2010CB911900-免疫相关重要蛋白质的生物学研究 (2).Doc

项目名称： 免疫相关重要蛋白质的生物学研究 首席科学家： 张学敏 中国人民解放军军事医学科学院 起止年限： 2010年1月-2014年8月 依托部门： 总后勤部卫生部 一、研究内容 针对免疫识别、免疫应答与免疫耐受的主要科学问题，研究从免疫细胞对抗原的识别至产生效应的整个过程所涉及免疫细胞（T、B、NK、DC、Mφ等）的系列蛋白质分子及其在免疫过程中的功能，从分子水平阐明机体产生各种正、负免疫应答的细节和关键点，不同应答效应及其调控的机制，进而掌握免疫过程及其调节的特点和规律。 1. 与免疫识别相关的蛋白质结构与功能研究。研究NK细胞天然免疫受体及其功能效应的调控机制，发现天然免疫“泛特异性识别”的生物学特点和结构信息证据，发现新的天然免疫识别受体（或新功能）；研究以NKG2D为核心的天然免疫识别受体群谱相互作用及其与配基相互作用特征；解析DNAM-1 /nectin-2/CD155，NKp80/AICL，CRACC/CRAAC等天然免疫识别受体的新结构或天然免疫识别受体相关的复杂蛋白质结构；探讨自主发现的天然识别受体NKG2D转录抑制子HMBOX1的结构和功能。 2. 与免疫应答相关的蛋白质结构与功能研究。揭示在肿瘤发生早期天然免疫效应细胞的活化及对肿瘤特应性免疫应答的激活作用及其作用的分子机理。探讨LIGHT 等配体介导的肿瘤微环境是否集聚处女NK细胞或扩增已激活的NK细胞，确定LTβR或HVEM信号如何参与NK活化的调节，研究NK 细胞与CTL细胞之间的调节作用，分析NK细胞调节CTL 是作用于激活期还是效应期，阐明NK细胞活化CTL的分子机制；解析穿孔素及“孤儿”颗粒酶的晶体结构，阐明穿孔素和“孤儿”颗粒酶在CTL杀伤中的作用及发挥作用的结构基础；解析自主发现CD23家族蛋白质LSECtin的CRD区蛋白晶体结构，通过IP-质谱鉴定并验证LSECtin在免疫细胞上的配体，探讨LSECtin对T 细胞、NK cell的调控机制。 3. 与免疫调节和免疫耐受相关的蛋白质结构与功能研究。探讨15个自主发现的新分子以及5个关注的分子在免疫调节和免疫耐受中的作用和分子机制，研究不同的分子在不同细胞内的表达调控模式，重点关注这些分子在DC和巨噬细胞中的作用，兼顾重要的分子在T细胞和B细胞抗原受体(TCT/BCR)中的作用机制，同时研究这些分子在免疫调节中相互作用分子，并且建立动物模型，探讨这些分子在感染、抗原特异性免疫应答以及免疫耐受中的作用。 4. 参与免疫信号通路调控的蛋白质结构与功能研究。应用最新质谱技术等手段研究CD40 介导的NF-kB通路激活过程中重要蛋白质复合体的形成及活化机制，并探讨复合体关键组分对该通路的调控机制；深入研究CUDEC2等蛋白质调控NF-kB信号通路的机制；深入研究CUDEC2等蛋白质调控IRF通路的机制及在抗感染免疫中的作用；探讨DLC，ORF60，UBA3和TAB1/p38复合体对NF-kappaB途径和MAPKs途径的负性调控机制；以I型糖尿病NOD小鼠为模型研究导致 NF-kappaB通路和MAPKs通路异常高水平激活的蛋白质。 二、预期目标 总体目标： 从我国蛋白质科学研究的重大需求以及挖掘重要免疫相关分子的结构、功能和作用机理等重大科学问题出发，建立基于蛋白质科学的免疫学研究新模式，即应用蛋白质及其复合体结构与功能研究的方法，深入发掘并解析免疫过程中新的蛋白质分子、相互作用网络、泛素化等翻译后修饰、结构特点及其定位规律，在免疫识别、免疫应答与耐受和免疫调节的分子机理研究上取得重要突破，为攻克感染、肿瘤或自身免疫疾病提供坚实的理论基础，为相应的干预治疗提供新的策略和新的靶点。 