2007_面上_超高压牛奶乳清蛋白与甘薯淀粉混合凝胶形成机理及营养活性分析(2).doc

国家自然科学基金申请书 申请代码： C01050402 受理部门： 收件日期： 受理编号： 第 21 页 版本1.006.297 国家自然科学基金 申 请 书 您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:"中" 方法: Word菜单->工具->宏->安全性->安全级,设置为"中" (如果您是Word97用户，继续执行以下步骤) 2)关闭本文档，重新打开本文档 3)点击"启用宏"按钮，即可开始填写本文档或打印了 资助类别：面上项目 亚类说明：自由申请项目 附注说明： 项目名称：超高压牛奶乳清蛋白与甘薯淀粉混合凝胶形成机理及营养活性分析 申 请 者：孙艳丽 电话： 62815541 依托单位：中国农业科学院农产品加工研究所 通讯地址：北京市海淀区圆明园西路2号 邮政编码：100094 单位电话：62815952 电子邮件：sunyanli1969@ 申报日期： 2007年3月28日 国家自然科学基金委员会 基本信息yoKWT/OQ 申 请 者 信 息 姓名 性别 女 出生 年月 1969年12月 民族 汉族 学位 硕士 职称 副研究员 主要研究领域 食品化学与营养 电话 62815541 电子邮件 sunyanli1969@ 传真 个人网页 工作单位 中国农业科学院农产品加工研究所 在研项目批准号 依托单位信息 名称 代 码 90000197 联系人 董维 电子邮件 kjfood@ 电话 62815952 网站地址 合作单位信息 单 位 名 称 代 码 10005404 项 目 基 本 信 息 项目名称 资助类别 面上项目 亚类说明 自由申请项目 附注说明 申请代码 C01050402:生物分子的相互作用 C01040106:天然产物化学 基地类别 农业部农业核技术与农产品加工部门重点开放实验室\部门开放 预计研究年限 2008年1月 — 2010年12月 研究属性 应用基础研究 申请经费 27.8000万元 摘 要 (限400字)：超高压加工是一项崭新的食品加工技术，经高压处理后的食品与热处理的相比，不仅能保持天然的色泽、风味和口感，更能使食品的营养素如维生素不受破坏，并能产生与加热处理不同的新物性，易于被人体消化吸收。本项目将在热凝胶研究的基础上，开展高压加工技术形成乳清蛋白和甘薯淀粉混合凝胶技术的研究，通过分析pH、盐、糖、有机溶剂和脂肪等条件对混合凝胶形成的影响，以及SH基和S-S分子间内部交换反应对乳清蛋白和甘薯淀粉混合凝胶的流变学特性、微细构造、交联方式、S-S键聚聚合物形成的影响，探索乳清蛋白和甘薯蛋白混合凝胶的形成机理；同时以混合凝胶的消化率、促进钙吸收能力、微生物为主要指标，筛选乳清蛋白和甘薯淀粉混合凝胶的最佳形成条件，为拓展乳清蛋白和甘薯淀粉的使用价值，生产新型凝胶食品提供基础理论数据，最终运用食品化学、生物化学、分子生物学和统计学等相关学科知识初步建立乳清蛋白蛋白与甘薯淀粉凝胶形成的技术平台。 关 键 词(用分号分开，最多5个) 超高压；乳清蛋白；甘薯淀粉；凝胶；机理； 项目组主要成员（注: 项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。） 编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工 每年工作时间（月） 1 1964-3-30 男 研究员 博士 中国农业科学院农产品加工研究所 62815541 mutaihua@ 高压技术 5 2 1983-3-29 女 硕士生 学士 中国农业科学院农产品加工研究所 62815541 canlan6666@ 分子结构及其键合方式 10 3 1983-1-10 男 硕士生 学士 中国农业科学院农产品加工研究所 62815541 dengle2122@ 营养及钙吸收能力 10 4 1963-2-11 女 讲师 学士 首都医科大学 87131114 tangyuping@ 凝胶促钙吸收能力测定 8 5 1982-8-19 女 硕士生 学士 中国农业科学院农产品加工研究所 62815541 chengpeng0819@ 物化特性 10 6 7 8 9 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 6 2 1 3 说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。 经费申请表 （金额单位：万元） 科目 申请经费 备注（计算依据与说明） 一.研究经费 22.5000 1.科研业务费 11.5000 （1）测试/计算/分析费 7.0000 测试样品的设备使用费 （2）能源/动力费 1.0000 水、电、暖费用 （3）会议费/差旅费 2.0000 参加国内举办的学术会议 （4）出版物/文献/信息传播费 1.5000 查阅文献费用、资料复印费等 （5）其它 0.0 2.