国家自然基金标书－终稿 (2).doc

报告正文 （一） 立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1、 项目的立项依据 随着机械通气、表面活性物质替代疗法等新技术应用，危重新生儿、尤其是早产儿存活率已显著提高。然而，长时间吸入高浓度氧，幸存者易发生肺部氧化应激损伤。目前，高氧肺损伤已成为发达国家NICU最为棘手的问题之一和婴儿慢性肺疾病的最常见形式。但高氧肺损伤的确切机制尚未完全阐明，更无有效的防治手段。因此深入研究其发病机制，积极防治高氧肺损伤，具有优生优育、提高人口素质的战略意义。 高氧肺损伤是一个涉及许多细胞活动的复杂过程，可分为早期的组织损伤（弥散性肺泡炎）和晚期的损伤后修复（肺间质重构）两个过程。细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的重建参与了高氧肺损伤的整个病理过程，若ECM重建正常，则损伤完全修复，肺结构正常；若ECM重建紊乱，将导致肺纤维化。因此，ECM重建是关系高氧肺损伤结局的关键因素。本实验室在国内外率先开展了对早产大鼠高氧肺损伤中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和其抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)表达的研究，已发现肺损伤时MMPs过度表达、MMPs/TIMPs失衡是ECM重建紊乱发生纤维化的关键原因 [1]（具体研究成果见研究基础栏）。有关MMPs在高氧肺损伤中的作用已为少数国外学者所重视，但高氧肺损伤后ECM重建过程中，引起MMPs过度增加的具体机制是什么？本实验室拟从MMPs的诱导剂和抑制剂两方面深入研究。 细胞外基质金属蛋白酶诱导剂（extracellular matrix metalloproteinase inducer,Emmprin）在上调MMPs表达中起关键作用。Emmprin是分子量为58KD的质膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，不仅表达于正常组织，还表达于肿瘤组织如肺部肿瘤细胞，提示Emmprin参与体内生理及病理过程[2]。目前，少数文献已证明，体外Emmprin与人成纤维细胞共培养后，成纤维细胞MMPs表达增加。进一步研究表明，Emmprin在细胞表面与自身受体或MMP结合，激活胞内MAPK p38信号通路，该途径激活促进ECM降解[3，4]。但关于Emmprin/MAPK p38对MMPs调节的研究仅限于肿瘤细胞，有关高氧肺损伤后肺ECM重建过程中，Emmprin如何调控MMPs/TIMPs平衡，目前国内外尚无文献报道。 转化生长因子β（Transforming growth factor beta, TGF-β）在下调MMPs表达中起关键作用。研究证明TGF-β刺激可使肺成纤维细胞MMPs生成减少[5]。另有研究发现，TGF-β抑制元件位于MMP-1基因启动子区，严密调控MMP-1在不同生理和病理情况下的表达[6]。进一步的研究表明，TGF-β对MMP-1的作用通过SMAD信号途径介导，该途径激活可阻止ECM降解[5]。因此，推测TGF-β/SMAD对MMPs/TIMPs平衡的调节可能是影响肺损伤后ECM重建的关键因素之一。有关高氧肺损伤后肺ECM重建过程中，TGF-β如何调控MMPs/TIMPs平衡，目前国内外尚无文献报道。 近年来对信号转导系统的研究发现，位于大多数细胞质膜上约50-100nm大小的囊性凹陷结构—小窝（caveolae），是许多信号分子完成跨膜信号转导的“驿站”。小窝蛋白（caveolin）是小窝胞浆面包被的一种21-24kD的膜蛋白，是许多信号分子活性状态的重要调节者。在无胞外信号刺激下，caveolin通常与富集于小窝质膜上的各种信号分子、受体及非受体型酪氨酸激酶等相结合，抑制这些信号物质的活性；在激动剂与受体结合后，caveolin分子构象发生变构或共价修饰，调节信号物质的活化状态，参与信号转导调控[7]。有关caveolin在肺ECM重建中的作用，有学者提出肺泡Ι型上皮细胞caveolin表达缺失可能是发生肺纤维化的亚细胞指标。对caveolin-1基因敲除小鼠的研究，肺组织显示肺泡隔因细胞增殖而增厚和肺纤维化。