2012CB114000-G主要粮食作物重大病害控制的基础研究 (2).doc

项目名称： 主要粮食作物重大病害控制的基础研究 首席科学家： 彭友良 中国农业大学 起止年限： 2012.1-2016.8 依托部门： 教育部 一、关键科学问题及研究内容 本项目将结合我国作物病害控制的重大需求与国际植物病理学科前沿发展的趋势，探讨下列主要科学问题： 1）“基因对基因”病害中病菌致病型变异的时空分布规律及其与抗病新品种选育和布局的关系。已知病原物无毒基因的变异或缺失产生新的致病型，从而克服相应抗病基因的有效性、导致作物品种抗病性的丧失。虽然目前已从真菌和细菌中分离了不少无毒基因，但缺少有关致病型时空动态规律的研究，有关无毒基因的分子功能及其变异的遗传机制的认识也不很深入，因而没有建立有效选育和选用抗病品种的理论。本项目将围绕粮食作物的“基因对基因”病害，广泛研究病菌致病型的时空分布规律，深入解析无毒基因的分子功能及其变异的遗传机制，探讨“基因对基因”病害抗性品种培育和布局的理论。 2）植物病原真菌和细菌的何种类型特异致病关键基因可以作为设计新型杀菌剂用靶标。有关植物病原物致病性机制的研究报道很多，但是什么是病原物的关键致病基因、选择什么类型的致病基因为靶标设计杀菌剂才是环保高效的？对此，尚没有深入、准确和完整的认识。本项目将分别通过系统鉴定粮食作物的主要病原真菌和细菌的致病性和致病力基因，发现其中的关键致病基因，深入解析其作用机理，并有选择地开展致病蛋白的晶体结构研究，探讨环保高效杀菌剂设计用靶标选定的理论。 3）持久抗病作物的分子育种途径。虽然通过遗传杂交途径培育了大量的抗病作物品种，但是广谱、持久的抗病作物品种还很少。其中一个尚未解决的重要科学问题是由于缺少对抗病资源的系统发掘和分子评价，尚未确定何种类型的基因可以用于持久抗病作物的培育和分子设计。对此，本项目将广泛鉴定在植物抗病性中具有重要作用的QTL和具有相对广谱抗病性的主效基因，评价其在抗病作物的培育和分子设计中的利用价值，探讨持久抗病作物的分子育种策略。4）植物病毒基因沉默抑制子作用机制及其在抗病毒作物的分子育种中的利用价值。由于抗病毒的植物资源很少，抗病毒作物培育的理论将主要依靠对植物与病毒相互作用机制的深入认识。病毒基因沉默抑制子是植物病毒广泛存在的通用致病机制之一，但对植物病毒基因抑制子抑制基因沉默的机制了解甚少，对其作用机制的深入研究将为设计抗病毒作物提供理论基础。本项目将通过鉴定与病毒基因沉默抑制子相互作用的寄主蛋白，解析病毒致病及逃避寄主植物防御的分子机理，探讨抗病毒作物的分子育种策略与途径。 5）调控植物抗病性的全局性因子。植物抗病性是多个基因共同表达的结果，并涉及许多次生代谢途径的变化。但我们目前对植物抗病性在分子水平上的认识是基于分子遗传学、分子生物学和生物化学研究，有局限性。理想的植物病害安全控制途径是充分发挥植物自身的抗病机制，但需要我们对植物抗病机制有整体性的和准确的认识。为此，本研究将从蛋白组、转录组和代谢组水平上全面阐述植物的抗病机制，发现其中的关键基因和小分子化合物，在此基础上探索植物病害控制的新理论和途径。 主要研究内容： 1）粮食作物“基因对基因”病害中病原物致病型变异规律与抗病品种的选育、布局理论。虽然抗病品种的利用被认为是最安全、有效和经济的手段，但我国一直未能就“基因对基因”病害开展与抗病基因布局密切相关课题的深入研究，以致我国粮食作物主栽品种的抗病基因型基本不明、作物抗病品种的选育处于无的放矢状态。因此，我国抗病品种的利用在多数情况下是偶然的，生产上经常出现品种抗病性丧失和病害大流行。本课题将围绕水稻的稻瘟病、白叶枯病、细条病和小麦条锈病，广泛分析、比较病菌致病型的时空分布规律，分别设计这些“基因对基因”病害抗性品种布局的方案。同时，探讨利用一些广谱致病型小种，在相应地区开展有针对性的抗病资源筛选和品种抗病性改良，以期建立抗病品种的选育和布局的理论。通过基因组比较、基因敲除和互补等技术，深入解析无毒基因的分子功能及其变异的遗传机制，奠定小种分子检测技术的基础。 2）粮食作物主要病原真菌和细菌致病性和致病力基因的系统鉴定与农药设计用候选靶标基因的发现。