实验材料费 6.0000 （1）原材料/试剂/药品购置费 6.0000 购买乳清蛋白、淀粉等试验材料；购买化学试剂、药品等。 （2）其它 0 3.仪器设备费 2.0000 （1）购置 2.0000 购置磁力搅拌器、恒温器等小型设备。 （2）试制 4.实验室改装费 5.协作费 3.0000 分析凝胶的消化吸收率和促进钙吸收能力 二.国际合作与交流费 2.0000 1.项目组成员出国合作交流 2.0000 参加国际高压学术会议 2.境外专家来华合作交流 三.劳务费 2.0000 参加项目研究生的劳务费用 四.管理费 1.3000 合 计 27.8000 与本项目相关的 其他经费来源 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配） 其他经费来源合计 0.0000 报告正文 （一） 立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1、项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。）（基础研究需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；应用研究需结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。） （1）研究意义 在许多食品中，一些高聚物分子（蛋白质和多糖）通过氢键、疏水相互作用、范德华引力、离子桥联、缠结或共价键形成连接区，能够形成海绵状的三维网状凝胶结构，网孔中充满液相。很多食品的加工需要应用蛋白质的胶凝作用来完成，如蛋类加工中水煮蛋、咸蛋、皮蛋，乳制品中的干酪，豆类产品中的豆腐、豆皮等，水产品中的鱼丸、鱼糕等，肉类中的肉皮冻、水晶肉、芙蓉菜等等，也有以多糖为主的凝胶食品，如甜食凝胶、果冻、仿水果块等。这些产品大多是利用蛋白或淀粉各自的特性，近几年，研究人员也开始注重探索蛋白和淀粉的相互作用，以期利用蛋白与淀粉的相互作用改进凝胶形成方式，开发新型的凝胶食品。 乳清蛋白是当今最常见的蛋白质补充产品，它浓缩了牛奶中多数的营养成分，具有高吸收性、完整的氨基酸成分、低脂肪和低胆固醇特点，它不仅具有高营养性，而且还具有抗衰老、抗癌、提高免疫力、促进钙吸收、提高骨质和控制体重的功效。乳清蛋白的一个重要功能特性是可以形成热诱导凝胶和加压凝胶，稳定大量的水分和其它食品成分。在不同环境条件下，乳清蛋白可获得四种不同的凝胶结构：透明凝胶、富有弹性的透明凝胶、凝块和乳白色不透明凝胶。研究表明，在强的静电斥力时它形成富有弹性的透明凝胶，而在较弱的静电斥力下形成的凝胶较粗糙，因此利用乳清蛋白的这一特点可以利用不同的加工条件赋予食品多变的感官品质。 甘薯（Ipomoea batatas）是旋花科甘薯属植物，因其具有产量高、抗干旱、耐瘠薄、适应性广、操作简单等特点，极易在我国大面积、快速、示范推广。众所周知，中国是甘薯生产大国，也是淀粉加工大国，我国生产的甘薯近一半被用于生产甘薯淀粉，因此以甘薯淀粉为原料加工业的发展成为引导我国甘薯产业健康发展的关键因素，如何提高甘薯淀粉的应用价值也是甘薯研究人员亟待思考的问题。在食品方面，尽管利用甘薯为原料生产的粉丝、粉条、粉皮等产品已经收到广大消费者的欢迎，但对品种繁多的食品加工业来说，甘薯淀粉的应用价值还有很大的可开发空间。 食品高压加工技术是一项崭新的食品加工技术，与热处理的相比，不仅能产生与加热处理不同的新物性，而且还能在色泽上保持了食品的原色，更具有使食品的营养素如维生素不受破坏的特点，因而被誉为最具潜力和最有希望的食品加工技术。本项目针对乳清蛋白和甘薯淀粉的凝胶形成特点，在热加工研究的基础上，利用高压加工技术研究乳清蛋白和甘薯淀粉混合凝胶的形成特点，分析pH值、盐、糖、有机溶剂和脂肪等物质的变化对混合凝胶形成的影响，观察混合凝胶的流变学特性、微细构造、交联方式、S-S键聚合物形成方式以及物理化学特性的变化，探索乳清蛋白和甘薯淀粉混和凝胶形成的作用机理，最终以混合凝胶的营养价值、微生物为主要指标、促进钙吸收的能力，筛选乳清蛋白和甘薯淀粉混合凝胶的最佳形成条件，为拓展乳清蛋白和甘薯淀粉的使用价值，生产新型凝胶食品提供基础理论数据，同时也为进一步创立乳清蛋白与甘薯淀粉混合凝胶形成的技术平台打下基础。 （2）国内外研究现状及分析 食品高压加工技术是一项崭新的食品加工技术，被国际科技界列为二十一世纪的七大技术热点和十大尖端科技之一，并被誉为本世纪最具潜力和最有希望的食品加工技术。经高压处理后的食品与热处理的相比，不仅能保持天然的色泽和风味，表面光泽平滑，皱缩很少，质地较软，有较大的伸展性，更能使食品的营养素如维生素不受破坏，并产生与加热处理不同的新物性。