酪蛋白巨肽影响乳清蛋白功能性质的机理研究 (2).doc

ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书( 2005版) 第3页 同行评议组别 食品（农产品、水产品）加工与储藏 项目编号 Y305058 浙江省自然科学基金 申 请 书 申报类别: 一般项目 项目名称: 酪蛋白巨肽影响乳清蛋白功能性质的机理研究 申 请 者: 孟祥河 电 话: 0571-88320345 依托单位: 浙江工业大学/生物与环境工程学院 通信地址: 杭州朝晖六区浙江工业大学生物与环境工程学院 邮政编码: 310032 E-mail : mengxh@ 申报日期: 2005-5-24 浙江省自然科学基金委员会 二OO五年制 基本信息 申请者信息 姓 名 孟祥河 性别 男 出生日期 1974年01月04日 最终学位 博士 获学位年份 2004 职称 讲师 主要研究领域 乳制品、肉制品、功能性油脂、天然产物分离、食品资源开发与利用 E-mail mengxh@ 电 话 0571-88320345 个人网页 依托单位 浙江工业大学/生物与环境工程学院 证件类型 身份证 证件号码 230103197401043634 申请者是否近三年调入在浙单位工作 是 调入时间 2004年07月 申请者曾主持的浙江省自然科学基金资助项目编号: 申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限: 项目基本信息 项目名称 酪蛋白巨肽影响乳清蛋白功能性质的机理研究 申报类别 一般项目 研究属性 支撑性应用基础研究 同行评议组别 农业科学及生物技术/食品（农产品、水产品）加工与储 依托基地名称 浙江省制药工程重点实验室 ---浙江工业大学 预计研究年限 2006年01月－2007年12月 总经费预算 10.0万元 申请经费 6.0万元 项目研究目标、内容和意义简介(限400字) 利用蛋白质化学、光谱学、物性学、热分析学及生物技术为手段，研究酪蛋白巨肽的基本特性、乳清蛋白胶凝机理、胶凝过程中的构象变化以及酪蛋白巨肽（CMP）对乳清蛋白胶凝过程中二硫键的影响，以揭示CMP对乳清蛋白凝胶的作用模式、可能的作用阶段，确定影响胶凝作用的CMP的关键基团，在此基础上探讨CMP的生物改性及生物分离技术，以期避免CMP对乳清蛋白凝胶性、吸水性的致命影响，解决困扰国内外甜乳清蛋白质量不高的技术难题，改善乳清蛋白的功能性质，扩大乳清蛋白的应用范围，同时获得高附加值的功能性营养添加剂—CMP，为浙江乃至全国的功能性乳制品推陈出新，为乳品工业提供新的增长点。而且随着干酪产量的增加，乳清产量持续增长。以本研究为指导，开发高品质的乳清蛋白将为乳清废物资源化提供新动力，不但能增加企业效益、改善环境，还可实现乳品工业快速可持续发展。因此本课题的研究不论是技术、经济还是环境效益都将是重大的。 关键词（不超过4个） 酪蛋白巨肽；乳清蛋白；胶凝；机理. 同行评议分组说明 食品加工的副产品加工与利用 重点资助方向 农业资源产业生物技术研究 申请书版本号：10191576 项目组主要成员 编号 姓名 出生日期 性别 职称 学位 单位名称 电话 项目分工 每年工作时间（月）（（(月) 1 孟祥河 1974年01月04日 男 讲师 博士 浙江工业大学/生物与环境工程学院 0571-88320345 负责人 8 2 孙培龙 1964.04.09 男 教授 硕士 浙江工业大学生物与环境工程学院 0571-88320779 生物分离 3 3 张拥军 1971.03.02 女 副教授 博士 中国计量学院生命学院 0571-88320671 机理研究 3 4 杨胜利 1973.08.01 男 讲师 博士 浙江工业大学药学院 0571-88320803 蛋白质构象研究 3 5 杨 开 1978.02.07 男 博士生 硕士 浙江工业大学生物与环境工程学院 0571-88320345 电泳分析 4 6 张建友 1977.10.03 男 博士生 硕士 浙江工业大学生物与环境工程学院 057-188320792 生物修饰研究 6 7 何荣军 1978.01.03 男 助教 硕士 浙江工业大学生物与环境工程学院 0571-88320345 分析检测 3 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 参加单位数 9 2 2 3 0 2 0 2 说明：1.