caveolin-1α在肺发育的不同阶段，可表达于不同血管和上皮细胞，呈时相分布[8]。研究发现，caveolin –1与TGF-βⅠ型受体（TβRⅠ）相互作用，抑制TGF-β介导的SMAD-2和下游分子的磷酸化，从而调节信号转导[9]。Emmprin具有酪氨酸蛋白激酶活性，且其信号传导为酪氨酸磷酸化依赖的MAPK p38途径，申请者推测caveolin能与Emmprin相互作用，调控Emmprin介导的MAPK p38和下游分子的磷酸化。简图如下： 胞外信 caveolin +? caveolin/Emmprin作用 Emmprin/MAPK p38 号刺激 变构活化 + caveolin/TβRⅠ作用 TGF-β/SMAD　　　　 信号整合 调控肺ECM重建 基于上述，申请者提出如下假设：⑴高氧暴露下MMP诱导剂/抑制剂失衡是高氧肺损伤MMPs增加，ECM重建紊乱的主要原因。⑵高氧暴露使质膜小窝表达或功能异常，从而影响Emmprin/MAPK p38和TGF-β/SMAD两条信号通路整合，继而导致MMPs增加，ECM重建紊乱。 本人所在的研究室属呼吸系统疾病重点实验室。多年来，本人一直致力于新生儿高氧慢性肺损伤的研究，已成功建立了早产大鼠高氧肺损伤的动物模型、掌握了支气管肺泡灌洗术、体外Ⅱ型肺泡上皮细胞和成纤维细胞培养、核酸、蛋白分析等技术，并对抗氧化酶、细胞因子水平、一氧化氮、MMPs/TIMPs失衡等因素在高氧肺损伤发病机制中所起的作用进行了较深入的研究，同时应用地塞米松、维甲酸、人类重组促红细胞生成素、EGb761进行了抗氧化损伤的干预研究（见研究基础栏）。这些理论研究和技术方法的积累为本课题的开展奠定了坚实的基础。 本研究如能完成，可望为探索高氧肺损伤后肺ECM重建紊乱的机制开拓新思路，并为寻找有效的预防和干预高氧肺损伤提供依据。 参考文献 1. Taylor PM, Woodfield RJ, Hodgkin MN et al.Breast cancer cell-derived EMMPRIN stimulates fibroblast MMP2 release through a phospholipase A(2) and 5-lipoxygenase catalyzed pathway. Oncogene 2002 Aug 22;21(37):5765-72 2. Liang L, Major T, Bocan T.Characterization of the promoter of human extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN). Gene 2002 Jan 9;282(1-2):75-86 3. Lim M, Martine T, Jablons D. Tumor-derived EMMPRIN(extrocellular matrix metalloproteinases inducer) stimulates collagenase transcription through MAPK p38. FEBS Lett 1998;441(1):88~92 4. Yuan W, Varga J. Transforming growth factor-beta repression of matrix metalloproteinase-1 in dermal fibroblasts involves Smad3. J Biol Chem 2001;276(42):38502-10 5. White LA, Mitchell TI, Brinckerhoff CE. Transforming growth factor beta inhibitory element in the rabbit matrix metalloproteinase-1 (collagenase-1) gene functions as a repressor of constitutive transcription. Biochim Biophys Acta 2000 Feb 29;1490(3):259-68 6. Razani B, Zhang XL, Bitzer M, et al. Caveolin-1 regulates