此外，食品高压加工比热加工更能节省能源，这些优点使食品高压加工技术成为国际食品加工研究的新热点[1,2，3]。 乳清蛋白是牛乳中酪蛋白经凝乳酶和酸沉(pH=4.6)后得到的可溶性蛋白质 [4]，约占乳总蛋白质的18%-20%,它在很多方面与酪蛋白不同，它们是一些更小的、紧密的球状蛋白质，并且热稳定性不如酪蛋白。目前，乳清蛋白产品除有乳清浓缩蛋白和乳清分离蛋白外，还有一些具有功能特性的蛋白组分，如α-乳清蛋白（α-lactabuinin，α-La）、β-乳球蛋白 （β-lactoglobulin）、牛血清清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、免疫球蛋白 (Immunoglobulin，Ig) 和乳铁蛋白（lactoferritin,Lf）[5]。乳清蛋白有许多功能特性，被用于食品中以改善食品的质构、风味、颜色和营养价值，其中最重要的功能就是乳清蛋白的凝胶形成性。 国际上已有许多关于乳清蛋白热凝胶方面的研究报告[6]，而对于乳清蛋白加压凝胶的研究还不多。在高压条件下，蛋白质的非共价键如疏水键、离子键、氢键发生变化，从而导致蛋白质的机能和构造改变，导致凝胶的形成[7，8]。研究发现，加压能使低浓度乳清蛋白溶液生成多聚物[9,10]，而较高浓度的乳清蛋白溶液能形成多孔状凝胶[11]。通过对不同压力对不同浓度乳清蛋白溶液的影响，发现随着压力的增高，稀浓度的乳清蛋白溶液的粘度和浊度上升，加压凝胶的硬度变大，SH巯基与二硫键分子间内部交换反应对凝胶网状结构的生成起着非常重要的作用[12]。Fertsch以及Keim等人[13,14] 在最近发表的对乳清蛋白凝胶的研究报告中，也证实了二硫键的存在与数量的多寡直接影响了乳清蛋白加压凝胶的细微结构。 淀粉和蛋白都是生物高分子营养物质，都能形成不同的凝胶（比如复合凝胶、填充胶或者混合凝胶），涉及到内部作用力有共价键和非共价键，在一些食品体系中，蛋白和淀粉的相互作用成为影响产品质量的重要原因，近几年，越来越多的研究集中于探索蛋白和淀粉的相互作用导致食品的感官品质和营养价值的变化。1969年，Takeushi[15]报道，酸性马铃薯淀粉与α-酪蛋白之间存在静电相互作用，从而引起了研究人员对蛋白和淀粉的相互作用所产生的混合凝胶特性的重视。1995年，Tang[16]的研究发现，为很好地应用乳清蛋白，不仅要了解乳清蛋白的凝胶特性，还要掌握乳清蛋白与食品组分的相互作用。1998年Keogh K.M.[17]研究表明，在酸奶中添加瓜尔胶、果胶等水溶性胶体能够引起酸奶流变学特性的改变。2004年Williams[18]发现淀粉也能改变酸奶的流变学特性。2004年Decourcelle[19]等人证实，淀粉的螺旋结构能够结合酸奶中的风味物质,从而导致酸奶风味的变化。Shim等[20,21]的研究结果表明，玉米淀粉和分离乳清蛋白（WPI）的混合凝胶（玉米淀粉：WPI＝0.5：1）即有玉米淀粉凝胶的性质又有分离乳清蛋白的凝胶特性，乳清蛋白/木薯淀粉的混合凝胶（10%总固体，pH5.75）在淀粉部分占总固体的比例小于0.4时分别与纯分离乳清蛋白凝胶或者纯木薯（10%总固体，pH5.75）凝胶相比都显示出更高的机械特性。然而，Shim和Mulvaney发现在15%总固体和pH9.0条件下分离乳清蛋白/谷物淀粉混合凝胶的黏弹性表现出协作效应。Nunes[22-24]等人利用豌豆蛋白、玉米淀粉和k-卡拉胶生产一种风味独特的餐后甜点，主要是利用玉米淀粉具有能够增强豌豆蛋白和k-卡拉胶所形成的凝胶网状结构的特点。2004 Roesch[25]证实，加入淀粉后，淀粉颗粒的膨胀提高了k-卡拉较的浓度，从而引起凝胶流变学特性的变化，改变了混合凝胶的强度[26]，可见，蛋白与淀粉的协同作用对凝胶的质地产生了很大的影响。 最近，项目组成员[27]初步研究了不同浓度甘薯淀粉的添加对乳清蛋白加热凝胶硬度的影响，发现随着淀粉含量的增加，形成凝胶的硬度略微减少，而当淀粉含量达到10%时，混合凝胶硬度增加。纯WPI凝胶呈现有序的网络结构，而淀粉的添加则破坏了这一网络结构。随淀粉含量的增加凝胶保持较高的持水力。用Tris-glycine-Na2EDTA 缓冲溶液或含有0.5% SDS 和8 mol·L-1尿素的缓冲液溶解混合凝胶，发现凝胶中蛋白溶解度降低。而混合凝胶中巯基含量随淀粉含量的增加变化不大。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示，不存在2-巯基乙醇的条件下，除了单体以外，还检出二聚物、三聚物、四聚物以及高分子聚合体的染色带。纯WPI凝胶还检出了α-乳白蛋白的二聚体（28.4 kDa），而含淀粉的混合凝胶则未检出，而在2-巯基乙醇存在的条件下，只检出了单体和二聚体。 