个人介绍部分申请者必须填写，其他人员可以不填写； 2.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成； 3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。 ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005版） 第14页 个人介绍： 孟祥河：男, 1974.01出生, 博士、讲师。主要从事农畜产品产后精深加工及其副产物综合利用方面的研究。 2004年7月至今于浙江工业大学生物与环境工程学院食品学科工作； 2004.06于江南大学发酵工程专业获得生物化工博士学位, 从事农副产品产后生物加工方面的研究； 1998.09-2001.3于黑龙江商学院攻读硕士学位，主要从事功能食品方面的研究； 1996.07-1998.09于哈尔滨综合乳品厂工作，主要从事乳制品开发研究； 1992.09-1996.07本科期间于东北农业大学食品学院主修乳与乳制品科学。 目前已在重要学术期刊上发表科技论文20余篇。代表性论文如下： (1) 孟祥河, 孙培龙, 杨开.2005. 填充床反应器中酶法连续合成1,3-甘油二酯的研究. 生物工程学报, 21(3). (2) 孟祥河, 孙培龙, 杨开.2005.酶法合成DAG油脂产物精致的研究.中国粮油学报（已接受） (3) 邹冬芽,孟祥河,毛忠贵.2004.甘油二酯的营养特性研究.营养学报, 26(5),333-336. (4) Meng Xiang-he, ZOU Dong-ya, Shi Zhong-ping, Mao Zhong-gui. 2004 Dietary Diacylglycerol Prevent High fat Diets-Induced Lipid Accumulation in Rat Liver and Abdominal Adipose Tissue. Lipid, 39(1):37-41.(SCI) (5) Meng Xiang-he, ZOU Dong-ya, Duan Zuo-ying, Mao Zhong-gui. (2004). Dietary Diacylglycerol Oil represses Accumulation of Body Fat and Visceral Fat of Rats. The 5th International Conference on Food Science and Technology, ISBN 7-5068-0769-2, 2003.10, WUXI,China. (6) 孟祥河, 邹冬芽, 史仲平, 毛忠贵. 2004. 无溶剂体系中酶催化亚油酸、甘油生产1,3-甘油二酯的研究 中国油脂, 29(2): 47-50. (7) 孟祥河, 毛忠贵.2004.甘油酯的的分析方法 中国油脂, 29(1): 44-46. (8) 孟祥河, 毛忠贵.2003. 植物甾醇的氢化的研究 中国粮油学报, 18(5):66-70. (9) 孟祥河, 毛忠贵.2004. 无溶剂体系合成1,3-甘油二酯用脂肪酶的筛选及其酯化性质的研究.食品与生物技术,23(2):31-35. (10) 李志态, 孟祥河. 酸奶后酵过程中酸度的控制. 食品科技2000, 6:48-49. 参与完成的科研项目： 2001.04 -2004.12 食用菌专用多功能提取罐的研制与开发.8万元，浙江省科技厅一般项目.排名第二，申请鉴定中； 2004.12-2005.12. 食用菌功能性多糖成分分离纯化关键技术研究.235万元，浙江省科技厅重大项目.排名第五. 2002.03-2004.03. 功能性脂质的酶法合成及其减肥功能研究.18万元.无锡市科技局高新技术产业化项目.排名第二. 1998.06-2000.04. 微波技术在食品保鲜中的应用.12万元.黑龙江省科技厅重大攻关项目.获2000年黑龙江省教育厅科技进步一等奖（Certificate 2000-037）、2001年荣获黑龙江省政府三等奖(Certificate 2001-123).