973 2012 基于核酸的重大疾病诊断策略和新技术 (2).doc

项目名称： 基于核酸的重大疾病诊断新策略和新技术研究 首席科学家： 周翔 武汉大学 起止年限： 2012.1-2016.8 依托部门： 教育部 一、关键科学问题及研究内容 1. 拟解决的关键科学问题 本项目拟解决以下三个科学问题： (1) 研究癌基因、DNA甲基化基因和突变基因的结构和生物学规律，比较它们在疾病和正常细胞中的差异。 (2) 解决核酸探针在疾病诊断中的特异性问题，设计、合成和筛选能特异性识别疾病基因靶点和多位点突变基因的探针分子。 (3) 核酸适配子的高选择性灵敏诊断问题。通过化学方法修饰核苷序列或碱基而形成的结构多样性核酸适配子对肿瘤标志物和CTC特异性的识别可以大大提高，从而提高肿瘤疾病检测的灵敏度。 2．主要研究内容： 围绕上述三个科学问题，我们将开展如下几个方面的研究： 2.1 致病基因结构与生物学功能研究 核酸分子的生物学功能由其性质、结构和它们与其它生物大分子的相互作用所决定。以富G核酸的特殊性质为基础，建立模拟基因组DNA复杂结构下G-四链体结构和构象的解析、示踪和干预的新技术，筛选和鉴定与富G核酸、G-四链体相互作用的小分子。发展上述过程的干预手段，为重要疾病提供诊断和治疗的理论基础。 (1) 研究生理条件下富G核酸和G-四链体等高级结构的形成条件，以及表现出与疾病相关的性质。 (2) 发展解析生理条件下富G核酸和G-四链体等高级结构构象的技术，为研究小分子探针与富G核酸和G-四链体的相互作用提供技术支撑。 (3) 筛选、鉴定与富G核酸和G-四链体相互作用的化学小分子，研究小分子在生理条件下与富G核酸和G-四链体的相互作用、选择性识别及其生物学功能，为疾病诊断和治疗提供理论基础。 (4) 富G核酸结构损伤检测与损伤识别修复机制，认识致病核酸的结构，寻找与疾病相关的核酸序列。 2.2 针对致病基因的高灵敏、特异性小分子的设计与合成 针对癌基因、甲基化DNA、不规则核酸序列等致病基因的一级、二级和三级结构的特点，研究化学小分子与它们之间的相互作用，筛选出结合能力强、选择性高的化学小分子： (1) 以富含G 核酸序列为靶点（例如，VEGF、BCL-2、Ki-ras 癌基因启动子区和端粒DNA 富G 序列），设计合成和筛选具有识别功能的新型识别分子, 如： 氧氮杂环类大环和新型环状寡聚酰胺。在分子、细胞和动物水平上研究识别分子对上述癌基因启动子区G-四链体识别的特性和功能。 (2) 针对DNA 甲基化的基因靶点，主要是寻找能直接与甲基发生化学反应的小分子，可以达到识别DNA 甲基化的基因序列的目的。 2.3 分子探针对癌基因、甲基化DNA 和致病基因的识别与调控 (1) 以癌基因、突变基因和不规则核酸结构为靶点，基于化合物的特征性结构， 研究小分子配体与特殊核酸结构的亲和作用，设计筛选出对致病基因序列具有特异的高亲和性化合物，进行光、电、色等功能化基团修饰制备分子探针；在分子水平上理解其作用机制，揭示小分子-核酸间的结构功能关系，在分子水平上理解其相互作用的特异性。结合细胞生物学，研究病变细胞和正常细胞修饰电极对特定探针的响应及响应的异同点。 (2) 在得到设计合成的探针后，针对DNA 甲基化的基因靶点，利用现有小分子的光或电或色响应等性质，直接与相关的DNA 甲基化序列作用，通过相关的响应来检测DNA 甲基化序列. 在细胞水平上， 我们可以通过利用DNA 微阵列技术和PCR 技术分析合成的探针分子处理细胞前后基因表达的差异变化，从而发现探针的作用靶基因。利用甲基化PCR 以及bisulfite sequencing 分析这些基因启动子区域甲基化水平的变化，研究探针分子对DNA 甲基化基因的影响。 2.4 对乳腺癌、肝癌识别的核酸适配子的设计与筛选 (1) 利用SELEX 技术自主筛选到的、能特异性结合乳腺癌、肝癌标志物或CTC 的小分子核酸适配子，将核酸适配子与具有光、电、色特征的小分子通过化学方法连接，建立乳腺癌、肝癌分子诊断新技术。 本研究将采用的CS-SELEX（Cell surface-SELEX）技术是将肿瘤细胞作为筛选介质的一种新型SELEX筛选方法，例如我们将表达多天线的复杂型N-糖苷的肿瘤特异性抗原靶分子的乳腺癌细胞并作为阳性正筛细胞获得靶分子，没有表达靶分子的同系细胞作为阴性反筛细胞消除非靶分子，获得特异性针对乳腺癌肿瘤细胞特异性抗原靶分子的适配子。