由此可见，凝胶中淀粉与蛋白的相互作用，不只是二者简单的混合，相互间还影响物理化学特性的变化，这种作用既受到反应条件的影响，还与蛋白种类和淀粉的种类有关。2003年Chen H.等人[28]研究表明，甘薯淀粉与马铃薯淀粉、绿豆淀粉在直链淀粉、直链淀粉比例、磷的含量以及淀粉颗粒大小、糊化特性方面均有较大的差别。中国是甘薯淀粉生产大国，对甘薯淀粉的研究是中国研究人员的特色，也是中国研究人员的责任，到目前为止，尽管乳清蛋白与玉米淀粉、木薯淀粉相互作用有相关的报导，但国内外还未发现有关于甘薯淀粉和乳清蛋白热诱导混合凝胶的研究，更没有加压凝胶二者相互作用的研究。因此，本项目将国际优质蛋白粉与具有中国特色的甘薯淀粉相结合，开展乳清蛋白与甘薯淀粉混合凝胶作用机理的研究，无论在填补凝胶形成的基础理论依据方面，还是在未来开拓蛋白和淀粉的应用价值方面均具有很好的现实意义。 主要参考文献 1、林 立丸.食品への高圧利用.さんえい出版.1989.1-25. 2、林 立丸.高圧科学と加圧食品.さんえい出版.1991.336-375. 3、江志炜，沈培英，潘秋琴. 蛋白质加工技术. 化学工业出版社. 2002. 132. 4、E.P. Schokker, H. Singh, D.N. Pinder, G.E. Norris, L.K. Creamer.Characterization of intermediates formed during heat-induced aggregation of β-lactoglobulin AB at neutral P. International Dairy Journal, 1999, 9 : 791-800. 5、燕红,张兰威,朱永军.牛乳清蛋白的性质及其在食品工业中的应用(上).中国食品报,2002 年/ 09 月/ 12 日/ 第A04 版/. 6、Kinsella,J.E., D.J.Rector, and L.G.Phillips. Physicochemical properties of proteins: Texurization via gelation,glass and film formation. In protein Structure-Function Relationships in Foods, Yada,R.Y, Jackman, R.L;Smith, J.L.,Eds;Blackie Academic&Professional: London, 1994, 1-21. 7、Hayashi,R. Utilization of pressure in addition to temperature in food science and technology, In High Pressure and Biotechnology; (Balny,C., Hayashi,R.,Heremans,K.,Masson,P.,Eds); John Libbery Eurotext Ltd: Montrouge. 1992, 185-192. 8、Cheftel,J.CE. ffect of high hydrostatic pressure on food constituents: an overview. In high pressure and biotechnologh; (Balny,C., Hayashi,R., Heremans,K.,Masson,P.,Eds); Colloques INSERM,John Libbery Eurotext Ltd: Montrouge, France. 1992, 224: 195-209. 9、Dumay,E., M.T.Kalichevsky, J. C. Cheftel. High-pressure unfolding and aggregation of β-lactoglobulin and the basoprotective effect of sucrose. J. Agric. Food Chem, 1994, 42: 1861-1868. 10、Funtenberger S., E. Dumay, J. C. Cheftel. Pressure-induced aggregation of β-lactoglobulin in pH7.0 buffers,Lebensm. Wiss.Technol., 1995, 28：410-418. 11、Cheftel,J.C., E.Dumay, S.Funtenberger, M.Kalichevsky, D.V.Zasypkin. 1995, Unfolding, aggregation and gelation of aβ-lactoglobulin isolate by high pressure processing, 2nd International Conference on High Pressure Bioscience and Biotechnology, Kyoto, November6-9,Abstract. 