排名第六. 孙培龙：教授，硕士生导师，1964年4月生，1985年7月于浙江工业大学发酵工程专业毕业后留校任教至今；1988年7月-1991年6月在华东理工大学生物化工专业学习，取得硕士学位；2001年春至今在职攻读食品科学博士学位。研究方向为食品化学与资源利用。2001年入选浙江省高校中青年学科带头人。浙江省食品学会副理事长、浙江省营养学会副理事长、浙江省食品工业协会理事、浙江省食品添加剂工业协会理事、丽水市人民政府专家咨询委员会委员。1999年香菇嘌呤提取及应用研究项目获得浙江省科技进步三等奖。 目前主要从事大分子多糖、蛋白质的分离纯化、性质、功能及构效关系、食用菌功能性成分的精深加工方面的研究。承担国家级、浙江省科技厅、教育厅重大科研项目多项，主持的代表性项目如下： 科研项目（2002年至今） 1、2001-2004年，浙江省科技厅项目“食用菌深加工多功能提取罐的研制”，8万元，已完成，申请鉴定中。排名第一。 2、2001-2005年，杭州市科技局项目“蜂产品功能因子的分离提取及产品开发与产业化”，8万元，已完成，申请鉴定中。排名第一。 3、2002-2004年，浙江省自然科学基金项目“猪PSE肉与正常肉的生化特性比较”；4万元，已结题，排名第二。 4、2002-2004年，浙江省科技厅网上交易项目“灰树花多糖D-组份的研究与应用”，15万元，申请鉴定中，排名第一。 5、2003-2005年，浙江省重大科技攻关项目“食用菌多糖分离纯化与质量控制关键技术研究及应用”，235万元（含建车间费用），正在进行中。排名第一。 6、2003-2005年，浙江省重点项目“食用菌有效成分全利用关键技术研究”，25万元，正在进行中，排名第二。 7、2003年,国家科技攻关项目“代料香菇新资源开发和病虫害综合防治研究”。通过鉴定（浙科鉴字[2003]262号），排名第五。 近期代表性论著： 1、孙培龙，杨开，姬松茸子实体多糖提取方法的研究，食品科学，2003.6 2、冯德明，孙培龙，延缓蜂蜜结晶的研究，食品科技，2003.4 3、崔介君，孙培龙，原花青素的研究进展，食品科技，2003.2 4、孙培龙，香菇嘌呤的提取、纯化和酯化研究，食品科学，2002.7 5、孙培龙，香菇精的制备，精细与专用化学品，2002年增刊 6、周键，孙培龙，食用菌深层发酵的研究进展，微生物学通报，2003.06. 7、何荣军，孙培龙，姬松茸多糖中β-葡聚糖含量的酶法测定，食品与发酵工业，2004.01 8、何晋浙、孙培龙，海带的除腥研究，食品研究与开发，2004.01 9、孟祥河，孙培龙. 填充床反应器中酶法连续合成1,3-甘油二酯的研究.生物工程学报. 2005,21(3). 10、孟祥河，孙培龙. 酶法合成DAG油脂产物精致的研究.中国粮油学报，2005.(已接受) 张拥军：女，博士，副研究员，中国计量学院生命科学学院，主要从事植物化学品，生物大分的结构、功能研究及功能保健食品等方面的教学科研工作。近三年主持或作为主要人员参与的科研项目六项，作为第一作者发表论文近二十篇，申请发明专利两项。 近三年主持或主要参加的有代表性的科研项目： 2005.01-2007.12降血糖活性南瓜多糖的筛选及结构鉴定(国科外字[2004]249号,37-15)待到位,国家科技部,第二； 2005.01-2007.12基于细胞培养法高纯度南瓜多糖研究与开发（编号2005C24G2080001）25万元,浙江省科技厅,第二； 2003.09-2004.04 南瓜多糖（2003123 J0001）浙江省经济贸易委员会 50万元,第一； 2003.08-2005.12 降血糖特效南瓜多糖胶囊的研制开发(2003132 B18) 8万元，杭州市科技局，第一； 2002.11-2004.03降血糖特效植物活性制品的研制与开发(2002C23027)30万元，浙江省科技厅，第一； 2002.09-2004.09 南瓜多糖的筛选鉴定及其降糖机理的研究(20020694)1万元，浙江省教育厅，第一； 近年来有代表性的论文： 1. 南瓜降血糖活性成分的筛选及初步鉴定. 中国食品学报（一级），2003.6 第一 2. 南瓜多糖的分离、纯化及其降血糖作用. 