通过化学计算、分子模拟和分子设计，进行适配子与靶分子对接分析与自适应识别研究，建立相关理论模型，并利用这些模型和机制评估、设计新的核酸适配子分子探针。 (2) 为了解决目前核酸适配子（DNA和RNA）的结构稳定性和特异性，我们将对筛选到的寡核苷酸结构进行化学修饰，主要在下面几个方面开展相关工作： 针对RNA目前面临的主要问题开展RNA或DNA化学修饰、体内输送系统研究以及RNA文库设计和靶标筛选研究。 1) 化学合成带有氨基及其它修饰的异核苷并用于掺入短链RNA或DNA适配子上，希望提高它们的稳定性，提高其在血液中的保留时间；设计合成肽类、脂类等人类天然存在的化学成分缀合的RNA适配子，研究解决RNA适配子细胞膜通透性和RNA适配子靶向组织细胞的问题。 2) 构建另一种形式的RNA和DNA库，筛选能对人类肿瘤标志物能特异结合的RNA和DNA混合文库。 3) 对筛选的理想核酸适配子进行化学修饰，构建电、光、色等功能化核酸适配子探针，建立基于这些分子探针的单个癌细胞的检测方法和对肿瘤细胞组织的高灵敏成像方法。 2.5. 基于核酸探针的肿瘤重大疾病的特异、灵敏诊断研究 主要研究的内容包括：设计并合成能对肿瘤等重大疾病突变核酸特异性识别的小分子，实现对肿瘤相关基因的诊断： (1) 设计并合成能对肿瘤中的致病核酸进行诊断的探针。针对肿瘤(相关)基因序列、DNA甲基化序列以及一些常见的突变位点，设计相应的不对称拆分-组装DNA过氧化物酶探针，通过DNA过氧化物酶催化的显色反应实现对靶核酸及耐药突变的均相检测，另外还将设计能够信号级联放大的DNA过氧化物酶检测体系，实现无需PCR扩增直接检测DNA序列。进一步将设计的DNA探针与微流控芯片技术相结合实现将血液样品直接加入芯片实验室的进样口，即可进行癌症的快速核酸诊断。对我们课题一、课题二所发现和筛选的能对不同疾病能特异识别的生物探针进行光或电或色响应修饰，实现通过光或电或色响应来检测相关致病基因片段，达到检测的目的。 (2) 肿瘤性疾病的无创性诊断。最初在血浆中检测到的肿瘤基因突变有在胰腺癌和大肠癌中出现的K-ras基因的突变，它们是随着肿瘤细胞的坏死释放到血浆中去的。血浆DNA的p53基因的突变可以用于肿瘤的复发和转移的早期标志物，加强血浆DNA的富集技术，检测出肿瘤的变异基因，有很好的无创性诊断的价值。 (3) 目前基于CTC的肿瘤检测靶标（EpCAM）属广谱肿瘤检测靶标，且部分肿瘤不表达该靶标。我们拟采用利用SELEX技术，根据不同肿瘤选择相应CTC特异性的核酸适配体，作为该特定肿瘤（主要针对乳腺癌和肝癌）的CTC靶标，获得的核酸适配体序列可在合成过程中进行各种修饰如氨基修饰作为芯片探针，荧光素或量子点修饰作为荧光探针。为了解决CTC单细胞后期分析方法受限于模板量微少，无法进行的技术难题，尝试扩增CTC基因组，实现微量模板扩增，(本课题组已有单细胞全基因组直接扩增技术)，便于后期分子生物检测的进行。 本项目将样本处理、反应部分集中于微小基片上，外部只保留通用结果检测设备，能最大限度减小体积，实现便携，同时可将多个反应室和多个样本处理室结合于单一微小基片上，实现同一样本高通量检测多个项目，以及多个样本高通量检测，有很好的临床应用前景。 2.6. 对肝癌、乳腺癌的预后判断和指导个体化治疗 尝试从三个不同的层次和水平进行肝癌、乳腺癌的早期预警和辅助个体化治疗 1) 采用已经确认的靶标：如：肝癌个体化治疗相关的CDA、BRAF的基因突变； 乳腺癌的高表达基因Bcl2是否上调。采用小分子探针检测这些基因是否存在突变进行识别和检测。 2） 检测DNA甲基化表达量，在患者外周血浆中，筛查肝癌、乳腺癌组织特征性的甲基化DNA分子。 3） 采用外周循环肿瘤细胞检测技术，检测外周血循环肿瘤细胞数量，评估患者的预后和指导个体化治疗。 二、预期目标 (一) 总体目标： 通过本项目的研究，建立起基于核酸的重大疾病特异、灵敏诊断的创新性关键科学技术，发现若干针对肿瘤重大疾病的特异性、专一性、高灵敏度核酸探针，为进一步解决对这些疾病特异、高灵敏检测所面临的瓶颈性问题提供理论依据和技术。本项目的完成将为与核酸相关的众多重大疾病的早期预警和诊断，并进一步为肿瘤的预后判断和指导个体化治疗的提供理论基础与技术保障，为我国具有自主知识产权的疾病诊断研究和开发提供理论依据和新技术，为提高人类健康水平和促进我国医疗产业的国际竞争力作出贡献。