12、Choemon Kanno and Tai-Hau Mu, Gel formation from industrial milk whey proteins under hydrostatic pressure:Effect of hydrostatic pressure and protein concentration, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46, 417-424. 13、Fertsch.B,M.Muller, J.Hinrichs. Firmness of pressure-induced casein and whey protein gels modulated by holding time and rate of pressure release. Innovative Food Science&Emerging Technologies, 2003, 4(2):143-150. 14、Keim, S. J. Hinrichs. Influence of stabilizing bonds on the texture properties of high-pressure-induced whey protein gels. 15、Takeushi I. Interaction between protein and starch.. Cereal Chemistry, 1969, 46: 570. 16、Tang,Q., McCarthy, O. J, Munro, P. A. .Effects of pH on whey protein concentrate gel properties: Comparisons between small deformation(Dynamic) and large deformation(Failure) testing. Journal of Texture Studies, 1995, 26: 255-272. 17、Keogh K.M., O'Kennedy B.T. Rheology of stirred yoghurt as affected by added milk fat, protein and hydrocolloids . Journal of Food Science , 1998, 63: 108–112 . 18、Williams, R. P. W., Glagovakaia, O., Augustin, M. A. Properties of stirred yogurts with added starch: Effects of blends of skim milk powder and whey protein concentrate on yogurt texture. Australian Journal of Dairy Technology, 2004, 59: 214-220. 19、Decourcelle, N., Lubbers, S., Vallet, N., Rondeau, P., Guichard, E. Effect of thickeners and sweeteners on the release of blended aroma compounds in fat-free stirred yoghurt during shear condition. International Dairy Journal, 2004, 14: 783-789. 20、Shim, J., Mulvaney, S. J. Effect of heating temperature, pH, concentration and starch/whey protein ratio on the viscoelastic properties of corn starch/whey protein mixed gels. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001，81：706–717. 21、P. Ravindra, D.B. Genovese, E.A. Foegeding, M.A. Rao. Rheology of heated mixed whey protein isolate/cross-linked waxy maize starch dispersions. Food Hydrocolloids, 2004，18：775–781 . 