中国粮油学报（一级），2002.8 第一 3. Study on the Screening and Primary Identification of the Bioactive Component Lowering Blood Glucose in Pumpkin，The 5th International Conference on Food Science and Technology Proceedings Volume Ⅰ，ISBN 7-5068-0769-2，2003，10：248－251，第一 4. 两种不同品种的南瓜多糖降糖效果研究. 食品科学（核心），2002.2 第一 5. 活性南瓜多糖的提取与分析 食品工业科技（核心），2002.11 第一 6. 天然降糖食品——南瓜的最新研究进展. 食品科技（核心），2002.9 第一 7. 南瓜中降血糖活性成分的提取及其功能性质的研究.食品与发酵工业（核心）2002.6第一 8. 南瓜多糖的组成分析及其降糖作用研究. 无锡轻工大学学报（核心），2002.3 第一 9. 超细南瓜粉的质构特性研究 食品工业科技（核心），2001.12 第一 10.南瓜多糖的分离提取及其降血糖作用的研究.食品科技（核心），2001.5 第一 杨胜利：男，1972-08-01出生，博士, 讲师， 浙江工业大学药学院. 1992,9-1996,7吉林农业大学食品工程学院生物物理专业 学生 1996,9-1999,6吉林农业大学研究生部生物物理专业 学生 1999,6-2000,9吉林农业大学食品工程学院生物物理专业 教师 2000,9-2004,3江南大学发酵工程专业攻读并获得博士学位 目前主要从事生物物理，蛋白质工程，酶工程方面的研究。代表性论文： 1、Shengli Yang. 2005.The Biological Effect to Monascus sp. by Ultrasonic. Enzyme and Microbial Technology.,vol(37),139-144.（SCI）. 2、杨胜利,王武.2003.超声波照射对红曲色素产量的影响.食品与生物技术, 1: 99-101 3、杨胜利, 王武. 2003. 超声波照射对红曲Monacolin K的影响. 食品与发酵工业, 2: 66-68. 4、杨胜利, 王武.2005.超声波对乳酸脱氢酶生产菌的诱变及对发酵过程中产酶的影响. 工业微生物（已接收）. 5、杨胜利, 王武. 响应面分析应用于短杆菌产酶工艺的优化.中国粮油学报, 2004 6: 60-62. 6、杨胜利, 王武. 超声波对红曲菌的诱变筛选及发酵过程在线处理. 微生物学通报，2004年01期. 45-49. 杨 开：男，1978.02生，生物化工专业，硕士，助教，浙江工业大学生物与环境工程学院。在职攻读浙江大学食品科学专业博士学位。目前主要从事食品生物技术方面的研究。 张建友：男，1977.10出生,硕士，助教，浙江工业大学生物与环境工程学院。目前在职攻读浙江大学食品科学专业博士学位。主要研究方向为乳制品加工。 何荣军：男，1978.01生，硕士助教，浙江工业大学生物化工专业学士、硕士，目前主要从事多糖、蛋白质等大分子分离、分析研究。 申请经费预算 6.0 万元 计划开支项目名称 计算根据及理由 金额（万元） 1．信息费 调研、信息查询、传递费、国内外网络信息费、项目查新费等 0.6 2．专题学术活动费 国内相关学术会议费0.3-0.5万元，科技论文版面费 0.8 3．仪器和设备购置费 酶膜反应器、电泳仪 1.2 4．能源材料费 各种乳清蛋白标准品0.5万元，分离乳清蛋白、各种酶制剂0.3万元，各种规格层析柱填料、电泳耗材、不同规格的超滤膜0.6万元、各种分析试剂0.5万元，其它不可预见费用0.3万元 2.2 5．计划管理费 按规定执行的相关管理费 0.3 6．人员费 直接参与课题研究人员的劳物费、专家咨询费 0.9 注：开支范围和标准参见《浙江省省级科技项目经费管理暂行办法》（浙财教字[2002]20号）。 