本项目将始终面向医学基础和重大疾病诊断，以创新为基础，以国民健康为己任，培养一支在化学、生物学和医学广泛交叉的核酸领域研究人才队伍，为我国疾病诊断的创制水平、应对重大疾病能力、维持医疗体系稳定和促进国民经济可持续发展打下坚实的学科、理论和人才基础。 (二) 五年预期目标 1．面对传统重大疾病诊断存在的根本性缺陷问题，建立以核酸为靶目标的用于生命科学、临床医学中肝癌、乳腺癌等检验、快速诊断新策略和技术。 2．对不同类型核酸靶点的生物和医学问题研究，发现不同结构核酸在疾病的发生和发展中所起的重要作用；筛选能对致病核酸序列（富G序列的癌基因、DNA甲基化基因和突变基因）高选择性识别的小分子，研究它们与不同结构核酸的相互作用和结合能力，通过修饰得到生物分子探针和微型化芯片实验室，筛查重大疾病的易感基因，并进一步研究和开发其在肿瘤疾病的灵敏诊断技术，并为肿瘤预后判断和指导个体化治疗的提供理论基础与技术。 3．设计并合成能针对肿瘤细胞中标志物或CTC进行特异识别和结合的核酸适配子分子，通过化学修饰后使其具有光、电、色等特性，用于肿瘤疾病的高灵敏诊断。 4. 设计、合成和发现化学衍生试剂，衍生化癌变过程生物标志物，提高检测灵敏度，建立质谱法高灵敏度检测人类癌变过程生物标志物的新方法。 5. 肿瘤疾病的致病基因结构的灵敏和特异检测，为进一步开展肿瘤预后判断和个体化治疗提供理论和技术支持。 (三) 量化考核指标 1．研究化学小分子与富G核酸、G-四链体DNA的相互作用，筛选和发现5~8个对富G核酸具有特异性识别功能的化学小分子探针。 2．获得一些新型的多功能纳米标记材料和纳米生物探针，研究得到对特殊核酸结构及序列高度选择性高结合能力的配体, 在分子水平上认识了解小分子-核酸配合物的高分辨结构信息。 3．合成并筛选能对肿瘤的VEGF、BCL-2、Ki-ras癌基因特异性识别的探针分子，发展一些高通量、低成本、简便快捷的核酸检测的技术，达到对重大疾病高效、早期诊断提供理论依据的目的。 4．通过使用色谱和质谱技术以及相关的生物技术手段，分析细胞在探针分子处理DNA甲基化基因或癌细胞之后，基因组或全基因组范围胞嘧啶的甲基化变化，特定基因启动子区域甲基化水平的变化，DNA甲基化转移酶以及组蛋白的修饰，从表观遗传学上阐明探针分子的识别机制。 5．针对乳腺癌、肝癌的标志物或CTC，通过SELEX技术筛选能特异识别的核酸适配子小分子，通过化学修饰，结合上具有光、电、色的化学物质，能对乳腺癌、肝癌细胞进行甄别和检测。 6．合成结构修饰DNA或RNA，但保持其作为核酸适配子的特异性和高结合能力，并在体内更稳定且能穿透细胞膜；研究一类能准确地输送DNA 或RNA到靶部位的输送体系; 使结构修饰的DNA或RNA选择性地作用于靶目标；构筑一个通用的DNA和RNA文库并用于寻找药物靶标、功能基因及背后隐藏的生理或病理过程的研究。 7. 设计、合成和筛选1-3个化学衍生化试剂，对癌变过程的生物标志物进行衍生化，提高检测的灵敏度， 建立HPLC-ESI-MS法高灵敏度检测人类癌变过程生物标志物的新方法。 8．在国际著名期刊上发表有较大影响的学术论文，并申请相应的知识产权，发表高水平SCI论文60篇以上，申请专利10项。 9．培养本领域的学术带头人6人以上，培养博士生60人，博士后10人。 三、研究方案 （一）学术思想及技术路线 本项目根据恶性肿瘤重大疾病的发病机制，针对正常细胞在病变过程中首先正常的核酸将受到入侵或受其它物理、生物、化学方面的影响而发生异常，导致机体受感染或发生遗传方面的错误表达，最后发生病变这一长期处于潜伏状态的过程，设臵相关课题和研究内容，以核酸发生异常为主要目标进行疾病诊断的研究。核酸在发生异常后，会导致核酸结构发生多样化，因此设计合成相应的小分子探针对特殊核酸结构进行特异性的识别和调控，在分子水平上理解其作用机制，揭示小分子-核酸间的结构功能关系；此外，富G核酸的癌基因的生物学功能及其性质、结构被认为是目前肿瘤等重大疾病诊疗中可能取得突破性进展的热点，人们已发现能够形成G-四链体的富含G核酸序列在人和其它物种的基因组中有几十万之多，它们与癌症等许多重要的疾病有重要关系；DNA甲基化序列也是导致肿瘤发生的重要原因，对DNA甲基化序列的特异性识别，可以提高我 们对肿瘤疾病的高灵敏、特异诊断。