22、Nunes, M. C., Batista, P., Raymundo, A., Alves, M. M., & Sousa, I. Vegetable proteins and milk puddings. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2003, 31: 21–29. 23、Nunes, M. C., Raymundo, A., & Sousa, I. Effect of thermal treatment and composition on the mechanical properties of pea/kappacarrageenan/starch desserts. In P. A. Williams, & Glyn O. Phillips, Gums and stabilisers for the food industry. UK:Royal Society of Chemistry, 2004a, 54–64. 24、Nunes M.C., Raymundo A., Sousa I.. Effect of composition on the rheological behaviour and microstructure of pea/kappa-carrageenan/ starch gels. Book of proceedings of the IBEREO-04: Iberian Rheology Meeting , 2004b, 31–36. 25、Roesch, R., Cox, S., Compton, S., Happek, U., & Corredig, M. k-Carrageenan and b-lactoglobulin interactions visualized by atomic force microscopy. Food Hydrocolloids, 2004, 18: 429–439. 26、Verbeken, D., Olivier, T., & Dewettinck, K. Textural properties of gelled dairy desserts containing k-carrageenan and starch. Food Hydrocolloids, 2004, 18: 817–823. 27 、程鹏，木泰华,王娟，孙艳丽.牛奶乳清蛋白与甘薯淀粉加热混合凝胶物化特性及微观结构的研究. 食品工业科技.（已录用） 28、Chen H. A. Schols. A. G. J. Voragen. Physicochemical properties of starches obtained from three varieties of Chinese sweet potatoes. Food Chemistry and Technology, 2003, 68(2):431-437. 2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。（此部分为重点阐述内容） （1）研究内容： 本项目主要有两个部分的研究内容，具体如下： A、超高压乳清蛋白与甘薯淀粉混合凝胶形成机理 通过试验，分析乳清蛋白和甘薯淀粉的浓度、加热温度、pH值、离子强度、压力、SH基化合物和SH基团阻碍剂对乳清蛋白和甘薯淀粉混合凝胶微观结构、光学性质（透明度）、硬度、流变学特性、溶解性、持水性、淀粉颗粒的影响，研究乳清蛋白和甘薯淀粉交联方式、凝胶形成过程中分子结构的变化，分析乳清蛋白和淀粉的相互作用在凝胶形成过程中发挥的作用，探索混合凝胶的形成机理。 B、乳清蛋白与甘薯淀粉加压混合凝胶营养价值（消化吸收率）及促进钙吸收能力评价 通过分析混合凝胶的营养价值、微生物、、促进钙吸收的能力，筛选乳清蛋白和甘薯淀粉混合凝胶的最佳形成条件。 （2）研究目标： A、明确凝胶的形成机理。 B、获得牛奶乳清蛋白与甘薯淀粉即食性、高营养混合凝胶食品的生成方法。 c、创立乳清蛋白与甘薯淀粉凝胶形成的技术平台。 （3）拟解决的关键问题： A、混和凝胶中蛋白质和淀粉的交联方式； B、混和凝胶中蛋白质和淀粉分子结构的变化； C、蛋白与淀粉的结合以及结构变化对其消化吸收率和乳清蛋白活性的影响。 3、拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明） （1）研究方法： 本项目将以乳清蛋白和甘薯淀粉为实验材料，分析不同外部因素变化的条件下所生成甘薯淀粉和乳清蛋白混合凝胶的粘度、浊度、溶解性、电泳特性，以及凝胶的硬度、破断应力、持水性、溶解性、电泳特性及显微结构，揭示加压乳清蛋白凝胶形成的机理；研究混合凝胶的营养价值和促进钙吸收的能力，具体实验方法如下： ① 凝胶的微观结构 将混合凝胶样品切成2×2×1 mm 的小片，用4%戊二醛固定，再以1%锇酸（OsO4）固定后分别用30、50、70、80、90、95、100%的酒精溶液依次脱水，然后浸泡在乙酸异戊酯溶液中，进行临界点干燥，最后进行离子溅射镀金处理。