申请者承诺： 我保证： （1）申请书内容是真实的； （2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则； （3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作； （4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限； （5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。 若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。 签字： 日期： 项目依托单位承诺: 已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。 依托单位公章 日期 . 项目名称: 酪蛋白巨肽影响乳清蛋白功能性质的机理研究 一、 项目研究意义： 本项目利用蛋白质化学、光谱学、物性学、热分析学及生物技术为手段，研究酪蛋白巨肽的基本特性及乳清蛋白胶凝过程中的构象变化，揭示酪蛋白巨肽对乳清蛋白凝胶的作用模式、可能的作用阶段，确定影响胶凝作用的酪蛋白巨肽的关键分子基团，在此基础上探讨酪蛋白巨肽的生物改性及生物分离技术，以期避免酪蛋白巨肽对乳清蛋白凝胶性、吸水性的致命影响，解决困扰国内外甜乳清蛋白质量不高的技术难题，改善乳清蛋白的功能性质，扩大乳清蛋白的应用范围，同时获得高附加值的功能性营养添加剂—酪蛋白巨肽，为浙江乃至全国的功能性乳制品推陈出新，为乳品工业提供新的增长点。而且随着干酪产量的增加，乳清产量持续增长。以本研究为指导，开发高品质的乳清蛋白将为乳清废物资源化提供新动力，不但能增加企业效益、改善环境，还可实现乳品工业快速可持续发展。因此本课题的研究不论是技术、经济，还是环境效益都将是重大的。 立体依据、国内外研究现状： 乳清蛋白作为一类具有较高营养价值和特殊功能性质的添加剂，广泛应用于食品、医药、化工等领域。对于食品加工而言，人们最感兴趣的乳清蛋白的功能性质包括凝胶性、持水性、以及与食品质构相关的特性[1]。目前市场上高质量的乳清蛋白主要源于酸乳清，而干酪乳清（甜乳清）的利用远未达到其应有的程度。主要原因之一即甜乳清中含有酪蛋白巨肽（以下简称为CMP）组分，影响了产品的胶凝、吸水等重要的功能特性，制得的乳清蛋白质量不高，应用上受到一定限制。随着国内外干酪市场的增加，乳清产量持续增长，如何利用过剩的干酪乳清，开发高质量、高附加值的产品、减轻环境压力已经成为乳制品加工企业面临的严峻课题。 CMP是指凝乳酶降解κ-酪蛋白105-106、169-170肽键产生的可溶性的、富含糖链的碳端片段，分子由64个氨基酸残基构成，富含糖基和磷酸基。研究表明乳清蛋白中存在少量的CMP就会对其功能性质产生致命的影响，尤其是胶凝性和持水性[2]。而胶凝性和持水性是乳清蛋白最重要的功能特性之一。乳清蛋白形成凝胶的过程是其蛋白组分分子之间物理的（静电作用、疏水相互作用）、化学的（二硫键的形成）相互作用的结果，蛋白质天然三级结构的失稳，加速了这种相互作用。任何能影响蛋白质稳定性的因素（包括热处理、pH、高压、剪切、酶、盐、其它化学物质）都有可能影响乳清蛋白凝胶的形成。因此乳清蛋白变性、胶凝的过程是复杂多变的。然而研究表明，乳球蛋白球形结构舒展、疏水基外露，半胱氨酸的巯基形成分子间、分子内二硫键是乳清蛋白形成稳定凝胶最重要的影响因素[3]。关于CMP如何影响乳清蛋白胶凝性质的机理仍不清楚。目前国外学者将其归于CMP亲水性过强，不能结合到乳清蛋白的凝胶网络中所致[4]。但其结论主要是基于现象的观察而推测的。关于变性条件下，究竟CMP、乳清蛋白（主要是β乳球蛋白）是否存在相互作用？如果存在相互作用，是由于CMP阻碍了β乳球蛋白分子间二硫键的形成还是两性的CMP提高了乳清蛋白分子的稳定性（形成稳定的双分子层或形成稳定的水化膜）进而影响蛋白质聚合呢？假设CMP、乳清蛋白之间存在相互作用，那么起作用的CMP的关键基团是什么，是磷酸基、配糖体，还是二者兼而有之？上述问题的答案都是未知的。如果通过研究，回答了上述问题，那么就不难理解影响乳清蛋白胶凝性质的机理，这在学术上是重要的，对于指导开展CMP生物修饰技术、生物分离技术，改善乳清蛋白功能性质提高质量具有重要经济意义。 此外，同时获得的CMP具有许多生理活性功能和独特的营养特性，如抑制流感病毒红细胞凝集素作用、抑制胃液的分泌减慢胃肠蠕动、促进双歧杆菌增殖、调节免疫系统应答等[5, 6, 7]。