因此，筛选和鉴定富G 核酸和DNA 甲基化序列相互作用的小分子，研究它们与致病核酸的相互作用规律，经过对特异性结合的小分子进行修饰得到探针分子，可作为诊断的工具对疾病进行灵敏诊断。与此同时，为了提高对肿瘤标志物的检测灵敏度，我们还将通过SELEX 技术筛选的核酸适配子和结构化学修饰的核酸适配子，经过对它们化学结合具有光、电、色等性质的小分子，可以对肿瘤疾病进行诊断和预警，为进一步在临床上进行疾病检测打下理论基础和提供相关的技术支撑。 在技术路线上，本项目将从变异性核酸的结构入手，通过化学的理论和方法设计并合成对目标核酸具有特异性识别和结合的化学小分子探针；同时利用SELEX 技术筛选能对肿瘤标志物或CTC 有特异识别的核酸适配子分子，为了保证它们在体内的稳定性，对它们的结构进一步修饰，再结合上具有光、电、色的化学小分子。通过分子生物学、细胞生物学和医学等理论和实验技术，研究它们对不同结构核酸的相互识别作用、疾病灵敏诊断的特异性，研究它们对致病基因特异性识别的能力，进一步研究疾病早期预警和高灵敏诊断。课题一、二是针对不同结构的致病基因所设计的探针分子，课题三则是对课题一、二中筛选的特异识别的小分子进行光、电和色响应基团的修饰，得到可以对疾病检测的探针分子，课题四是针对肿瘤标志物及CTC设计合成的核酸适配子，并同样进行光、电和色响应修饰。在课题一、二、三、四的基础之上，本项目将进一步发挥核酸分子探针的作用，面向医学基础和重大疾病，基于核酸探针进行重大疾病快速、专一、高灵敏的诊断技术研究（课题五）。本项目的研究成果将对恶性肿瘤重大疾病目前快速、高灵敏诊断中面临的种种瓶颈性难题找到更优化的解决方法和关键技术。 （二）本研究项目实现预期目标的可行性 1．理论依据可靠：核酸的重要性在现代生物学研究中已经得到证实，核酸的损伤与传染性疾病、肿瘤的发生也已经被深入理解，后基因时代的研究发现核酸的结构和生物学功能的研究对生命科学、医学和药物研发领域的发展有很强的推动作用，近些年来诺贝尔奖在核酸领域的倾向性也让核酸的研究越来越受到人们的关注。种种研究成果表明，核酸靶点的相关研究、基于核酸探针的分子设计将对肿瘤等重大疾病的诊断有着积极的推动作用，并有取得重大突破的可能。 2．技术路线可行：本项目通过化学、生物学、医学学科深入交叉，结合化学、分子生物学、结构生物学、光谱学、质谱学等技术手段，以核酸发生异常为主要目标进行疾病诊断的研究， 筛选对核酸靶标具有特异性识别功能的化学小分子作为探针用于疾病的诊断，技术路线合理可行。 3．工作基础扎实：研究团队成员多年来从事核酸领域的研究工作，积累了大量的研究工作基础和丰富的工作经验，在国际上有影响的PNAS, JACS, Angew. Chem. Int. Ed.等重要期刊上发表了200多篇高水平的学术论文，多次被专栏、期刊作正面的评价和推荐，工作基础扎实。本研究团队在小分子与生物活性大分子相互作用、端粒结构、核酸探针、基因载体等方面有很好的研究基础，在核酸构象、结构动力学、药物筛选体系、靶目标检测和与小分子作用上获得了重要研究结果。在模拟细胞内环境、模拟多种结构共存的条件下的研究积累了很好的经验和多学科交叉的研究技术基础，出色地承担了包括国家自然科学基金重点项目、国家杰出青年基金等多项核酸领域相关的重大项目。 4．技术支撑完善：参加本项目研究的各个课题组依附所在的国家重点实验室和国家实验室，有着从事化学、生物学和医学交叉的研究所有条件；而且长期在核酸化学、核酸生物学和医学方面进行研究，积累了丰富的经验和基础，目前已取得的成果证明我们在该领域具有较强的国际竞争力；特别是各个课题组之间平时就有合作，共同申请课题和共同探讨核酸的相关问题。研究团队成员已经熟练掌握了有关化学、医学、分子生物学、分子病毒学、细胞生物学等领域的技术和方法，完全具备研究方案中所涉及到的所有实验技术。关键技术如药物筛选技术、核酸结构检测、核酸与小分子相互作用及功能等研究技术都是国际上采取的成熟且先进的技术手段。研究团队骨干成员均具有留学背景，前期工作也处于国际领先水平，实验室硬件、软件建设的高标准化也为项目的完成提供了完善的技术支撑条件。 5．研究队伍合理：本项目参加者包括5位“国家杰出青年基金获得者”，其中2位“教育部长江学者特聘教授”， 1位国家级“新世纪百千万人才工程人选”者，1位“中科院百人计划”入选者。