选择农业生产上重要的、且本项目前期工作基础好的水稻稻瘟病菌、白叶枯病和细条病以及小麦赤霉病菌为主要对象，通过全基因组系统插入突变或基因敲除途径，系统鉴定其中致病基因和致病力基因，并通过组学和生物信息学技术，构建致病基因和致病力基因的网络，发现其中的关键基因。深入研究关键致病基因的作用机理，包括与其直接互作的上下游基因、蛋白的表达动态、亚细胞定位、功能结构域及其晶体结构，筛选农药设计用候选靶标基因。 3）植物病毒基因沉默抑制子作用机理及其在抗病毒作物分子育种中利用价值。目前抗病毒的植物资源很少，因此，抗病毒作物培育的理论将主要依靠对植物与病毒相互作用机制的深入认识。绝大多数病毒利用自身编码的基因沉默抑制子突破植物的基因沉默防御体系进行植物侵染，因此病毒基因沉默抑制子是植物病毒通用的重要致病机制，对其作用机理的深入研究有可能为设计抗病毒作物提供理论基础。对模式植物拟南芥和黄瓜花叶病毒研究表明，病毒RNA沉默抑制因子可以干扰寄主基因的甲基化、干扰寄主RNA沉默途径主要蛋白如AGO蛋白的功能。但是，这些作用究竟哪一种在病毒致病中发挥关键作用，尚不清楚。对主要作物病毒RNA沉默抑制因子与病毒引致病害的机理则更不清楚，而初步的研究发现许多作物病毒如水稻矮缩病毒编码多个RNA沉默抑制因子，这些不同抑制子在病毒引致病害中如何发挥作用尚不清楚。本项目将以水稻的矮缩病毒、水稻条纹叶枯病毒、水稻黑条矮缩病毒和双生病毒为研究对象，通过鉴定与病毒基因沉默抑制子相互作用的寄主蛋白，并确定其互作的生物学意义，阐明病毒致病及逃避寄主植物防御的分子机理，探讨抗病毒作物的分子育种策略与途径。 4）水稻广谱抗病基因资源的系统鉴定、分子评价和创建。抗病育种需要广泛鉴定具有广谱抗性的抗病主效基因和抗病QTL。本项目将利用关联分析方法对200个水稻核心种质系和主推水稻品种中的稻瘟病菌和白叶枯病菌的抗病基因进行定位，从水稻基因组快速鉴定与抗病相关的单核苷酸多态性，实现基因的规模化克隆；鉴定和分离广谱抗病主效基因；分离水稻中的抗病QTL，发掘具有病原种类非特异性的广谱和持久抗性的基因资源；通过研究上述各类抗性基因的作用机理及其相关的抗病信号传导路径，探索高效利用具有广谱和持久抗性的优良基因改良水稻抗性的途径；根据鉴定的水稻抗稻瘟病基因的序列特征和抗谱，设计并合成新的广谱抗稻瘟病主效基因。5）水稻抗病性的组学基础。理想的植物病害安全控制途径是充分发挥植物自身的抗病机制，但需要从蛋白组、转录组和代谢组水平上对植物抗病机制有整体性的和准确的认识。为此，本研究将利用蛋白组、转录组和代谢组技术全面揭示水稻的抗病机制，发现其中对水稻抗病性有全局性调控作用的关键基因和生物活性化合物或抗菌性化合物，在此基础上探索植物病害控制的新理论和途径。 二、预期目标 本项目的总体目标是围绕我国粮食作物重大病害的控制，在水稻抗病品种的培育和布局、无公害新型杀菌剂的靶标选定两个方面取得有实质性理论意义的创新性结果。五年的具体预期目标为： 1. 水稻稻瘟病等“基因对基因‛病害的抗病品种选育和布局的理论体系和实施方案。包括建立一套可用于局部水稻抗瘟品种选育的广谱致病型菌株，力争利用这些菌株选育出有用的抗病资源或品种；分别提出有关水稻稻瘟病、白叶枯病、和小麦条锈病等病害的抗性品种布局方案，并在粮食生产大省示范基地加以验证。 2. 在水稻主要病原真菌和病原细菌的致病新基因的鉴定及其分子功能研究上取得创新性结果，力争建立新型环保高效杀菌剂设计用候选靶标基因筛选的理论体系。包括从稻瘟病菌和小麦赤霉病菌等中鉴定致病基因和致病力新基因100个左右，明确10-20个关键致病基因及其作用机理，从中确定2-3个为新型环保高效农药设计用候选靶标基因，阐明1-2个致病蛋白的功能结构域和晶体结构。鉴定白叶枯病菌和细条病菌中所有致病相关基因，明确20-30个关键致病基因，筛选出2-3个杀细菌设计用候选靶标基因。 3. 提出利用植物miRNA、病毒vsiRNA和调控植物DNA甲基化水平获得抗病毒植物的新策略。此外，鉴定RSV、RDV、RBSDV和双生病毒编码的基因沉默抑制因子相互作用的寄主因子7－10个，明确这些寄主因子与抑制因子的作用的生物学意义；发现RDV、RSV和RBSDV侵染条件下新的水稻miRNA及其调控的靶基因8－10个；鉴定和发现RDV、RSV和RBSDV侵染条件下具有高表达的病毒vsiRNA 15－20个；明确双生病毒沉默抑制子在抑制DNA甲基化过程中的作用机制。 