TGF-beta/SMAD signaling through an interaction with the TGF-beta type I receptor. J Biol Chem 2001;276 (9):6727~6738 7. Ramirez MI, Pollack L, Millien G, et al. The alpha-Isoform of Caveolin-1 Is a Marker of Vasculogenesis in Early Lung Development. J Histochem Cytochem 2002;50(1):33~42 8. Drab M, Verkade P, Elger M, et al. Loss of caveolae, vascular dysfunction, and pulmonary defects in caveolin-1 gene-disrupted mice. Science 2001;293(5539):2449~52 2、 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。 研究目标： 建立早产大鼠慢性高氧肺损伤模型，探讨Emmprin与TGF-β调节失衡是否为高氧肺损伤MMPs增加，ECM重建紊乱的主要原因；探讨小窝蛋白对Emmprin/MAPK p38和TGF-β/SMAD两条信号通路整合的影响，为高氧肺损伤发生机制和寻找有效防治措施提供理论依据。 研究内容： 1. Emmprin/MAPK p38信号通路活化状态及高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的相关性： ① 研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中Emmprin、P38、磷酸化P38的表达。 ② 研究高氧肺损伤Emmprin/MAPK p38信号通路活化状态与MMPs表达双变量关系。 2. TGF-β/SMAD信号通路活化状态及高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的相关性： ① 研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中TGF-β、TβRΙ、SMAD、磷酸化SMAD的表达。 ② 研究高氧肺损伤TβRΙ的激酶活性，计算磷酸化SMAD与非磷酸化SMAD比值。 ③ 研究高氧肺损伤TGF-β/SMAD信号通路的活化状态与MMPs/TIMPs的双变量关系。 3. caveolin-1对Emmprin/MAPK p38和TGF-β/SMAD两条信号通路及其与高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的相关性： ① 研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中caveolin-1表达及酪氨酸磷酸化水平。 ② 研究高氧肺损伤肺组织质膜小窝内caveolin-1与Emmprin的共定位。 ③ 研究高氧肺损伤肺组织质膜小窝内caveolin-1与TβRΙ的共定位。 拟解决的关键问题： 1. 成年动物急性高氧肺损伤模型，因其肺发育已成熟，不能如实反映不成熟肺的损伤情况，并且与临床上早产儿需长期用氧情况差异较大。本项目采用早产大鼠慢性高氧肺损伤模型，能更如实模拟支气管肺发育不良的发生情况。虽然此模型技术难度较大，但本研究组在早产大鼠模型制备方面已积累了丰富经验，能成功完成此模型的复制。 2. 本研究假设caveolin与Emmprin的相互作用可调控Emmprin/MAPK p38信号通路活化；caveolin-1与TβRΙ的相互作用可调控TGF-β/SMAD信号通路活化。以往由于技术条件限制，未能从形态学上直接证实。借助共聚焦显微镜观察和荧光双重标记技术可解决这一技术难题。 3、 拟采取的研究方案及可行性分析。 研究方法： 本课题采用共聚焦显微镜（confocal microscope）、免疫荧光双重标记和免疫组织化学等研究方法，辅以蛋白质与核酸分析技术（Western Blot、Northern Blot方法），检测各指标的动态变化，并对各指标进行定位、定性、定量分析。 