教授（研究员）14人，副教授（副研究员）8人，高级工程师（高级实验师）3人，讲师和助理研究员5人，研究团队成员年龄结构和知识结构合理。集中了一批多年从事核酸化学、核酸生物学和医学的优秀科学工作者，在PNAS, Nat. Struct. Biol., J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Adv. Materials, Nucleic Acids Res.等杂志论文200多篇与核酸相关的论文，论文多次被专栏、期刊作正面的评价和推荐。此外，主要成员均在国际著名的核酸研究实验室工作多年，已经融入到国际相关学术体系，非常清楚本领域国际前沿动态。国际间信息和物质的交流必将大大促进工作的效率，对本项目的开展是一个有力的支持。 6．科研条件优越: 本课题依托于5所高等院校和2所科研院所，其中有4个国家重点实验室，1个集医疗、科研和教学为一体的综合性三级甲等医院。牵头单位武汉大学还具有三级生物安全动物实验室、SPF级实验动物中心、中国典型培养物保藏中心等科研技术平台，科研条件优越。 综上所述，目前本研究团队具有很强的化学、医学和生物学交叉的条件和基础，已经具备了开展基于核酸的重大疾病诊断新策略和新技术研究的资源、科研条件及工作基础。在国家支持下，有效地组织国内的科研队伍，充分利用国内外科研资源及国内的科研基础和条件，短期内，有望在重大疾病诊疗的新方法、新技术领域取得重大突破。 （三）与国内外同类研究相比的创新性和特色： 1. 我们研究的对象是核酸，它本身既是肿瘤发病的源头，同时也可以作为肿瘤疾病标志物识别的重要物质。核酸本身研究涉及到化学、生物学和医学的交叉和融合，我们团队具有很好的化学、生物和医学交叉的优势，各课题负责人和主要学术骨干在过去的几年间已经围绕核酸的化学、生物学和医学性质以及生物探针与核酸之间的相互作用开展深入交叉研究，这些前期工作为我们进一步深入系统地探讨核酸作为重大疾病的重要靶点的疾病诊断奠定了良好的基础，有望在未来3-5年间取得较重要的研究成果。 2．本项目的研究方案和团队组建体现了当代科学技术发展的特征，融合化学、医学、生物学学科交叉，运用分子生物学、结构生物学、临床医学、化学合成技术与理论、化学生物学、影像学、生物质谱学、色谱分离分析等技术和方法来解决目前重大疾病诊断所面临的科学问题，在取得更多创新性科研成果的同时，培养具有创新能力、具备综合交叉意识的研究团队和人才。 3．我们的策略和方法是直接针对致病核酸（突变基因、甲基化核酸和富含G链核酸）的结构设计并合成能对它们特异性识别的新型探针分子，经过化学修饰，使其具有光、电、色的性质，这些高选择性新型分子探针可以进行疾病基因诊断。 4．我们筛选能对乳腺癌、肝癌的标志物特异性识别的核酸适配子，通过化学修饰的方法，使筛选到的核酸适配子具有更好的稳定性和特异性，进一步化学修饰上具有光、电、色等基团和分子，使其具有特异性识别并有不同响应的性质，达到对乳腺癌、肝癌灵敏诊断的目的。 5．基于核酸的重大疾病诊断新策略和新技术研究，目前国际上的著名大学、研究所和药物公司正在积极开展该方面的工作，国内医院许多相关基因诊断试剂和技术大部分来自国外，具有自主知识产权的产品很少或不成熟。本项目的研究都是在我们各个课题组研究基础上发展的，是具有自主知识产权的原创性工作；我们的研究成功将会给我国具有自主知识产权的重大疾病早期预警和诊断方法的开发提供重要的理论依据和技术。 （四）课题设置： 课题间关系 围绕“基于核酸的重大疾病诊断新策略和新技术研究”这一主题，本项目设臵5个子课题。课题一、课题二将从变异性核酸入手，通过化学的理论和方法设计并合成对目标核酸具有特异性识别和结合的化学小分子。并通过分子生物学、细胞生物学和医学等理论和实验技术，在课题三中研究它们对不同结构核酸的相互识别作用、疾病灵敏诊断的特异性，研究它们对致病基因特异性识别的能力，进一步修饰成为疾病早期预警和高灵敏诊断的生物分子探针。同时课题四利用SELEX技术筛选能对肿瘤标志物或CTC有特异识别的核酸适配子分子，为了保证它们在体内的稳定性，对它们的结构进一步修饰，再结合上具有光、电、色的化学小分子，可以对肿瘤疾病进行诊断和预警，为进一步在临床上进行疾病检测打下理论基础和提供相关的技术支撑。