五年预期目标: 1、 通过质谱技术成功鉴定免疫识别、应答活化及调节过程中重要信号通路中的蛋白质复合体，发现10-15个新的调控分子并揭示其作用机制；此外，揭示已有工作基础的15个免疫相关新蛋白质分子在免疫识别、免疫调节和免疫耐受中的作用和分子机制，为免疫相关疾病的药物研发提供2-3个候选作用靶点。 2、 较完整阐明2-3个天然免疫受体的表达调控或功能调节机制；发现并解析1个新的天然免疫受体调控蛋白的功能结构特征；解析1个天然免疫识别受体的新结构或天然免疫识别受体相关的复杂蛋白质结构；阐明1个基于天然免疫识别受体的免疫突触的形成结构和蛋白质组成。 3、 揭示在肿瘤发生早期天然免疫对获得性免疫的激活作用机制，探明细胞毒性T淋巴细胞特应性清除肿瘤的分子机制，揭示抗肿瘤免疫效应的功能与结构的关系，加深对免疫系统排斥肿瘤机理的认识。 4、 发表高水平研究论文30篇以上，其中IF>20论文3篇，IF>10论文5篇。获得一批高水平的拥有自主知识产权的技术成果，申请专利10项以上。 5、 培养一批在免疫学和蛋白质科学领域具有国际竞争力的优秀中青年科学家和后备人才；造就一支跨学科、跨领域、精诚合作、团结奋进的科研队伍。 三、研究方案 学术思路 对免疫识别、免疫应答/耐受、免疫调节过程中的的极其复杂的免疫蛋白质系统，目前缺乏整体了解，特别是对一些重要蛋白质在空间和时间上的表达、修饰、定位，以及相互作用和在执行功能上的相互关系了解甚少。本项目以免疫识别-免疫应答/耐受-免疫调节为主线，以NK/NKT、CTL、Treg、DC和Mφ等有较好研究基础的免疫细胞为主要模型，通过蛋白质技术发现新的免疫相关蛋白质及其复合体，解析结构信息，探讨其在免疫识别、免疫应答/耐受、免疫调节过程中的功能；分析磷酸化、泛素化等翻译后修饰对其功能的影响，并揭示免疫信号通路的调控机制。本项目还将深入研究已自主发现的系列新分子以及其它重要蛋白质在免疫过程中的功能和机制。以上努力，使我们可能解决免疫学中一系列亟待突破的重要科学问题：1）天然免疫识别“泛特异性”的生物学特点及识别受体的结构与功能；2）天然免疫对获得性免疫细胞活化的分子机理和抗肿瘤分子机制; 3）免疫调节和免疫耐受的分子机制，特别是免疫应答过程中的负向调节机制; 4）参与免疫调节重要信号通路的关键蛋白质发现与功能揭示。这些重要免疫学科学问题的研究一旦有所突破，将对人类疾病的防治带来巨大益处。 技术途径 1. 表达模式研究：所需使用的免疫细胞一方面使用既有细胞系，另一方面通过原代分离和体外培养产生。 2. 免疫细胞功能调节研究 3. 信号传导通路研究 4. 相互作用分子研究 四、年度计划 年度 研究内容 预期目标 第 一 年 1. 选择一批受体结构域基因片段进行克隆表达；进行DNAM-1、nectin-2等天然免疫识别相关蛋白的基因表达、蛋白纯化和批量制备。 2. 构建不具活性的穿孔素前体；分离鉴定与颗粒酶K相作用的底物；表达颗粒酶H和M；表达重组LSECtin蛋白，进行结晶条件摸索和高质量结晶实验，衍射分析CRD区结构。 3. 初步完成所关注免疫分子在免疫识别以及免疫调节中的表达调控模式，完成一些重要表达载体的构建和鉴定以及一些细胞系的建立鉴定。 4. 建立激活信号转导通路细胞模型；观察CD40激活信号通路的动态变化过程情况；研究CUEDC2与IKKε的相互作用及其动态变化；分析CUEDC2对IKKb磷酸化水平调控以及激酶活性。 5. 探讨DLC对p38途径发挥抑制作用所依赖的关键结构域和关键氨基酸；探讨TAB1/p38a相互作用的结构基础和调控机制；检测I型糖尿病病人及动物模型的原代组织细胞中RGS1、SH2B3、PTPN2和PTPN22是否有表达异常。 1. 建立天然免疫受体表达的研究平台和相关技术；1-2个天然免疫受体蛋白或蛋白结构域的表达获得成功。 2. 