国 1955年10月18日 男 副教授 硕士 宁波大学 0574 87835957 负责人 10 2 吴祖芳 1963.04.15 女 副教授 博士 宁波大学 0574 87600155 酶特性研究 6 3 苏秀榕 1956.06.05 女 研究员 学士 宁波大学 13566012182 酶固定化 3 4 董明敏 1963.08.28 女 实验师 学士 宁波大学 13362844178 生产优化 4 5 王静 1980.03.15 女 助教 学士 宁波大学 13586826221 数据处理 3 6 7 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 参加单位数 5 3 1 1 0 0 0 1 说明：1.个人介绍部分申请者必须填写，其他人员可以不填写； 2.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成； 3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。 ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005版） 第11页 个人介绍： 桑卫国：项目负责人：桑卫国，副教授，硕士研究生导师；1987年研究生毕业于上海水产大学食品工程专业，并获硕士学位；有多年的从事食品科学与工程的教学和科研工作经验，1998.3-1999.6美国俄亥俄州大学食品科学与技术系高级访问学者；在生化工程、技术经济等方面具有较好的研究基础；作为项目负责人受省教委、宁波大学青年基金等的资助已于1998年起就开始研究生物合成CLA，并成功地进行了小试规模的CLA制备。近年来主持和参加省、部级项目11项，其他项目5项。3篇论文获浙江省自然科学优秀论文奖（二等奖：2篇；三等奖1篇）。主要学术论著： 在《水产学报》、《中国食品学报》、《J. Zhejiang University》等国内外SCI.，一级期刊发表学术论文5篇，其它期刊10余篇. 具有承担和完成重点科研项目的经验和组织管理能力。 发表的主要论文 1 WG Sang, Z Jin. LIPID OXIDATION OF FISH LIVER OIL AS AFFECTED BY LIGHT,ANTIOXIDANTS AND TEMPERATURE LIPID OXIDATION OF FISH LIVER OIL AS AFFECTED BY LIGHT,ANTIOXIDANTS AND TEMPERATURE. J．OF FOOD PROCESSING AND PRESERVATION. 2004,28(1): 1-9. （SCI） 2 桑卫国，丁玉庭. 异构化菜油中共轭亚油酸的紫外分光光度法的定量[J]. 浙江工业大学学报，2004，32（5）：565-568. 3 SANG Weiguo, WU Zufang. Preparation Tech.&Determination of Rapeseed Oil with Rich CLA[J]. J. Ningbo University, 2005,18(1):49-51. 4 WG Sang，Zhonglin Jin 等. Studies on Effect of Temp,Light & Antioxidant on Photooxidation of Fish Liver Oil[J]. 2001 IFT Annual Meeting, ISSN1082-1236 5 WG Sang，Zhonglin Jin 等. Extraction & its Partial Characterization of Pigments from Prawn Shell[J]. 2002 IFT Annual Meeting, ISSN1082-1236 主持过的主要科研项目目录 项目名称 项目编号 经费额度(万)经费来源 起止年月 天然色素虾青素在水产养殖中应用研究2002183 1.0农业部重点实验室2002.5-2003.12 菜油清洁化制备共轭二烯亚油酸油 20010242 1.0 浙江省教委 2001.7-2002.12 菜油制备共轭二烯亚油酸营养油 2001417 0.6 宁波市教育局 2001.12-2003.11 生物转化法生产共轭亚油酸新工艺研究2003017 10.0 市科技局 2003.3-2006.3 共轭亚油酸的研制 0013003 0.45 宁波大学 2001.1-2001.12 吴祖芳：工学博士，副教授，1987年以来一直从事微生物工程、食品微生物、食品酶学及食品化学等方面的教学与科研工作；2004年4月获得江南大学生物工程学院发酵工程专业博士学位，2000.9~2003.12期间在江南大学工业生物技术教育部重点实验室从事微生物发酵制药方面的研究并完成博士论文。