4. 提出适合我国的广谱抗病水稻品种的分子育种策略，并鉴定、克隆和创建8-10个新的抗稻瘟病和抗白叶枯病主效基因，其中广谱抗病新基因2-3个；发现1-3个有应用前景的优良抗病QTL；建立水稻抗病基因的快速、规模化鉴定分离方法。 5. 从水稻中鉴定、证实具有全局性调控作用的关键基因2-3个，分离10个以上具有生物活性（包括抗菌活性）的化合物，确定它们在水稻病害控制中的利用价值。 6. 通过发表高水平的研究论文和主办和参加国际性大型学术会议，扩大我国植物病理学研究在国际上的影响。包括发表SCI论文200篇左右，其中有国际影响的研究论文10篇以上，申请国家发明专利和PCT10个，主办第10届国际植物病理学大会。 7. 建立一支有国际影响的植物病理学研究队伍，包括力争培养1个国家级研究创新群体、2-3名国家杰出青年基金的获得者、2-3名全国百篇优秀博士论文获得者。 三、研究方案 本项目将根据我国粮食作物病害控制中的实际问题和植物病理学科国际前沿研究及其发展趋势，选取水稻、小麦和玉米的重大病害为对象，尤其是其中的“基因对基因”病害重点对象，围绕抗病品种培育和新型杀菌剂设计用候选靶标的筛选两条主线，设置6个课题，开展下列5个方面与植物病害控制密切相关内容的基础研究。有关主要内容的学术思想、实施的技术途径、特色和创新点、以及取得突破的可行性分析如下： 1， 粮食作物“基因对基因‛病害中病原物致病型变异规律与抗病品种的选育、布局理论 学术思想：国内外一直未能确定“基因对基因”病害中病原物致病型变异规律与抗病基因型之间的关系，以致病原物的致病型尚未从基因型来定义，作物抗病品种的选育处于无的放矢状态，从而生产上经常出现品种抗病性丧失和病害大流行。我们认为：从分子遗传学的角度来看，病菌的小种或致病型是各无毒基因的组合。因此，在自然界小种的数量是非常庞大的。但如果按照无毒基因型来分类小种，不仅可以显著减少小种数量，还可以确定病菌群体具有广谱致病性的小种以及用于抗病品种的筛选筛选的小种。 技术途径：本课题将选取水稻的稻瘟病、白叶枯病、细条病和小麦条锈病，从“万能感病‛品种上广泛连续收集各病菌，在近等基因系上测定各病菌的无毒基因型，发现各病菌小种或致病型的时空分布规律，分别设计针对这些“基因对基因‛病害抗性品种布局的方案。同时，探讨利用一些广谱致病型小种，在相应地区开展有针对性的抗病资源筛选和品种抗病性改良，以期建立抗病品种的选育和布局的理论。此外，通过全基因组比较、基因敲除和互补等技术，深入解析无毒基因的分子功能及其变异的遗传机制，奠定小种的分子检测技术基础。 特色与创新点以及可行性分析：从学术思想上，本研究首先从分子遗传学上将病菌的小种或致病型定义为各无毒基因的组合，并认为病菌群体中广谱致病性小种在选择压力下的迅速上升是导致品种抗病性丧失的原因。因此，抗病品种的培育和布局应针对这类小种。从技术路线上，本研究将从没有选择压力的“万能感病‛品种上广泛连续收集病菌，只有这样才能准确测定病菌群体的小种组成及其变化。项目组在“十一五‛973项目实施过程中已发现我国稻瘟病菌群体致病型具有按县聚类的趋势，籍此提出了按县筛选和布局抗瘟品种的方案，并成功地实施了抗瘟品种布局技术的大面积示范。同时，项目组还在一些县市的稻田发现了广谱致病性小种，利用该小种筛选出了适用的抗瘟品种，为本项目建立抗瘟品种选育和布局理论提供了坚实基础。此外，在上一个973项目实施过程中，本项目组还建立了一些研究基地，为本项目相关内容的实施提供了条件。 2， 粮食作物主要病原真菌和细菌致病基因的系统鉴定与杀菌剂设计用候选靶标基因的发现 学术思想：病菌致病性是由多基因控制的性状，有些基因起关键作用，有些基因是病原物所特有的,其中有些特有的关键致病基因及其产物可以作为设计新型杀菌剂的候选靶标，针对此类靶标研发出的杀菌剂将具有环保和特异性强的特点。 技术途径：本项目将以稻瘟病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和小麦赤霉病菌为主要对象，通过全基因组系统插入突变、大规模基因敲除和互补，结合致病性和致病力测定确定致病性基因，通过表达谱和q-PCR分析揭示致病基因间的相互关系。