1.建立早产大鼠慢性高氧肺损伤模型： 参照申请者著作，实用儿科临床杂志， ⑴.检测caveolin-1酪氨酸磷酸化水平： ① 应用抗caveolin-1pAb 进行免疫沉淀 ② 应用抗磷酸化酪氨酸mAb 进行Western Blot分析 ⑵. 检测肺组织中Emmprin、P38、磷酸化P38 、TGF-β、TGF-βΙ型受体（TβRΙ）及SMAD-2、磷酸化SMAD表达，探讨高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的分子机制： ① 蛋白质水平检测—Western Blot。 ② 　mRNA水平检测—Northern Blot（或RT-PCR）。 ⑶. 检测肺组织中TβRΙ的激酶活性： ① TβRΙ分离提取—免疫沉淀法（immunoprecipition） ② TβRΙ与纯化的激酶底物GST-SMAD2（由美国国立癌症研究机构de Caestecher, M教授提供）反应，应用免疫印迹法检测磷酸化SMAD2水平，计算TβRΙ的激酶活性。 ⑷. 检测肺组织质膜小窝内caveolin /Emmprin及caveolin-1/TβRΙ的共定位及表达： ①样本制备： 制备组织切片→加入抗caveolin mAb→PE标记的二抗→加入抗Emmprin/TβRΙ的pAb→FITC标记二抗 ②共聚焦显微镜（TCSSP型，德国Leica公司）检测共定位；应用图象分析软件对caveolin表达强度进行半定量。 ⑸．应用统计学方法处理数据： 应用SAS统计分析软件，对数据进行统计学分析。 技术路线： 早产大鼠高氧肺损伤模型 caveolae caveolin酪氨酸磷酸化状态 （免疫沉淀、免疫印迹） Emmprin/MAPK p38 TGF-β/SMAD 信号通路研究 信号通路研究 Emmprin、P38、磷酸化P38 TGF-β、TβR、SMAD、磷酸化SMAD 表达（免疫印迹与Northern Blot 表达（Western Blot和Northern Blot） 或RT-PCR) TβRⅠ激酶活性（免疫沉淀和免疫印迹） caveolin/Emprin共定位 (荧光双标记、共聚焦显微镜) caveolin/ TβRⅠ共定位 (荧光双标记、共聚焦显微镜) 可行性分析： 1. 申请者所在的研究室属于呼吸系统疾病重点实验室临床二室，本室在慢性阻塞性肺疾病和肺纤维化发病机制的研究领域已有大量工作积累，为本项目的研究打下了良好的工作基础。申请者及所在研究室在产儿高氧损伤领域进行了一系列开拓性研究，已熟练掌握急、慢性高氧肺损伤模型复制，蛋白、核酸分析等技术。（详见研究基础栏） 2. 本项目研究的主要成员之一，香港合作者教授，是国际上新生儿肺损伤研究的前沿科学家，目前与本研究小组密切合作，进行有关慢性肺损伤研究。霍泰辉教授除承担实验指导，并提供部分试剂。 3. 新一代共聚焦显微镜具有观察亚细胞结构的立体定位功能，用其检测在体组织caveolin/Emmprin、caveolin/ TβRⅠ信号分子在亚细胞位点的共定位表达，虽无文献报道，在技术上难度较大，但申请者已掌握了多种荧光标记技术，应用共聚焦显微镜观察caveolin-1在细胞质膜上的定位表达也已获成功。申请人所在单位的医学中心的共聚焦显微镜和本实验室的基本研究设备，能保证本实验研究完成。 4、 本项目的特色与创新之处。 理论上的创新： u 研究Emmprin/MAPK p38信号通路在器官发育和组织病理损伤中的作用,国内外尚无文献报道。 u 本课题研究caveolin对Emmprin/MAPK p38、TGF-β/SMAD共调节机制，将为早产儿高氧肺损伤发病机制开辟新的研究领域，并为其防治开拓新思路。 方法上的创新： 以在体组织为研究对象，应用免疫荧光双重标记共聚焦显微镜技术研究caveolin/Emmprin、caveolin/TβRΙ共定位，国内外未见文献报道，可望为深入研究小窝蛋白对信号转导的调控机制开辟新途径。 5、 年度研究计划及预期研究结果。 年度研究计划及预测进展 本课题研究内容预计用3年时间完成. 2004年1月~8月 ①购买所需试剂。②建立预实验动物模型。③进行各项预实验。 2004年9月~2005年2月 ①建立动物模型。②完成标本的收集。 