在课题一、二、三、四的基础上，本项目将进一步发挥核酸分子探针的作用，面向医学基础和重大疾病，基于核酸探针进行重大疾病快速、专一、高灵敏的诊断技术研究（课题五）。本项目的研究成果将对恶性肿瘤重大疾病目前特异、高灵敏诊断中面临的种种瓶颈性难题找到更优化的解决方法和关键技术。（具体关系图如下） 课题设置 课题1： 致病基因结构与生物学功能研究 研究目标： 对富G核酸和G-四链体结构的性质，形成与转换，构象的解析、示踪和干预以及与识别分子的相互作用进行研究，分析富G核酸和G-四链体结合蛋白，筛选出具有识别G-四链体结构和调控癌基因表达的化学小分子。通过对富G核酸和G-四链体结构与小分子的相互作用研究，在分子水平上阐明富G核酸和G-四链体结构与生物学功能的关系，为相关疾病的诊断提供理论基础和特异性识别的小分子。分析明确G-四链体结构的损伤对其形成高级结构的影响，通过对富G核酸损伤和修复机制的研究，促进修复和抑制修复的干预，探讨实现保护正常细胞、促进癌细胞凋亡的途径。 研究内容： 设计、合成新型的小分子对富G核酸（癌基因）的结构进行调控；发展解析生理条件下富G核酸和G-四链体构象的技术；筛选、鉴定能够干预富G核酸和G-四链体与蛋白相互作用的小分子；研究小分子在生理条件下与富G核酸和G-四链体的相互作用及其生物学功能；富G核酸损伤检测，损伤对结构功能的影响，损伤修复机制及其干预。 经费比例： 20% 承担单位： 北京大学、中国科学院动物研究所、武汉大学 课题负责人： 袁谷 学术骨干： 冯钰锜、周燕、郝玉华、蒋风雷 24 课题2： 针对致病基因的高灵敏、特异性小分子的设计与合成 研究目标： 以特殊螺旋核酸结构为靶点，设计并合成不同结构的化学小分子（氮杂类、大环类化合物），对它们结构进行表征，并进行修饰和生物功能化，构建具有各种用途的多功能小分子，综合运用化学、生物物理、生物电化学等的方法与技术，基于化合物的特征性结构，研究小分子配体与特殊核酸结构的亲和作用，设计筛选出特殊核酸结构特异的高亲和性化合物；在分子水平上理解其作用机制，揭示小分子-核酸间的结构功能关系。 研究内容： 设计并合成不同结构的化学小分子（氮杂类、大环类化合物）；筛选对特殊螺旋核酸结构具有结合能力强和选择性好的小分子配体；小分子对非规则核酸的结构调控，研究非规则核酸的生物学和医学功能；探索配体与特殊螺旋结构的核酸结合的生物热力学及动力学性质, 揭示反应驱动力的差异；探索小分子配体对正常细胞、癌细胞的毒性的影响；研究病变细胞和正常细胞修饰电极对特定分子探针的响应及响应的异同点。 经费比例： 20% 承担单位： 中国科学院长春应用化学研究所、武汉大学、西南大学 课题负责人： 任劲松 学术骨干：王海水、汪冬梅、翁小成、宋杨、蒲芳 课题3：分子探针对癌基因、DNA甲基化和致病基因的识别与调控 研究目标： 合成卟啉、酞菁类、氮杂类分子等其它小分子，用生物物理、分子生物学的技术研究它们与不同致病基因（主要是癌基因和DNA甲基化基因）的相互识别作用，得到具有高选择性的小分子，并对这些高选择性小分子进行光、电和色功能团修饰。通过使用色谱和质谱技术以及相关的生物技术手段，分析细胞在探针分子与DNA甲基化基因或癌细胞处理之后，基因片断或全基因组范围胞嘧啶的甲基化变化，特定基因启动子区域甲基化水平的变化，DNA甲基化转移酶以及组蛋白的修饰，从表观遗传学上阐明探针分子的作用机制。这些功能化的生物探针分子，可供给课题五的人员研究。与此同时，利用我们发现的利用核酸酶性质组装的核酸探针，针对不同的突变点进行组合，为课题五的研究提供探针分子。 研究内容： 设计并合成卟啉、酞菁类、氮杂类小分子，组装寡核苷酸序列探针，并对这些高选择性小分子进行光、电和色功能团修饰；研究其对癌基因、DNA甲基化基因和突变基因的识别作用。 经费比例： 25% 承担单位： 武汉大学、四川大学 课题负责人： 周翔 学术骨干：黄卫华、袁必锋、余孝其、田沺、王芳、王少儒 课题4：对乳腺癌、肝癌识别的适配子的设计与筛选 研究目标： 得到能特异识别乳腺癌、肝癌标志物或CTC的小分子核酸适配子，并进行具有光或电或色响应的小分子连接，进行结构鉴定，生物活性鉴定等；对筛选的小分子核酸适配子进行化学修饰，使其具有稳定性，研究该类分子的稳定性和特异性，并对这些高选择性小分子进行光、电和色功能团修饰，为课题五提供分子探针。 