表达具生物活性的穿孔素及其功能片段；分离鉴定颗粒酶K的作用底物；确定LSECtin CRD区的结构模型。 3. 完成10-15个免疫分子在原代免疫细胞系内的表达模式和调控模式研究；构建原核和真核等表达载体30-50个；建立稳定干扰或过表达细胞系20-30种。 4. 建立CD40激活信号转导通路细胞模型；明确CUEDC2与IKKε的相互作用。 5. 明确DLC发挥作用的结构基础；明确TAB1/p38a相互作用的结构基础和调控机制；明确I型糖尿病状态RGS1、SH2B3、PTPN2和PTPN22是否有表达异常。 6. 发表SCI收录文章2-4篇。 第 二 年 1. 天然免疫识别相关蛋白的克隆、表达、纯化、单抗制备；初步研究以NKG2D/ NKG2A为核心的突触蛋白；开展天然免疫识别相关蛋白受体/配体的相互作用研究。 2. 解析穿孔素及其功能片段的结构；研究颗粒酶H和M对细胞的杀伤效应及杀伤机制；探索颗粒酶H和M的结晶条件，进行晶体结构分析。 3. 检测LSECtin对T细胞和NK细胞的功能影响；LSECtin与免疫细胞进行IP实验，差异蛋白进行质谱鉴定。 4. 完成所关注免疫分子对免疫细胞生物学功能的影响，初步完成相关的信号传导通路的研究。 5. CD40信号复合体的分离和鉴定；检测CUEDC2对病毒及Poly(I:C)激活的IRF转录活性、IKKε磷酸化及激酶活性的影响并进一步验证；CUEDC2对IkBa磷酸化水平以及蛋白质稳定性的调控分析。 6. 检测DLC抑制p38途径关键结构基础的结合蛋白；探讨ORF60和UBA3抑制JNK途径所依赖的关键结构域和关键氨基酸；探讨TAB1/p38a相互作用在肿瘤和自身免疫病中的可能应用。 1. 获得1-2个天然免疫受体蛋白并成功纯化；初步获得以NKG2D/ NKG2A为核心的突触蛋白的组成解析；获得1个天然免疫受体蛋白微晶。 2. 获得穿孔素活性片段的晶体结构；确定颗粒酶H及M在CTL杀伤肿瘤细胞的作用；确定LSECtin对T和NK细胞的功能影响；明确LSECtin在T和NK细胞上的候选配体分子。 3. 完成8-10个免疫分子对树突状细胞、单核巨噬细胞以及其他免疫细胞的细胞因子分泌等基本免疫学功能的影响研究；完成8-12个免疫分子在免疫细胞内在受到TLR、NLR、RLH等处理后信号传导通路变化的检测。 4. 质谱鉴定刺激不同时间形成的CD40信号复合体成分；初步明确CUEDC2对NF-κB通路的调控作用。 5. 揭示DLC对p38途径抑制作用的机理；明确ORF60和UBA3发挥作用的结构基础。 6. 发表SCI收录文章4-10篇。 第 三 年 1. 摸索天然免疫识别相关蛋白晶体生长条件；制备单抗和小分子靶点探针；验证以NKG2D/NKG2A为核心突触蛋白的核心成分并对其进行成像分析； 2. 天然免疫识别相关蛋白的突触形成和NK细胞活化的作用；测定穿孔素对细胞的损伤作用；分析线粒体膜通透性、活性氧自由基、促凋亡因子等的变化；激活NK细胞，并用CFSE标记，再过继转移到荷瘤鼠，分析这些细胞的增殖作用；验证TIGIT或HVEM信号在LIGHT等介导肿瘤排斥中的作用。 3. 检测LSECtin对T和NK细胞胞内信号通路和相应转录因子的变化；通过LSECtinKO小鼠研究LSECtin在肝脏腺病毒感染清除中的作用。 4. 验证复合体成分；检测CUEDC2对IRF3磷酸化、二聚化以及入核能力的影响；检测CUEDC2是否参与调控IKKε的去磷酸化；分析已知IKKb调控子在CUEDC2调控IKKb激酶活性中的作用模式。 5. 探讨DLC表达紊乱与肿瘤和自身免疫病发病机制的关系；探讨ORF60和UBA3对JNK途径发挥抑制作用的原理；探讨RGS1、SH2B3、PTPN2和PTPN22在I型糖尿病病人及动物模型的原代组织细胞中是否有结构突变。 1. 