2005年3月~7月 完成MMPs、TIMPs、TGF-β、TβRΙ、SMAD2及其mRNA表达的研究，并进行阶段性总结。 2005年8月~2005年12月 完成caveolin-1表达和caveolin-1/TβRΙ共定位研究，并进行阶段性总结。 2006年1月~2006年6月 完成caveolin-1的酪氨酸磷酸化状态研究，并进行阶段性总结。 2006年7月~12月 研究数据资料分析、总结、论文撰写及成果鉴定。 预期研究成果 本项目所建立的早产新生大鼠慢性高氧肺损伤模型，不仅为本课题提供了研究对象，而且为研究高氧肺损伤后肺ECM重建提供了模型。 本研究可望为阐明早产儿高氧肺损伤机制提供新的线索：⑴高氧暴露下MMP诱导剂/抑制剂失衡是高氧肺损伤MMPs增加，ECM重建紊乱的主要原因。⑵高氧暴露使质膜小窝表达或功能异常，从而影响Emmprin/MAPK p38和TGF-β/SMAD两条信号通路整合，继而导致MMPs增加，ECM重建紊乱。本研究内容也可能为预防和干预高氧肺损伤提供理论依据。 （二）研究基础与工作条件 1、 工作基础 1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩 本课题组多年来一直进行高氧肺损伤的发病机制及防治的研究，做了许多基础和临床研究工作。已成功建立早产新生大鼠高浓度氧（85%～95%）急性肺损伤和慢性肺纤维化的模型；已完成肺组织中各种抗氧化酶活力、羟脯氨酸含量与肺纤维化的相关性研究；内源性一氧化氮在高氧肺损伤中双重作用的研究；体外高氧对肺泡巨噬细胞分泌IL-8的影响研究；TGF-β在早产大鼠高氧肺损伤肺组织中表达的研究；基质金属蛋白酶及其抑制剂在高氧肺损伤中的作用机制的研究；及促红细胞生成素、地塞米松、维甲酸对新生鼠高氧肺损伤的干预研究。 获奖课题 目前正承担的相关科研项目： 1. 2. 相关研究工作发表的文章： 附：基质金属蛋白酶及其抑制剂在高氧肺损伤中的作用 1. 高氧组病理学改变 2. 高氧组MMPs表达 图1 肺发育不良，示肺泡 图2 细胞增生、间质纤维 图3 MMP-2强阳性表达 数目减少、结构简单 化改变 3. 酶谱法测BALF中明胶酶活性 4. 高氧暴露后MMPs、TIMPs表达增加 MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2 3d O2 0.46±0.36 0.90±0.64 2.00±0.47 0.30±0.23 air 0.07±0.10 0.07±0.16 0.87±0.58 0.03±0.08 7d O2 1.33±0.60 0.11±0.45 2.60±0.71 1.15±0.34 air 0.36±0.43 0.17±0.35 1.70±0.35 0.06±0.10 14d O2 3.40±0.53 2.75±0.66 3.37±0.45 2.43±0.18 air 1.30±0.90 0.33±0.31 2.82±0.89 0.08±0.10 21d O2 3.73±0.46 3.35±0.60 3.88±0.11 1.90±0.38 air 0.30±0.14 0.60±0.10 2.54±0.55 0.30±0.14 图4 高氧组条带亮度增强，示活性增强 高氧组与对照组比较均P＜0.05 2、 工作条件 1) 研究所需实验动物，均有实验合格证。 2) 申请者所在医院的分子医学中心设备可协助完成Western blot 、northern blot、免疫沉淀等实验。 3) Caveolin-1抗体由Division of Hematology/Oncology/BMT Department of Pediatrics Emory University School of Medicine教授有偿提供。本项目所需的其它抗体、分子探针和试剂国外均有售，或由合作者Fok TF赠送。 总之，申请人所在的医院及大学的实验条件，完全能够满足该项目的研究要求。 3、 申请人简历 4、 承担科研项目情况 1． 由本项目申请者负责。 主要探讨EGB761对高氧肺损伤早产新生大鼠支气管肺泡灌洗液中细胞因子如TNF-α、IL-8，IL-1、IL-6、MMPs、TIMPs及其 mRNA的影响。 2．早产儿贫血临床治疗的研究 由本项目申请者负责。 3．支气管肺泡灌洗技术在新生儿肺部疾病中的应用研究 “新技术、新业务”资助项目。