通过分析基因产物的亚细胞定位、功能结构域、活性测定或受调控的基因来揭示致病基因的分子功能，筛选基因产物定位于细胞壁、细胞质膜的关键致病基因作为候选靶标，开展其蛋白质的晶体结构研究，为筛选活性化合物奠定基础。 特色与创新点以及可行性分析：本项目认为：病原物特有的关键致病基因及其产物可以作为设计新型杀菌剂的候选靶标，针对此类靶标研发出的杀菌剂将是绿色环保的。类似研究在国内外报道很少。本项目涉及的主要病菌对象的全基因组序列已经公开，项目组已测定了相应病菌的全基因组序列。同时，项目组构建了稻瘟菌、水稻黄单胞菌的大规模插入突变体库，获得了国外尚未报道的一批致病基因的突变体。此外，项目组已经敲除小麦赤霉病菌的所有蛋白激酶的基因。本研究内容无论是学术思想还是技术路线上都应该能完全实施。 3， 植物病毒基因沉默抑制子作用机理及其在抗病毒作物分子育种中利用 学术思想：绝大多数病毒利用自身编码的基因沉默抑制子突破植物的基因沉默防御体系侵染植物，因此病毒基因沉默抑制子是植物病毒通用的重要致病机制。改变与病毒基因沉默抑制子互作的寄主蛋白的表达有可能是创建抗病毒作物的新途径。 技术途径：选择水稻主要病毒为对象，通过缺失或点突变病毒编码相关蛋白的基因，将其接种到GFP基因被沉默的植物上观察GFP是否恢复表达。如果没有突变或者缺失的蛋白能使GFP恢复表达，其突变或者缺失不能使GFP恢复表达，说明该蛋白是基因沉默抑制子。通过酵母双杂交、Pull-down和双分子荧光互补技术分离、鉴定与病毒基因沉默抑制子互作的寄主蛋白；通过RNAi等方法转基因分析确定改变与病毒基因沉默抑制子互作的寄主蛋白的表达是否影响水稻对病毒的抗性。 特色与创新点以及可行性分析：有关与病毒基因沉默抑制子互作的寄主蛋白的研究报道不多，通过改变与病毒基因沉默抑制子互作的寄主蛋白基因的表达来创建抗病毒植物的报道更少。本项目组在上个973项目实施过程中已经鉴定了一些水稻病毒的基因沉默抑制子，并分离了与病毒基因沉默抑制子可能互作的水稻蛋白，未为本内容的完成奠定了基础。 4， 水稻广谱抗病基因资源的系统鉴定、分子评价和创建 学术思想：植物中存在抗病性特异的QTL，聚合在病菌不同侵入阶段发挥作用的QTL可以获得持久广谱的抗病植物。各个无毒基因对于病菌的影响各不相同，有的无毒基因对于病菌的寄生适合度极其重要，失去该无毒基因使病菌难以在野外生存，对应于此无毒基因的R基因介导的抗病性应该是持久的。 技术途径：通过广泛接种测定发现影响植物病斑数和大小的QTL，通过转基因确定它们对植物抗病性和其它性状的影响。利用广谱致病的小种接种，发现具有广谱抗病的品种，通过图谱定位法从中分离R基因，并通过转基因确定这些基因是否介导广谱抗病性。通过关联分析方法广泛分离R基因。 特色与创新点以及可行性分析：虽然国际上近年从水稻和小麦上分离了少数几个抗病QTL，但聚合在病菌不同侵入阶段发挥作用的QTL可以获得持久广谱的抗病植物的学术观点尚未得到确认。虽然有研究报道鉴定了广谱抗病的R基因，但目前尚未分离到该基因。项目组通过广泛筛选，已经获得了抗稻瘟菌许多小种的2个水稻品种，并确定分别由单个遗传位点控制的，为本项目分离广谱抗病R基因奠定了基础。项目组已经从水稻中鉴定了一些抗病QTL，为本项目分离和聚合抗病QTL奠定了基础。另外，通过关联分析方法广泛分离R基因尚未在水稻上报道，项目组已经获得了可能含有不同抗稻瘟病R基因的核心品种资源。 5， 水稻抗病性的组学基础 学术思想：我们目前有关抗病性的分子认识是基于对部分基因、蛋白质或小分子化合物的研究，是非常有局限性的。建立理想的植物病害安全控制途径需要充分地认识和发挥植物自身的抗病机制，需要蛋白组、转录组和代谢组水平的研究以获得有关植物抗病机制的整体性和准确性知识。 技术途径：以水稻抗瘟近等基因为材料，利用蛋白组、转录组和代谢组技术，结合生物信息学分析技术，确定接种稻瘟病菌后在抗病性表达初期阶段诱导的基因、蛋白和低分子化合物，选取有调控作用的基因和蛋白质，通过转基因确定其对水稻抗病性的影响；或选取诱导化合物中新的化合物，测定其对病菌的影响。 特色与创新点以及可行性分析：目前国内外相关水稻抗病组学的报道还没有。项目组在前期利用microarray技术已经就抗、感稻瘟病水稻品种间的基因表达差异进行了比较，开展了相关材料的初步蛋白组和代谢组分析。同时，本项目组已经具备实施本研究内容的设备条件。 