研究内容： 利用SELEX技术自主筛选能特异性结合乳腺癌、肝癌标志物或CTC的小分子核酸适配子，建立乳腺癌、肝癌的分子诊断新技术。核苷类衍生物的设计与合成, 核酸适配子结构的改造与合成，包括碱基、磷酸骨架等的修饰，提高核酸适配子在细胞内的稳定性和特异性。将发现的理想核酸适配子分子与具有光或电或色响应的小分子结合，得到探针分子。 经费比例： 20% 承担单位： 北京大学医学部、武汉大学 、陕西师范大学 课题负责人： 杨振军 学术骨干：汤新景、章晓联、武芸、关注、赵利军 课题5：基于核酸的乳腺癌、肝癌的诊断新技术 研究目标： 针对肿瘤疾病的致病核酸结构，获得便捷、高通量低成本的核酸特异、灵敏分子探针，研究这些分子探针对不同的肝癌、乳腺癌等癌症DNA甲基化分子、癌基因等靶标的临床检测; 针对肿瘤标志物和肿瘤，筛选出能特异识别的适配子，经过光、电、色的修饰后，达到对肿瘤标志物进行灵敏检测目的。 同时,发现对核苷类生物标志物具有特异性识别功能的G-四链体核酸探针, 提出利用G-四链体核酸探针分离、富集核苷类生物标志物的方法, 发现1-2个能提高质谱检测灵敏度高的化学衍生化试剂, 建立可在医学领域中应用的衍生化-电喷雾质谱法高灵敏度检测癌变过程生物标志物的新方法。研究这些技术希望达到能对于肝癌等癌变过程的临床医学早期预警和诊断的目的,也为肿瘤疾病的预后判断和干预提供理论依据。 研究内容： 筛选对肿瘤疾病的富含G核酸的癌基因、DNA甲基化序列和突变基因的结构，运用前面几个课题组开发的探针分子，研究它们对肿瘤（肝癌和乳腺癌）标志物的准确、灵敏识别作用，并开展临床检测工作研究；在此基础上，制备相关的基因诊断芯片。研究CTC的富集技术，开发核酸适配子对它们的选择性识别作用；与此同时，筛选得到的核酸适配子对肿瘤细胞中的标志物进行灵敏诊断。 运用质谱的技术， 筛选对核苷类生物标志物具有特异性识别和结合功能的探针分子, 基于核酸探针特异性分离、富集核苷类生物标志物。设计、合成和发现化学衍生化试剂, 衍生化生物标志物，提高质谱检测的灵敏度, 发展衍生化-多离子检测HPLC-ESI-MS法高灵敏度检测癌变过程生物标志物的新技术、新方法。 从三个不同的层次和水平进行肝癌、乳腺癌的早期预警和诊断、预后治疗判断和指导个体化治疗技术的研究，利用发现的核酸探针，对癌基因、甲基化的DNA和突变基因进行检测，达到对肿瘤疾病的早期预警和诊断、预后治疗判断和指导个体化治疗。 经费比例： 15% 承担单位： 武汉大学、北京大学 课题负责人： 涂建成 学术骨干：郑芳、周新、周江、刘松梅、沈磊 四、年度计划 研究内容 预期目标 第 一 年 1. 致病基因(乳腺癌、肝癌)富G核酸的结构分析和识别。 2. 致病基因(乳腺癌、肝癌等)特殊二级结构G-四链体结构形成、性质与转换的研究。 3. 设计并合成卟啉、酞菁类、氮杂类分子\吡咯的单体衍生物, 吡咯二聚体的衍生物; 新型环状寡聚酰胺识别分子合成方法的研究。并对它们的结构进行表征，确定化合物是否合成成功。 4. 多功能纳米生物探针的制备：合成多种多功能复合纳米材料，结合表面化学修饰和生物功能化修饰，制备多功能纳米标记材料和纳米复合探针。 5. 针对乳腺癌、肝癌循环肿瘤细胞核酸适配体的筛选。 6. 设计、合成不同的富G序列，构建不同结构的G-四链体核酸探针分子库; 研究G-四链体核酸探针与核苷类生物标志物的相互作用, 筛选对癌变过程核苷类生物标志物具有特异性识别和结合功能的核酸探针分子。 7. 开展系统的异核苷修饰化学合成工作。 1. 分析癌基因富G核酸的结构和识别。提出癌基因富G 序列特殊二级结构G-四链体结构形成的条件、稳定性。提出富G核酸损伤检测的初步方法。 2. 初步建立荧光分子标记-分子识别-光切割-凝胶电泳分析G-四链体构象的新方法。 3. 成功的合成吡咯的单体衍生物和 吡咯二聚体的衍生物, 初步建立合成新型环状寡聚酰胺识别分子的方法.对合成的新化合物进行结构鉴定。 4. 以特殊核酸结构为靶点，结合功能纳米材料成功构建筛选体系。 5. 设计出针对未知基因突变的核酸探针检测体系。 6. 开始筛选能对乳腺癌、肝癌等细胞或标志物特异识别的核酸适配体。 7. 得到异核苷修饰的核酸适配体；合成肽缀合核酸适配体；完成5’-修饰(CN、炔基)的核苷单体。 第 二 年 1. 针对甲基化DNA的结构，从核酸序列和单个甲基化碱基入手，从化学的角度筛选出不能对它们具有特异识别的化学分子。 