主持完成乳酸菌发酵技术、乳酸菌在农产品深加工中的应用研究课题，通过多年的科研实践，已在微生物菌种选育、发酵过程优化与控制、酶学分析及生物工程下游技术等方面研究中积累了较丰富的经验和掌握了较先进的实验技术；在SCI、EI、国内一级学报及中文核心等刊物上发表科研论文30多篇，申请发明专利二项。目前项目负责人为宁波大学优秀中青年骨干教师，硕士研究生导师。 申请经费预算 6.0 万元 计划开支项目名称 计算根据及理由 金额（万元） 1．信息费 科技查新，文献检索 0.5 2．专题学术活动费 举办学术活动，参加学术会议等 0.4 3．仪器和设备购置费 GC色谱专用柱，HPLC色谱柱，滴定仪、小型器材 2.6 4．能源材料费 试剂、药品费用（标准品和标准酶） 1.7 5．计划管理费 单位规定费用 0.3 6．人员费 经单位批准的临时用工劳务费 0.5 注：开支范围和标准参见《浙江省省级科技项目经费管理暂行办法》（浙财教字[2002]20号）。 申请者承诺： 我保证： （1）申请书内容是真实的； （2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则； （3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作； （4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限； （5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。 若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。 签字： 日期： 项目依托单位承诺: 已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。 依托单位公章 日期 . 壳聚糖载体固定化高效亚油酸异构酶及其酶学特性的研究 1. 课题研究意义 共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是亚油酸（linoleic acid，LA）位置和几何异构体，是一组不饱和键位置（c8,c10;c9,c11;c10,c12;c11,c13）和几何（cis,cis;cis,trans;trans,cis;trans,trans）异构体的18碳共轭二烯脂肪酸的统称[1]。1986年首次发现CLA可抑制皮肤癌[2]，随后又发现其许多重要生理作用：抗癌；抗氧化；降低胆固醇；促生长因子；抑制脂肪积累；防治糖尿病；抗粥状动脉硬化；改善骨组织代谢；提高饲料效价；防霉等[3，4]。目前，人体必需脂肪酸CLA在医药保健、食品、饲料等方面的应用潜力受到越来越多的关注[5]。上海大学正在进行一项“CLA作为国家二类新药的研究”的课题研究。 世界上CLA的工业化生产现在均采用化学法。常用的为碱性异构化方法[6-7]：把含LA的原料溶解于有机溶剂中，在氮气保护、加热及强碱存在下使LA异构化为CLA。此法优点是工艺较简单，转化率可达80%以上；缺点是得到一系列具有位置和几何异构的CLA混合物，还存在着环化等副反应，并且产生大量的废水和废气，对环境的压力很大，难以持续发展。 自然界中许多生物具有转化不饱和脂肪酸的能力，国内外已有多家科研教学机构竞相开展此方面的研究[8-9]，其中嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）具有较高的将LA转化为CLA的异构化酶的生物活性，该LA异构酶为胞内酶[10]。目前该原始菌株发酵液中CLA生成量最高为300μg·ml-1，即CLA最高含量约为0.03%（w/w）[11]。迄今，对嗜酸乳杆菌的生物转化的作用机制及提高CLA产量的影响因素缺乏系统研究，难以指导生产和从本质上提高CLA的生产能力。