四、年度计划 年度 研究内容 预期目标 第 一 年 1、从普感水道品种上分离鉴定稻瘟病菌、白叶枯菌，开始抗病品种筛选；建立稻瘟菌5个无毒基因的克隆群体，分析一个无毒基因的变异规律；采集、分析小麦条锈菌标样，开展小麦抗性鉴定；配制抗瘟育种杂交组合。 2、广泛鉴定稻瘟病菌和小麦赤霉病菌的致病性基因和致病力基因，确定其中的关键致病基因。 3、通过系统插入和定点突变构建水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌突变体库，并开展致病力鉴定筛选；开展tal家族基因及HrpG和HrpX调控的T3SEs的多态性研究；通过敲除、互补和转基因等途径研究水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌中avr、xopF1、xopI、xopK和xopN的功能。 4、构建 感染RDV水稻和叶蝉small RNA的克隆建库，Deep sequencing测序及生物信息学分析；分析水稻RNA抗病毒沉默抑制路径相关基因的表达谱；研究RDV Pns10或（和）Pns11对病毒和叶蝉小RNA代谢的影响；筛选与双生病毒及RBSDV基因沉默抑制子发生互作的寄主因子，并进行初步鉴定。 5、系统分析水稻全基因组中NBS-LRR型蛋白；对200个水稻核心种质系和主推品种广泛接种稻瘟病菌、白叶枯菌、病毒病等病菌，测定发现影响水稻病斑数和大小的抗病主效基因和抗病QTL。 6、以水稻近等基因系等为材料,分别测定蛋白组和转录组的表达谱特性；克隆和分析神经酰胺酶等基因。 1、每个县市从不同的水稻植株上共分离不少于100个菌株，完成其致病型测定，提出不同县市抗瘟、抗白叶枯和细条病的品种田间筛选方案；完成200份小麦条锈病菌毒性鉴定，完成100份小麦品种抗条锈病鉴定；建立5个无毒基因克隆体系，明确Avr-Pizt的变异特点。 2，从稻瘟病菌和小麦赤霉病菌中鉴定致病基因和致病力新基因100个左右，确定10-20个关键致病基因。 3，获得水稻白叶枯病菌（Xoo)和水稻细条病菌(Xooc)突变体3000个以上，鉴定20-30个致病相关基因，其中新基因10-20个；明确avr、xopF1、xopI、xopK和xopN的致病功能。 4、成功构建small RNA的克隆库，并得到Deep sequencing测序结果；获到水稻RNA抗病毒沉默抑制路径相关基因的表达谱;筛选并克隆与RBSDV及双生病毒互作候选因子10-15个。 5、鉴定出1-2个新的NBS-LRR型抗稻瘟病基因；从水稻种质系和主推品种中鉴定出3-5个抗稻瘟病、抗白叶枯病的主效基因，1-3个抗稻瘟病、抗白叶枯病、抗病毒病的抗病QTL。 6、得到一些在寄主与病原菌互作过程中表达、积累差异的基因、蛋白、或者化合物。 7、发表SCI论文20-30篇，其中IF>5的2-3篇；申请国家发明专利1-2个；培养研究生20-25名。 第 二 年 1、继续分离稻瘟病菌、白叶枯病菌和细条病菌，继续抗病品种的田间筛选；继续采集并鉴定小麦条锈菌标样，继续进行小麦品种抗病性鉴定并开展抗病基因型分析；开展基于Avr-Pid2等新的无毒基因关联遗传学分析；研究Avr-Pia等无毒基因的变异特点和Avr-Pizt变异的检测技术；继续配置杂交组合，并进行后代选择。 2、分别确定稻瘟病菌、小麦赤霉病菌关键致病基因的分子功能，解析与其直接互作的上下游因子；开始稻瘟病菌关键致病蛋白的表达和晶体形成研究；开始解析小麦赤霉病菌产生DON毒素的分子途径及抗DON毒素的分子机制；开始新型杀菌剂氰烯菌酯作用靶标基因的鉴定。 3，继续构建水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌突变体库，并开展致病力鉴定筛选；分析水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌tal基因与水稻互作关系，鉴别新的harpin蛋白以及harpin蛋白在植物中的受体；研究Hpa1-PIP1;4的互作关系； 4、研究 OsRDR6的分子功能及其在抗病毒中作用；鉴定并明确与RBSDV互作蛋白的关健氨基酸基序及互作的特异性；利用病毒诱导的基因沉默研究互作蛋白在RBSDV侵染过程中的功能；构建RBSDV抑制子过量表达和抑制表达实验载体进行转基因实验；检测双生病毒感染后病毒基因组甲基化水平，比较卫星DNAβ的存在是否影响病毒基因组甲基化。 