力争获得1个能够适合于X射线晶体衍射的晶体；获得2-3种蛋白的单抗或小分子靶点探针；明确NKG2D/NKG2A为核心的突触蛋白的成分及其分布； 2. 研究穿孔素对浆膜及对线粒体的损伤作用；确定TIGIT或HVEM信号与调节NK活化的关系；明确LSECtin影响T和NK细胞功能的分子机制。 3. 明确8-10中免疫分子的基本信号传导通路，初步确立6-8中免疫分子的相互作用分子； 4. 初步揭示CUEDC2调控IRF和NF-κB信号通路的机制。 5. 了解DLC表达紊乱与肿瘤和自身免疫病发病机制的关系；明确ORF60和UBA3对JNK途径发挥抑制作用的原理；明确RGS1、SH2B3、PTPN2和PTPN22在I型糖尿病状态中的结构突变。 6. 发表SCI论文4-8篇，申请专利1项。 第 四 年 1. 研究HMBOX1对NKG2D基因转录抑制效应及其调控机制。 2. 观察穿孔素或/和颗粒素作用下，颗粒酶进入靶细胞的部位；分析2CT细胞的增殖和细胞因子的产生；研究LSECtin在免疫性肝损伤中的功能，并利用LSECtin蛋白进行干预。 3. 建立相关重点关注基因的转基因小鼠模型，初步探讨所关注免疫分子在疾病模型中的作用以及其体内介导免疫识别、免疫调节、免疫耐受的作用，验证这些分子与相互作用分子的相互调节。 4. 检测CD40下游信号激活情况；研究CUEDC2对培养上清中病毒滴度变化的影响；分离原代巨噬细胞，检测CUEDC2对培养上清中IFN-β、rantes等分泌量的变化；分析CUEDC2对肿瘤坏死因子诱导肿瘤细胞凋亡的调控作用。 5. 探讨RGS1、SH2B3、PTPN2和PTPN22表达异常是否促进NF-kB途径和MAPKs途径的高水平活化。 1. 完成1个免疫受体蛋白的晶体结构测定，收集复合物晶体的衍射数据；初步明确HMBOX1对NKG2D基因调控机制；初步明确天然免疫识别相关蛋白在肿瘤免疫逃逸中作用； 2. 探明穿孔素如何介导颗粒酶进入肿瘤靶细胞；明确LSECtin在肝脏免疫损伤中的功能和对病程的影响。 3. 建立8-10转基因小鼠动物模型，了解4-5种免疫分子在动物模型和疾病模型中的作用；进一步确认免疫分子的相互作用蛋白质和作用的效应和机制。 4. 初步阐明新的CD复合体成分的功能及其调控机制；初步阐明CUEDC2调控IRF和NF-κB信号通路的生物学意义。 5. 了解ORF60和UBA3表达紊乱与肿瘤和自身免疫病发病机制的关系；明确RGS1、SH2B3、PTPN2和PTPN22表达异常与促进NF-kB途径和MAPKs途径高水平活化的关系。 6. 发表SCI论文5-10篇，申请专利2-3项 第 五 年 1. 多个免疫受体蛋白及其复合物的晶体生长及解析；利用单抗、小分子靶点探针等研究受体/配体的相互作用。 2. 研究NK细胞与LIGHT介导的肿瘤细胞排斥的关系；分析特定NK细胞对肿瘤的杀伤作用；验证细胞因子缺陷对肿瘤的排斥作用；研究LSECtin在肿瘤免疫和细菌感染免疫中的功能；验证LSECtin的配体分子并研究其功能。 3. 探讨CD40信号复合体成分功能和调控的生物学意义；分析CUEDC2在细胞抗病毒免疫中发挥的作用。 4. 验证重要结论，总结研究结果，形成文章和专利。 1. 完成1个免疫受体蛋白或1个复合物的结构解析研究；提出新的天然免疫识别机制；初步明确天然免疫识别相关蛋白在病毒免疫逃逸中作用。 2. 阐明NK细胞活化CTL的分子机制；明确LSECtin调控肝脏免疫的功能及其在细菌感染免疫中的影响；明确LSECtin在T和NK细胞上的配体蛋白。 3. 阐明新的信号复合体成分及其调控的生物学意义。 4. 明确RGS1、SH2B3、PTPN2和PTPN22结构突变是否促进NF-kB途径和MAPKs途径的高水平活化。 5. 发表SCI收录文章7-12篇，申请专利2-3项。