微生物发酵法生产CLA，在发酵液中CLA含量太低，且要用大量的有机溶剂将CLA从水溶性的发酵液萃取出来，再经过分离、提纯等许多下游工序，生产成本高，对环境的压力很大。 本课题针对上述特点，将嗜酸乳杆菌菌丝中的CLA高效异构酶分离、纯化，用无毒、堆积密度小、比表面大的壳聚糖(由虾壳/蚕蛹皮制得)作为载体将该酶固定化后，在无溶剂体系中直接将LA转化为CLA。本研究的目标为酶法清洁化生产富含CLA的植物油。含70-85%CLA的葵花籽油胶囊美国市场价为每盒15.50美元(规格: 30粒/盒; 每粒含CLA600毫克)；在欧洲市场，其同样规格的CLA产品价格为13-16欧元。本课题成果具有能将植物油增值几百倍的潜力。 21世纪的浙江省生物医药产业将伴随知识经济的崛起而成为令人瞩目的产业。从2005年度浙江省自然科学基金申请指南中得到信息，生物工程与现代医药作为浙江省具有一定产业基础和产业关联度大的领域之一，从而确立了现代生物医药产业在我省经济发展中的地位。本课题的研究为国内外首创并使我国的CLA应用研究处于国际先进水平。因此，本课题的研究成果对实现酶法转化LA为CLA的产业化，促进浙江省绿色化工产业的建立与发展和提高人民生活的质量有重大的意义，并能促进我省的水产品和蚕丝业的综合利用的发展，有利于环境保护和经济的可持续发展，产生巨大的社会效益和经济效益。 2. 课题研究目标与申请者研究工作长期目标的关系 本课题将经筛选得到的高产CLA嗜酸乳杆菌菌株中的LA异构酶分离、纯化，用经过修饰与改性的壳聚糖作为载体将该酶固定化后作为催化剂，将富含LA的食用油在无溶剂体系中直接转化为CLA油；对CLA形成的关键酶——固定化LA异构酶的诱导机制、酶作用模式和酶动力学分析，阐明CLA形成的酶调控机制；确定在无溶剂体系中LA异构酶生产CLA的最佳反应条件。 申请者研究该领域的长期目标为采用生化工程新技术将实验室的成果产业化。在生物转化法生产CLA的研究方面，本课题组已积累了相当的经验，取得了不少实验室成果。本课题针对现实存在的原始菌株发酵液中CLA最高含量低得只有0.03%（w/w）问题，设计了一条全新的技术路线，有望进一步揭示高产CLA的反应模式，从而为CLA的酶法工业化生产或高效LA异构酶的基因工程及分子生物学研究提供重要的理论基础。 3. 课题研究内容，研究方案和进度安排 研究内容： （1）LA异构酶的制备。 （2）LA异构酶的酶学特性研究，重点为水分活度与酶促异构化反应的关系并求出LA异构酶的最小临界水分活度。 （3）LA异构酶的固定化。 （4）固定化LA异构酶的酶学特性研究。 （5）确定在无溶剂体系中固定化LA异构酶的高产条件。 研究方案： 研究有关方法与手段，技术路线主要按如下简要过程进行： （1） LA异构酶的制备：将嗜酸乳杆菌于添加LA的MRS培养基中培育；离心分离发酵液得到嗜酸乳杆菌菌丝；溶菌酶破壁、超声波破碎和/或低温破碎新技术进行处理、再用高速冷冻离心、盐析、过滤、层析或电泳等方法分离纯化LA异构酶。 （2） LA异构酶的酶学特性研究：分析LA异构酶产CLA的代谢途径及酶系构成；探讨CLA形成的关键酶的诱导机制、酶作用模式；通过测定LA异构酶反应的最小临界水分活度、最适反应pH值、最适反应温度阐明CLA形成的酶调控机制；研究酶的动力学参数等。 （3） LA异构酶的固定化：将不同分子量的壳聚糖进行修饰与改性，以酶活力回收率和稳定性为指标应用正交试验法获得固定化高产CLA的异构酶。 （4） 固定化LA异构酶的酶学特性研究：测定该固定化酶的最适反应pH值、最适反应温度；根据不同含量LA的植物油为底物时该酶的反应初速度，求得反应动力学常数，确定该酶异构化反应的数学模型。 （5） 确定固定化LA异构酶的高产条件：以固定化LA异构酶为可重复使用的生物催化剂，在无溶剂体系中考察不同的pH、温度、金属离子对异构化反应速度的单因素影响，再应用正交试验法确定高产CLA的反应条件。 关键技术： （1）将不同分子量的壳聚糖进行修饰与改性作为载体，用正交试验法制备固定化高产CLA的异构酶。 （2）通过测定LA异构酶反应的最小临界水分活度、最适反应pH值、最适反应温度阐明CLA形成的酶调控机制、LA异构酶的酶学特性及其作用模式。 （3）应用正交试验法确定在无溶剂体系中酶法高产CLA的工艺条件。 进度安排： 工作安排 2006.1. 2006.6. 2006.12. 2007.6. 