因此从干酪乳清中分离CMP不仅改善乳清蛋白的功能性质，还可得到高附加值的CMP，为我省医药、保健食品提供新原料。关于CMP的制备分离技术，国外研究较早，目前的分离方法主要有两种方法：一种是基于中性条件下CMP形成非共价结合的聚合体、酸性条件解离的性质，采用超滤法分离[8]；另一种方法是利用CMP的热稳定性，热处理使其它乳清蛋白完全变性然后离心除去，得到CMP溶液[9]。前一种方法简便易行，但得率较低，而且要彻底分离需采用多步过滤透析。变性法分离彻底、产品质量较好，但乳清蛋白由于变性功能性质大受影响，质量劣化。此外，近年来色谱分离技术（疏水色谱[10]、离子交换色谱[11]、凝胶过滤色谱[12]等）进展较快，分离效果较好，但分离介质昂贵，分离规模小，离工业化仍存在较大的差距。国内相关研究起步较晚，相关机理研究更是罕有报道。CMP的制备分离研究工作已有开展，但目前尚停留在实验阶段，而且主要是以酪蛋白为原料采用蛋白酶切方式制备以抗菌为目标的广谱酪蛋白肽[13]。以甜乳清为原料，采用生物技术改善乳清蛋白品质同时分离CMP的研究尚无报道。 二、研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系 1. 研究的目标： (1) 剖析外界环境改变情况下乳清蛋白形成凝胶的机理； (2) 比较酪蛋白巨肽存在时乳清蛋白凝胶空间结构的变化以及酪蛋白巨肽在空间网络中存在的方式； (3) 揭示酪蛋白巨肽、乳清蛋白相互作用的模式、关键基团及影响凝胶形成的机制； (4) 酪蛋白巨肽的基础研究及其对乳清蛋白功能性质不利影响的弱化。 2. 与研究工作长期目标的关系： 本研究是申请者长期研究项目“乳品加工废弃物—乳清资源化研究”的一部分，先期的理论研究为后续的乳清蛋白品质的改善、应用，新型功能性食品添加剂的开发奠定基础。 三、研究内容，研究方案和进度安排 1. 研究内容： 主要研究酪蛋白巨肽的基本性质、吸附分离特性，建立定性定量分析方法；揭示乳清蛋白形成凝胶过程中酪蛋白巨肽与乳清蛋白相互作用的模式、作用阶段，解明影响乳清蛋白功能性质的机制，以指导改善乳清蛋白质量的方法，同时探讨酪蛋白巨肽生物修饰、生物分离的可行性。 2. 研究方案： (1) 建立乳清蛋白组分的快速定性定量分离方法（HPLC、SDS-PAGE）； 采用高效液相色谱实现一步分离酪蛋白巨肽和β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白等乳清蛋白，并实现定量研究；对分离过程中酪蛋白巨肽的流向，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合现代扫描技术进行定性分析和半定量监测。 (2) 以红外光谱、圆二色谱技术为手段研究热变性条件下酸乳清蛋白（无酪蛋白巨肽）胶凝前后乳清蛋白的构向变化； β-乳球蛋白占乳清蛋白中总蛋白的70%以上，而且研究表明β-乳球蛋白与乳清蛋白的凝胶形成能力、持水性关联度极大。因此以β-乳球蛋白代替乳清蛋白，研究其构象变化以及与酪蛋白巨肽之间可能发生的作用。拟采用红外光谱、圆二色谱分别研究胶凝过程中β-乳球蛋白功能基团—巯基的变化和二级结构的变化及其与凝胶强度的关联度。 (3) 甜乳清中酪蛋白巨肽的凝胶色谱分离及性质研究； 主要结合膜分离、凝胶色谱技术，研究酪蛋白巨肽的吸附行为，同时制备少量酪蛋白巨肽产品为其性质和抗胶凝机理研究提供材料； (5) 研究酪蛋白巨肽与乳清蛋白相互作用的模式及对凝胶形成的影响； 以酸乳清蛋白为研究对象，研究添加酪蛋白巨肽对β-乳球蛋白凝胶强度及胶凝前后构象变化的影响。重点考察酪蛋白巨肽是否阻碍β-乳球蛋白变性、球状结构的伸展以及分子间、分子内二硫键的形成，并采用DSC技术研究相应的变性热与无酪蛋白巨肽存在情形进行对比研究。 (6) 分别研究酪蛋白巨肽的配糖基、磷酸基对乳清蛋白凝胶形成的影响； 依次比较研究CMP的官能团（配糖基、磷酸基）存在与否对β-乳球蛋白凝胶强度的影响，确定是电荷效应还是强亲水性阻碍其结合到乳清蛋白凝胶网络中。 (7) 根据酪蛋白巨肽的组成、结构特性，探讨生物法修饰酪蛋白巨肽的可行性，并以甜乳清为原料，进行生物法分离酪蛋白巨肽改善乳清蛋白功能性质的研究。 