5、结合已经克隆的抗稻瘟病主效基因Pi-2、Pi-9等的序列信息特征进行生物信息学分析，并分析对应的稻瘟病菌小种抗谱信息，分子设计并人工合成新的稻瘟病抗性基因；对鉴定出的抗病主效基因精细定位，克隆候选基因，候选基因的遗传功能互补验证；利用关联分析方法结合与抗病相关的单核苷酸多态性位点信息，从水稻基因组中规模化和快速克隆抗病基因。 6、选取其中可能在植物抗病防御反应中发挥调控作用的蛋白和基因，进行生化及分子生物学功能分析；对变化较大化合物的合成、代谢途径进行分析、克隆其途径中的关键基因，并进行相应的分析；利用LC/MS/MS法建立鞘脂检测平台，碱性鞘脂代谢关键酶的生化特性分析。 1、在每个县市继续完成100个不同菌株的致病型测定，初步确定其中优势致病型和广谱致病型菌株；获得3-6份抗瘟品种资源，2-3份抗白叶枯病和细条病品种资源；完成200份小麦条锈病菌毒性鉴定，明确条锈菌毒性发生频率；完成50份小麦品种抗条锈病鉴定，筛选出一批优良的抗病材料；获得Avr-Pid2等新无毒基因的候选基因，初步建立Avr-Pizt变异的检测技术；发表研究论文2-4篇。 2、明确5个致病关键基因作用的分子机理。 3、获得Xoo和Xooc各4000个以上突变体，完成这些突变体的致病力检测；鉴定到30-50个致病相关基因；明确部分tal基因与水稻中的R或S基因的对应关系；鉴别新的harpin类蛋白；明确Hpa1-PIP1;4的互作关系。 4、筛选获得抗RSV/RBSDV 的OsRDR6转基因水稻转基因株系50个以上；鉴定与RBSDV和双生病毒基因沉默抑制子互作的寄主因子2-3个；明确双生病毒感染后，病毒基因组甲基化变化。 5、完成2-3个目标基因的精细定位工作；获得1-2个抗稻瘟病、抗白叶枯病的主效基因；人工合成1-2个新的抗稻瘟病主效基因。 6、获得有待研究的基因10-20个，获得10个以上基因的转基因T0代材料。 7，发表SCI文章30-40篇，其中IF>5的3篇以上；申请国家发明专利2-3项；培养研究生30-35名。 第 三 年 1、继续分离稻瘟病菌、白叶枯病菌和细条病菌，继续抗病品种的田间筛选；分别利用不同年份的优势致病型和广谱致病型菌株接种在上述地区或县市表现抗病的水稻品种，并分析这些品种抗病性的遗传；验证Avr-Pid2等新无毒基因的候选基因片段的功能；进一步精细定位Avr-Pi1、Avr-Pi2、Avr-Pi4a、Avr-Pid3等无毒基因；优化Avr-Pizt变异的检测技术，建立其他无毒基因的检测方法继续；继续鉴定小麦条锈菌标样，开展小麦品种抗病性鉴定与抗病基因型分析；继续配置水稻杂交组合，并进行后代筛选。 2、继续稻瘟病菌和小麦赤霉病菌关键致病基因的分子功能、关键致病蛋白的结晶形成和晶体结构研究；分别从稻瘟病菌、小麦赤霉病菌关键致病基因中筛选无公害杀菌剂设计用候选靶标基因；继续解析小麦赤霉病菌产生DON毒素的分子途径及抗DON毒素的分子机制；解析新型杀菌剂氰烯菌酯的靶标基因的分子功能。 3、继续构建水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌突变体库，并开展致病力鉴定筛选；开展致病相关基因的鉴定及其作用机理研究；鉴定水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌TAL蛋白在水稻细胞中的作用靶标；鉴定harpin蛋白的植物受体及其非寄主抗性的信号途径组分；研究效应蛋白向寄主植物细胞运转的情况。 4、研究RDV Pns10或（和）Pns11 RNAi水稻中small RNA表达特征；分析抗RSV/RBSDV转基因水稻后代抗病性；克隆并鉴定RBSDV侵染水稻诱导产生的miRNA、并通过沉默实验进行功能验证和靶标基因克隆；分析RBSDV互作因子在病毒侵染致病过程中的功能；开展双生病毒抑制子的功能研究。 5、继续克隆抗病主效基因和抗病QTL的候选基因，并对候选基因进行遗传功能互补验证；利用广谱致病的病原菌小种接种，鉴定广谱和持久抗性的基因；分析目标抗病基因调控抗病反应的分子机理，以及其启动的抗病信号传导路径；从抗病信号传导路径中发掘可能具有应用前景的抗病基因。 