2007.12 LA异构酶的制备 ━━━━████ LA异构酶的酶学特性研究 ━━━━━━━━ ██ LA异构酶的固定化 ━━━━━━━ ██ 固定化酶的酶学特性研究 ━━━━━━━━██ 确定固定化酶的高产条件 ━━━━ 全面总结、并结题 ━━━ 4、课题创新之处 （1）国内外首次壳聚糖作为载体固定化LA异构酶，既拓展甲壳素的用途又使得LA异构酶可重复且连续使用。 （2）国内外首次通过测定LA异构酶反应的最小临界水分活度、最适反应pH值、最适反应温度阐明CLA形成的酶调控机制、LA异构酶的酶学特性及其作用模式。 （3）国内外首次采用固定化LA异构酶在无溶剂体系中用直接将LA转化为CLA。与传统的反应体系相比，本体系可在较小的反应体积中得到高收率的产物、无溶剂污染、省略了产物用有机溶剂萃取分离的工序，有利于大规模低成本生产。 5、工作基础与工作条件 与本课题有关的研究工作积累： 本课题组人员长期从事食品微生物学、食品发酵、生化工程、化工设备、食品资源的深度开发与利用等方面的教学与科研工作。特别是，已完成与本课题有关的课题有：浙江省教委“菜油清洁化制备共轭亚油酸营养油”、市科技局“生物转化法生产共轭二烯亚油酸新工艺研究”、学校青年基金“共轭亚油酸的研制”、省重大科技攻关项目(省长基金)“高品质壳聚糖生产新工艺及其产业化研究”等课题。正在进行的与本课题有关的项目有：市博士科学基金“嗜酸乳杆菌发酵生产共轭亚油酸的酶调控机制及其合成机理”；与本研究相关论文和成果十多项。 本单位设有省级重点扶植学科、省级重点实验室，市级重点实验室，具有微生物发酵、生物化学和分子生物学的分离、提取、分析检测的专门实验设备等，这些都为本研究课题的顺利实施提供了保证。 已有的主要仪器设备：超净工作台，万能显微镜，电子显微镜，培养摇床，全自动发酵罐；超声波细胞破碎仪，高速冷冻离心机，数控层析冷柜，电泳分析仪，紫外可见分光光度计，气相色谱仪，HPLC仪，GC-MS仪，酶标仪等，现有设备能基本满足实验的需要。 6、预期研究结果及其利用研究结果的计划和今后发展的思路 （1） 本课题有望揭示高产CLA的反应模式，从而为CLA的酶法工业化生产或高效CLA异构酶的基因工程及其分子生物学研究提供重要的理论基础。 （2） 申请国家发明专利2项，完成研究报告1篇 （3） 本项目研发的成果可用于生产具保健与药理功能的CLA产品，制备各种胶囊或用于保健、功能因子添加剂等，可全球应用，因而具有很大产业前景和应用意义。今后拟通过科技创业资金的资助渠道使得该成果的产业化研究工作继续发展。 7、参考文献 1 刘晓华，曹郁生，陈燕. 微生物生产共轭亚油酸的研究[J]. 食品与发酵工业，2003，29（9）：69-72. 2 Ha Y L, Grimmo N K, Pariza M W. Anticarcinogens from ground beef: Heat­altered derivatives of linoleic acid[J]. Carcinogenesis, 1987, 8:1881-1887. 3 刘家仁，陈炳卿，薛英本等. 共轭亚油酸对人乳腺癌细胞生长的抑制作用[J] 中华预防医学杂志，2001,35（4）：244-247. 4 谷利伟，赵金兰. 共轭亚油酸研究进展[J]. 粮油食品科技，2001,9（2）：28-29. 5 林淑英，宁正祥，郭清泉. 共轭亚油酸在食品工业中的应用前景[J]. 中国油脂, 2003, 28(11): 45-48. 6 Seidel, Michael C. Synthesis of conjugated fatty acid[P]. 2002，1（United States Patent 6,342,619） 7 Pariza, Michael W, Yang. Method of producing conjugated fatty acids[J]. 2000, 5 ( United States Patent 6,060,304 ) 8 刘晓华，曹郁生，陈燕. 微生物生产共轭亚油酸的研究[J] .食品与发酵工业，2003，29（9）：69-72. 9 邵群，边际，马丽，等. 乳酸菌发酵产生共轭亚油酸的研究[J]. 山东师大学报，2001,16（4）：443-446. 10 曹健，魏明，曾实，等. 一株嗜酸乳杆菌突变株转化亚油酸为共轭亚油酸条件的研究[J]. 食品科学，2003，24（9）：76-79. 11 张中义，胡锦蓉，刘萍，等. 产共轭亚油酸乳酸菌的筛选及产物分析[J]. 中国农业大学学报，2004，9（3）：5-8. 申请书版本号：73089175