针对CMP的关键基团，探讨生物的或化学的方法进行修饰，以实现直接消除其对乳清蛋白功能性质的不利影响而无需分离，或采用生物催化剂选择性催化酪蛋白巨肽聚合，以方便酪蛋白巨肽与乳清蛋白的分离，改善乳清蛋白的功能性质的同时获得高附加值CMP产品。 3. 实验进度安排： 全部研究计划在二年时间 (2006年1月至2007年12月) 内完成，其中： 2006年1月-2006年12月： (1) 建立SDS-PAGE、HPLC快速定性定量分析乳清蛋白组分的方法； (2) 比较乳清蛋白胶凝前后乳清蛋白的空间构向变化； (3) 甜乳清中酪蛋白巨肽的凝胶色谱分离分离及性质研究； (4) 研究酪蛋白巨肽与乳清蛋白相互作用的模式及对乳清蛋白凝胶形成的影响 2007年1月-2007年12月： (1) 分别研究酪蛋白巨肽的配糖基、磷酸基对乳清蛋白凝胶形成的影响； (2) 根据酪蛋白巨肽的组成、结构特性，探讨生物法修饰酪蛋白巨肽的可行性； (3) 以甜乳清为原料，研究生物法分离酪蛋白巨肽改善乳清蛋白功能性质的研究。 四、项目创新之处 (1) 关于CMP如何影响乳清蛋白胶凝性质的机理仍不清楚。目前国外学者主要基于现象的观察推测认为是由于CMP亲水性过强，不能结合到乳清蛋白凝胶网络中所致。关于酪蛋白巨肽与乳清蛋白的作用模式，以及影响乳清蛋白胶凝的酪蛋白巨肽的关键基团的研究尚未见报道； (2) 目前为消除酪蛋白巨肽对乳清蛋白功能性质的不利影响，国内外学者主要采用多段超滤、电渗析组合的膜分离方法或采用结合凝胶色谱、离子交换色谱特异性吸附实现。通过研究酪蛋白巨肽的关键基团及性质，进行生物修饰直接弱化其对乳清蛋白功能性质的不利影响而无需分离的方法无疑是具有明显优势的，但相关的报道尚未见到。根据酪蛋白肽与其它乳清蛋白氨基酸残基组成及结构上的差异，采用生物方法选择性聚合然后分离的的研究也未见报道。 五、工作基础与工作条件 项目申请人专攻乳品科学研究，具有大型乳品企业亲身工作经验和进行相关研究的经历。目前正进行乳清资源化的综合研究，对酪蛋白巨肽影响乳清蛋白功能性质的机理进行了初步研究，研究工作包括：(1) 建立了乳清蛋白组分（β-Lg、α-La、CMP等）的快速准确的定性、定量分析方法，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳法和高效液相色谱法；(2) 采用膜分离-凝胶过滤相偶联的方法对酪蛋白巨肽实现分离纯化；(3) 并收集了大量有关酪蛋白巨肽的氨基酸序列、糖苷、磷酸化基团的相关信息及乳清蛋白的结构特征。 上述前期研究探讨工作为申请人在国内外首先研究酪蛋白巨肽影响乳清蛋白功能性质的机理模式和酪蛋白巨肽的生物修饰、生物分离创造了良好的工作条件。 目前已具备不同规模的层析分离设备、中压层析系统、超滤设备、电泳仪；HPLC/MS、GC分析仪、圆二色谱仪、DSC、红外光谱、紫外、可见光分光光度计；食品物性分析仪、高、中、低速离心机以及冷冻干燥设备； 项目研究以浙江省生物化工“重中之重”重点学科和浙江省生物制药重点实验室为依托，本课题确定后，将充分利用实验室先进的仪器、设备，发挥重点实验室的智力、资金、技术和管理优势，开展合作研究，以顺利完成预期的目标。 六、预期研究结果及其利用研究结果的计划和今后的发展思路 1. 预期研究结果： 本项目完成后基本可以确定： （1）蛋白巨肽作用乳清蛋白的具体模式，即酪蛋白巨肽直接与乳清蛋白发生作用或酪蛋白巨肽改变乳清蛋白的外界环境（离子强度、疏水特性及水化水）间接影响乳清蛋白的胶凝过程； （2）CMP同乳清蛋白相互作用模式中，酪蛋白巨肽起作用的关键基团，是磷酸基或配糖体； 本课题研究期间预计发表学术论文2-3篇，其中国际期刊发表论文1篇（SCI收录），国内重要学术杂志上发表1-2篇。 2. 利用研究结果的计划和今后的发展思路 以本研究揭示的酪蛋白巨肽对乳清蛋白凝胶的作用机制及酪蛋白巨肽的特性为理论基础，探讨对酪蛋白巨肽的生物修饰、生物分离的方法，以开发生产高品质的功能性乳清蛋白的生产方法，同时分离酪蛋白巨肽，为医药、化工、食品添加剂提供新的功能成分。在此基础上，希望能进一步得到省科技厅的资助，并与企业合作，进一步放大试验，为项目的应用、推广创造条件。如果研究进展顺利，还可进一步申请国家基金，以进行更深层次的机理研究。 