6、采用水稻或拟南芥为材料，通过基因突变或过量表达等技术，制备转基因遗传学分析材料；利用相关抑制剂处理水稻原生质体，检测相关抗性信号及基因表达；检测细胞内鞘脂含量变化；神经酰胺酶和神经酰胺激酶的亚细胞定位等。 1、初步确定我国稻瘟病菌、白叶枯病菌和细条病菌群体致病型的时间动态规律；克隆到1个新的无毒基因；构建Avr-Pi1、Avr-Pi2、Avr-Pi4a、Avr-Pid3等的遗传或物理图谱；完成200份小麦条锈病菌毒性鉴定，明确条锈菌毒性发生频率；完成50份小麦品种抗条锈病鉴定，筛选出一批优良的抗病材料。 2、再明确5个致病关键基因作用的分子机理；确定2-3个可用于环保高效杀菌剂设计用的候选靶标基因；阐明2-3个致病关键蛋白的功能结构域和晶体结构；明确新型杀菌剂氰烯菌酯作用的靶标蛋白及其基因。 3、再获得Xoo和Xooc各4000个以上突变体，完成这些突变体的致病力检测；鉴定到30-50个致病相关基因；明确部分tal基因与水稻中的R或S基因对应关系；鉴定harpin类蛋白的植物受体；明确XopF1、XopI、XopK和XopN是否向植物细胞转运。 4、明确RDV侵染RDV Pns10或（和）Pns11转基因水稻后RDV vsiRNA的分布特点；筛选获得抗RSV/RBSDV无标记基因的转基因材料50个；克隆鉴定RBSDV侵染水稻诱导产生的miRNA，并鉴定其调控的靶标基因2-3个；初步明确2-3个互作因子在RBSDV侵染致病过程中的生物学意义；获得双生病毒抑制子表达量高的转基因拟南芥植株。 5、获得3-5个抗稻瘟病和白叶枯病的主效基因；获得1-3个具有广谱和持久抗性的抗病QTL；明确2-4个目标抗病主效基因调控抗病反应的分子机理，以及其启动的抗病信号传导路径。 6、获得目的基因突变或过量表达的水稻或拟南芥；明确部分研究基因和蛋白的生物化学、生物学功能、或者亚细胞定位以及组织表达模式。 7，发表SCI文章30-40篇，其中IF>5的3篇以上；申请国家发明专利3-5项；培养研究生30-35名。 第 四 年 1、继续分离稻瘟病菌、白叶枯病菌和细条病菌；继续田间测定从当地筛选出的抗瘟品种的抗瘟性，并利用优势致病型和广谱致病型菌株室内测定这些品种的抗瘟性，获得与其抗瘟性连锁的标记；开展Avr-Pi2等新的无毒基因关联遗传学分析，优化Avr-Pia等无毒基因的检测技术；检测田间稻瘟病菌群体中无毒基因型，分析Avr-Pid2等新克隆的无毒基因田间群体的变异特点；继续条锈菌标样分析和小麦品种抗病鉴定，分析条锈病菌“越夏区”小麦种植面积和种植结构，开展小麦品种抗病性鉴定与抗病基因型分析；继续抗瘟新品种选育。 2、继续稻瘟病菌和小麦赤霉病菌关键致病基因的分子功能、关键致病蛋白的结晶形成和晶体结构研究；分别从稻瘟病菌、小麦赤霉病菌关键致病基因中筛选无公害杀菌剂设计用候选靶标基因；继续解析小麦赤霉病菌产生DON毒素的分子途径及抗DON毒素的分子机制；解析新型杀菌剂氰烯菌酯的靶标基因的分子功能。 3、继续进行水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌致病关键基因的鉴定；筛选农药设计用候选靶标基因（产物）；继续开展tal基因功能性鉴别；筛选抑制T3SS形成的化合物；研究Hpa1-PIP1;4互作多植物防卫反应信号传导的影响。 4、深入研究分析RDV介导的病毒vsiRNA的代谢路径；分析抗RSV/RBSDV转基因水稻的抗病毒机制；明确miRNA及其调控的靶标基因在RBSDV侵染致病中的功能；分析高表达双生病毒抑制子对拟南芥内源基因甲基化的影响；明确与双生病毒抑制子互作的寄主因子。 5、继续通过芯片分析或者转录组测序分析目标抗病基因调控抗病反应的分子机理，以及其启动抗病信号传导路径；分析抗病信号传导路径中可能具有重要应用前景的候选基因的抗病分子机理。 6、通过接菌分析和测定转基因水稻或拟南芥中目的蛋白或基因的表达活性、代谢调控活性；检测原生质体水平和植株水平抗病相关基因和鞘脂代谢相关酶基因的表达；检测病原菌接种下过表达和RNAi株系的鞘脂含量的变化。 