在加速电压为15 kV 的条件下，用扫描电子显微镜（S-570）观察混和凝胶的三维网状结构。 ② 化学交联方式分析 参照闵思佳（2005年）实验方法，将真空干燥凝胶样品在红外光谱仪上测定红外光谱(KBr 压片)，分析甘薯淀粉凝胶、乳清蛋白凝胶和混合凝胶特征吸峰的差别，推断甘薯淀粉和乳清蛋白的化学交联方式。将真空干燥凝胶样品于HCl溶液中水解, 用氨基酸自动分析仪进行氨基酸分析，分析混合凝胶中氨基酸的变化，推断交联的方式。 在核磁共振波谱仪上观察碳发生化学位移的情况, 以证实氨基酸残基与淀粉发生的化学交联情况。用圆二色谱仪分析凝胶形成后蛋白二级结构的变化情况。 ③ 凝胶的光学性质（透明度）：用透明度测定仪分析。 ④ 混合凝胶的硬度 用质构仪分析，在TA-XT2质构仪上采用凝胶强度国际标准测试系统反映凝胶机械性能的变化，采用P/0.5R探头，测定速度为0.5mm/s，测前速度为0.5mm/s，返回速率为0.5mm/s，前进距离8mm，凝胶强度为第一次挤压变形时，物体所产生应力的最大值，分析不同条件下形成的凝胶硬度变化趋势。 ⑤ 流变学特性 用动态流变仪(AR1000 Rheometer TA Instrument)分析不同条件所形成凝胶储存模数Ｇ＇、损失模数Ｇ＂和损失正切值的变化，分析原材料的浓度、加热温度、pH值、离子强度、压力、SH基化合物和SH基团阻碍剂等条件对凝胶流变学特性的影响。 ⑥ 蛋白分子结构的变化 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）观察乳清蛋白的聚合、降解情况。SDS－PAGE是依照Laemmli方法。使用日本ATTO AE-6450电泳系统分析。蛋白样品分别溶解于添加和不添加5% 2-巯基乙醇含有10 m mol/L Tris–HCl,、3 m mol/L EDTA、 1% SDS 和 0.01%溴酚蓝溶解液中。低分子标样购于sigma公司。分子量分别为：66,000，45,000，36,000，29,000，24,000，20,100，14,200。考马斯亮兰R-250对蛋白质染色，用凝胶成像仪分析乳清蛋白组分的变化情况。 ⑦ 持水性测定方法 将5g混合凝胶放入离心管中进行离心，每个样品取3个平行样。离心条件为10000 r/min,60 min。持水力用离心前后凝胶的重量比来表示，每一样品平行测定三次,取其平均值。 ⑧ 溶解度的测定方法 将制备好的混合热诱导凝胶分别放入pH8.0含有8 mol·L-1 尿素和0.5%SDS的Tris-glycine -Na2EDTA缓冲溶液中，然后使用均质机（轴直径12 mm、19 000 r/min）均质2 min、混匀并在10000g条件下离心30 min 后，取上清用于蛋白质溶解度的测定及其SDS-PAGE的电泳试验。依照Peterson及Markwell等的方法测定蛋白质含量，每一样品平行测定三次,取其平均值。 ⑨ 巯基测定 根据Ellman（1959）的方法，将混合凝胶分别溶于添加了尿素和SDS变性剂的Tris-glycine-Na2EDTA标准缓冲溶液中，均质、混匀、离心。离心完成后，取3 ml上清液向其中加入0.03 ml的Ellman试剂，并迅速混合，在室温下放置90分钟左右后用分光光度计测其吸光度值，调节分光光度计的吸收波长为412 nm，并且用标准缓冲溶液做为空白试剂来校正结果。每一个样品平行测定三次，取其平均值。 ⑩ 营养价值分析 通过体外消化试验比较加热凝胶、混合凝胶、加压凝胶的消化率、吸收率。 ⑪ 能量分析：用离子体质量和能量分析仪测定凝胶形成后的能量变化。 ⑫ 微生物分析 参照国标GB 4789.2-94、GB 4789.3-94分析加热凝胶、加压凝胶微生物的菌落总数、大肠杆菌菌群。 ⑬ 促进钙吸收能力测定 利用动物试验，将大鼠粪便、饲料进行灰化处理，用原子吸收分光光度计分析灰分中钙的含量，计算钙的吸收率；通过静脉取血，用原子吸收分光光度计分析血液中钙的含量，计算钙的吸收率。比较混合凝胶、乳清蛋白凝胶与非凝胶乳清蛋白产品对促进钙吸收能力的差别，以及加压凝胶与加热凝胶产品对促进钙吸收能力的差别。 （2）技术路线 调节pH值或添加盐、糖、脂肪、有机溶剂、SH基化合物和SH基团阻碍剂等 加压、加热处理 溶胶或凝胶 物化、微观结构、交联方式、分子结构变化等 营养价值及促钙吸收能力等分析 确定凝胶形成机理 筛选加工工艺 乳清蛋白 甘薯淀粉 凝胶形成技术平台的构建 （3）可行性分析 本项目技术路线思路清晰、设计合理、可操作性强，项目中通过查找大量的资料，充分考虑影响凝胶形成的各种因素，从检测混合凝胶的微观