七、参考文献 (1) 南海函, 郑建仙.2001.乳清蛋白凝胶及其影响因素的机理研究. 广西轻工业,4: 22-26 (2) D Veith., E.C. Reynolds.2004. Production of a high gel strength whey protein concentrate from cheese whey. J. Dairy Sci. 87:831-840. (3) M. Yagi, K. Sakurai, C. Kalidas, C.A. Batt, Y. Goto, Reversible unfolding of bovine beta-lactoglobulin mutants without a free thiol group, J. Biol. Chem. 278 (2003) 47009– 47015. M. Yagi, K. Sakurai, C. Kalidas, C.A. Batt, Y. Goto, Reversible. unfolding of bovine beta-lactoglobulin mutants without a free thiol group, J. Biol. Chem. 278 (2003) 47009– 47015. (4) Kawasaki, Y., Kawakami, M., Tanimoto, M., Dosako, S., Tomizawa,A., Kotake, M. and Nakajim, I. 1993. pH-Dependent molecular weight changes of k-casein glycomacropeptide and its preparation by ultrafiltration. Milchwissenschaft, 48(4), 191-196. (5) Brody, E. P. (2000). Biological activities of bovine glycomacropeptide. British Journal of Nutrition, 84(1), 39–46. (6) Thoma,C.,&Kulozik, U. (2004). Methods of obtaining isolated caseinomacropeptide from milk and whey and functional properties. Bulletin of the International Dairy Federation, 389, 74–77. (7) 吴疆, 庞广昌, 凌雪萍.2003. 酪蛋白糖巨肽的生物学活性. 食品科技, 9: 19-20. (8) Lieske, B., & Konrad, G. (1996). A new method to estimate caseinomacropeptide and glycomacropeptide from trichloacetic acid filtrates. Milchwissenschaft, 51, 431–435 (9) Martın-Diana, A. B., & Fontecha, M. J. F. J. (2002). Isolation and characterisation of caseinomacropeptide from bovine, ovine, and caprine cheese whey. European Food Research and Technology, 214,282–286. (10) Minkiewicz, P., Slangen, C. J., Lagerwerf, F. M., Haverkamp, J., Rollema, H. S., & Visser, S. (1996). Reversed-phase high-performance liquid chromatographic separation of bovine k-caseinmacropeptide and characterization of isolated fractions. Journal of Chromatography A, 743