1、确定从异地获得抗瘟、抗白叶枯病和细条病资源的可用性；获得Avr-Pi2等新无毒基因的候选基因；建立Avr-Pia等无毒基因的检测技术；明确田间病菌致病型（无毒基因型）的发生频率；明确Avr-Pid2等新克隆的无毒基因的变异特点；明确“越夏区”条锈菌田间菌群的致病型和菌群结构的时空变化；系统评价主栽小麦品种抗病性水平及其所携带的抗病基因； 发表SCI论文5-6篇。 2、基本确定小麦赤霉病菌合成DON毒素的分子途径；明确小麦赤霉病菌抗DON毒素的机制；明确新型杀菌剂氰烯菌酯作用的靶标蛋白的分子功能；发表SCI论文10篇以上，其中2篇的SCI指数>5。 3、明确Xoo和Xooc中20-30个关键致病基因；明确2-4个tal基因与水稻的对应关系；明确Hpa1-PIP1;4对细胞外植体 H2O2向原生质转运的调控作用。 4、明确抗RSV/RBSDV转基因材料的抗病毒机制；明确2-3个互作因子以及miRNA 2-3个靶标在RBSDV侵染致病中的生物学功能；鉴定RBSDV侵染水稻是表达的病毒vsiRNA 4-6个；明确双生病毒抑制子高表达对拟南芥内源基因及全基因组甲基化的影响；明确与双生病毒抑制子互作的寄主因子；发表SCI论文8-10篇，申请专利1-2项。 5、明确3-5个目标抗病主效基因调控抗病反应的分子机理，以及其启动的抗病信号传导路径；初步明确抗病信号传导路径中可能具有重要应用前景的抗病主效基因和抗病QTL的抗病分子机理。 6、明确得到蛋白的生物活性、酶的活性、基因表达情况；获得抗病相关基因的表达与鞘脂代谢变化间的规律；发表论文3-4篇、培养研究生3-5名。 7、发表SCI文章40篇以上，其中IF>5的5篇以上；申请国家发明专利3-5项；培养研究生30-35名。 第 五 年 1、分离与所筛选品种抗瘟性共分离或紧密连锁的分子标记；制定品种合理布局方案；验证Avr-Pi2等新无毒基因的候选基因片段的功能，建立Avr-Pid2等新克隆的无毒基因检测技术；继续条锈菌标样分析和小麦品种抗病鉴定；分析条锈病“越夏区”小麦种植面积和种植结构；开展小麦品种抗病性鉴定与抗病基因型分析； 2、继续针对稻瘟菌和赤霉菌个别关键致病蛋白，进行其结合化合物的筛选与设计研究；完善上述其它各研究内容。 3、继续筛选Xoo和Xooc中农药设计用候选靶标基因（产物）；确定tal和harpin类蛋白的作用 靶标；研究Hpa1-PIP1;4互作对效应蛋白向寄主植物细胞运转及对水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌致病性的调控作用； 4、利用鉴定的互作因子、RBSDV侵染水稻诱导的miRNA、RBSDV编码的vsiRNA进行抗病毒新措施的研究，提出获得抗病毒作物的新策略；体内或体外试验检测与双生病毒抑制子互作的寄主蛋白的活性，明确其互作的生物学意义。 5、继续分析抗病信号传导路径中可能具有应用前景的候选基因的抗病分子机理；探索适合我国农业生产的广谱抗病水稻品种的分子育种策略。 6、对上述转基因水稻或拟南芥的稳定遗传材料进行接种分析、植物的抗病性／抑菌活性分析、相关基因的表达分析；研究重要的因子的互作蛋白。 1、提出抗瘟品种选育的策略，选育2-3个抗瘟品系；提出抗白叶枯病和细条病品种选育的策略；建立“越夏区”小麦抗病品种合理布局方案，提出小麦抗条锈病育种策略；克隆获得Avr-Pi2等新无毒基因。 2、初步提出环保高效杀菌剂设计用靶标基因的筛选理论；发表SCI论文3-5篇，其中至少1篇的SCI指数>5。 3、为新型杀细菌剂的设计和研发提供候选靶标1-2个；筛选抑制T3SS形成的化合物1-2种；明确Hpa1-PIP1;4互作对效应蛋白向寄主植物细胞运转及水稻白叶枯病菌和水稻细条病菌致病性的调控作用。 4、获得机制清楚的抗RSV/RBSDV两种病毒的转基因水稻新材料4-5个；完成互作因子、miRNA及其靶标、病毒vsiRNA在RBSDV致病过程中的功能分析，进行抗病毒新材料的抗性研究；明确双生病毒沉默抑制子在抑制DNA甲基化过程中的作用机制。 5、明确抗病信号传导路径中具有重要应用前景的抗病主效基因和抗病QTL的抗病分子机理；确定利用抗病基因培育具有广谱和持久抗性水稻品种的途径，提出适合我国农业生产的广谱抗病水稻品种的分子育种策略。 6、明确10个以上代谢途径基因在抗病过程中的作用。 7、发表SCI文章45-50篇，其中IF>5的5篇以上；申请国家发明专利3-5项；培养研究生30-35名。