2. 针对醛基化DNA的结构，设计并合成能对该类结构特异识别的小分子，并对它们的化学结构进行确定和证实。 3. 提取细胞内基因组DNA，初步用HILIC-ESI- MS/MS系统进行甲基化DNA的定量。开展气相色谱-质谱检测技术检测细胞内基因组DNA甲基化和羟甲基化含量。 4. 研究核酸在纳米粒子表面的固定方法对固定的核酸进行各种表征。 5. 探索多功能纳米生物探针应用于重大疾病相关的核酸限制酶、修饰酶及相关酶抑制剂研究；抗癌药物筛选。 6. 设计、合成、筛选出系列对特殊核酸序列及结构具有特异性识别能力的配体。 7. 采用针对核酸突变的探针检测肝癌、乳腺癌等的组织标本。 8. 核酸适配体结合肝癌、乳腺癌细胞系标本；设计针对多种遗传病疾病包含遗传性肿瘤的核酸探针。 9. 建立研究核酸适配体三维结构与靶分子三维结构之间识别的对应关系方法。考察肽缀合核酸适配体的生物学性质及生理条件下稳定性等；考察肝癌、乳腺癌标识物的核酸适配体生理条件下的灵敏性。 1. 筛选能对甲基化DNA的结构的化学分子，并对它们结构进行表征和鉴定。合成系列化合物，能对醛基化DNA的结构具有特异识别作用，并对它们的结构进行表针和鉴定。 2. 建立快速、高灵敏的DNA甲基化和羟甲基化的Online trapping- monolith HILIC-ESI- MS/MS检测系统。建立高灵敏的气相色谱-质谱连用检测细胞内基因组DNA甲基化和羟甲基化系统。 3. 分析致病基因富G序列形成G-四链体的结构和构象,在不同环境下可能形成的结构。 4. 合成新型的环状寡聚酰胺识别 分子。研究化学探针分子与致病基因富G序列（核酸）和G-四链体相互作用的机制。 5. 构建富含鸟嘌呤序列(乳腺癌、肝癌等癌基因启动子区)的荧光素酶报告基因质粒以及突变序列的荧光素酶报告基因质粒，研究化学探针分子与G-四链体的结合对荧光素酶报告基因生物学功能的影响。 6. 分析2个致病基因富G序列形成G-四链体的结构和构象。提出化学探针分子与致病基因富G序列（核酸）和G-四链体相互作用的初步机制。 7. 获得一些新型的多功能纳米标记材料和纳米生物探针，得到对特殊核酸结构及序列高度选择性、高结合能力的配体。 8. 进一步筛选的核酸适配体可以特异性地和乳腺癌、肝癌细胞系结合。 9. 了解核酸适配体功能的影响因素；得到生理条件下稳定的肽-核酸适配体缀合物；初步得到天然的诊断肝癌、乳腺癌标识物的核酸适配体。 第 三 年 1. 将筛选出的化合物进行光、电、色等基团的修饰，对它们的结构进行表证，确定它们的结构正确性. 2. 研究这些修饰的化合物的物理和化学性质，保证该类化合物修饰后仍保持原有的性质。分别用两种不同的方法分析正常细胞和癌细胞中DNA甲基化和羟甲基化的差异。 3. 分析抗癌药物处理癌细胞前后的DNA甲基化和羟甲基化的差异。建立M13穿梭质粒平台，构建含有羟甲基胞嘧啶的单链M13质粒载体，开展羟甲基胞嘧啶的复制、转录和修复的研究。 4. 合成新型的环状寡聚酰胺识别分子。 5. 使用合成的新型化学探针分子，选择性干预富G核酸和G-四链体与蛋白相互作用。 6. 培养乳腺癌、肝癌细胞，加入高生物活性的新型化学探针分子，研究化学探针分子调控癌细胞生物学行为的功能。 7. 设计合成多功能纳米晶粒新型生物标记系列材料，进行表面修饰和生物功能化。 8. 采用针对突变DNA的新型探针检测患者体液、血浆DNA标本；特异性核酸适配体标记载体；遗传性疾病的检测探针检测患者DNA标本。 9. 研究核酸适配体共价缀合物(多肽、靶向基团)对其功能的影响。研究各种响应信号的传导与放大技术，提高其传感器的放大技术。 1. 获得系列修饰的光或电或色的分子，对这些化合物用核磁、质谱和元素分析等方法对它们结构确定；进益步用紫外、荧光、SPR等方法研究它们的物理、化学的相关性质。 2. 获得正常细胞和癌细胞中DNA甲基化和羟甲基化含量的数据，并进行分析。分析抗癌药物的去甲基化作用。 3. 初步建立羟甲基胞嘧啶的复制、转录和修复的研究平台。初步获得一些羟甲基胞嘧啶特异性结合蛋白。 4. 合成1-2个新型的环状寡聚酰胺识别分子。 5. 获得1-2个选择性干预富G核酸和G-四链体与蛋白相互作用的化学探针分子。 6. 获得1-2个具有调控癌细胞生物学行为的化学探针分子。 7. 在分子水平上认识了解小分子