2010CB732400-仿生分子识别技术在生物医学应用的基础研究 (2).Doc

项目名称： 仿生分子识别技术在生物医学应用的基础研究 首席科学家： 鞠熀先 南京大学 起止年限： 2010年1月-2014年8月 依托部门： 教育部 一、研究内容 本项目基于生命科学、材料科学、信息科学、肿瘤学、临床诊断学、化学等学科的发展与综合交叉，结合成像、仿生和纳米技术的创新成果，力求将仿生分子识别体系发展成分子识别与早期诊断的有效工具，发现癌变细胞的特异性生物标志物，而发现癌变标志物与药物靶点的筛选又有异途同归、异曲同工的功效，因此可为致癌机制研究与癌症早期诊治新方法的发展奠定基础。围绕这一基本科学问题，将从仿生分子识别体系的弱相互作用及其演化规律、分子识别探针的合成与筛选方法、新型生物标志物的甄定、高灵敏传感与成像方法和癌症的早期诊治与预警研究等几个方面解决相关的科学问题： （1）仿生分子识别体系的弱相互作用规律及其识别探针的设计与筛选： 分子识别源于识别探针与目标分子的相互作用，因此仿生分子识别体系基础研究的重点和关键首先是仿生分子识别体系的构-效关系研究和生物作用机制的阐述。通过建立相关的理论模型，可使整个项目的开展在有序和理性的层次上进行，实现识别探针的设计与筛选从“被动模仿”到“主动模拟”的飞跃，提高筛选效率和分子识别性能。 （2）新型生物标志物的甄定： 制约癌症早期诊断的一个重要因素是特异性生物标志物的缺乏，从体液与癌变细胞质筛选生物标志物又面临方法学的难题和灵敏性的局限。本项目基于核酸适体结构识别高特异性和高灵敏的检测新方法，通过癌变细胞表面受体的核酸适体特征分子图谱与特征分子指纹，甄定新型特异的癌症标志物，为癌症标志物的筛选、早期诊断和致癌分子机制研究提供新的思路。 （3）高灵敏仿生分子识别成像与传感方法： 癌症早期诊断存在的关键问题是检测方法操作复杂、价格昂贵、灵敏度与准确性不高。解决仿生分子识别成像与传感方法中的基本科学问题，可建立灵敏、快速、简便、特异的癌症检测方法，实现肿瘤的早期准确诊断与预警。 主要研究内容包括： 围绕拟解决的关键科学问题，本项目主要开展四方面的研究工作：分子识别体系识别机制的基础研究，分子识别体系的设计与识别探针的合成、筛选及性能研究，基于仿生分子识别体系的高灵敏高选择性的传感与成像方法的建立，生物标志物甄定、癌症早期诊断与预警。具体研究内容如下： （1）分子识别机制与理论模型： 利用现代波谱、多维核磁共振、单分子技术等生物物理方法，研究核酸适体、分子印迹材料和纳米生物探针分子识别过程中的分子间弱相互作用，获得识别分子的三维结构信息和分子作用过程的热力学与动力学参数，探讨纳米界面体系探针分子与生物标志物识别的化学本质。根据分子识别过程中所涉及的化学组成、空间结构和结合位点等信息，研究探针与目标分子的识别动力学机制以及受外场的影响，从分子角度出发，利用化学计算、分子模拟和分子设计，开展仿生分子识别体系的构-效关系研究，阐述分子识别的作用机制、表达与变化模式。建立相关的理论模型，为仿生分子识别体系的构建、筛选和性能评估，以及新仿生分子识别体系的设计提供理论指导。这部分工作将是课题1的研究内容。 （2）分子识别体系的设计与识别探针的合成、筛选及性能研究： 通过仿生、目标筛选、模板诱导、分子裁剪、功能化衍生等手段，设计、合成并筛选具有独特性能的分子识别体系 ¾¾ 核酸适体、分子印迹材料和纳米生物探针。在核酸适体筛选方面，将以细胞筛选为重点，发展针对蛋白质、细胞、组织等不同生物靶标在复杂混合体系中核酸适体的筛选方法，并通过对单个碱基、磷酸骨架的化学修饰或使用非天然核酸单体等方法提高核酸适体在复杂环境中的特异性和抗核酸酶降解的稳定性，研究其与靶标结合的亲和力和特异性。在分子印迹材料方面，将以2D分子印迹技术和可控分子印迹技术为重点，结合纳米材料和功能高分子合成领域最新研究成果，考察三维空间结构、氢键、静电力、疏水作用对生物大分子识别的影响；选择癌细胞表面特异膜蛋白作为印迹对象，通过合成膜蛋白的分子印迹纳米材料，实现对癌细胞的识别检测。纳米生物探针的构建与性能研究将首先自主设计、开发特异、灵敏、简便、经济的仿生识别分子与光、磁敏双功能纳米粒子；用这些仿生识别分子修饰多种纳米材料，赋予纳米粒子的仿生识别功能，或用生物识别分子桥联双功能纳米粒子，形成光-磁-生物靶向三功能复合纳米探针，发展用于高灵敏生物传感和生物成像的纳米生物探针，考察探针对单个分子或靶向细胞的识别能力，研究其相互作用的动力学过程，并用于光电磁信号的传导与放大和癌症早期诊断。这部分工作将是课题2与3的主要研究内容。 （3）高灵敏高选择性的传感与成像方法： 利用仿生分子识别新体系的高选择性和高亲和力，结合仿生分子识别体系功能化方法，综合运用各种纳米技术构建纳米结构生物传感界面，建立癌症标志物的高灵敏高选择性检测新方法。以微纳技术为基础制作纳米传感器识别阵列和微流控芯片，发展微阵列和微芯片检测的信号放大方法，研制高灵敏的光、电传感器件，实现对复杂生物体系中微量或痕量多目标癌症标志物或肿瘤细胞的快速高效检测。将高灵敏的光、电、磁等传感技术与仿生分子识别体系相结合，设计体内、体外和细胞等层面的分子成像系统，建立基于仿生分子识别体系（如光-磁-生物靶向三功能复合纳米探针）的成像新原理、新方法（如双色复合光原理和比色成像、荧光成像与核磁共振成像新方法），实现生理、病理变化的在体、实时、动态、无创三维成像，在细胞和分子水平上特征显示活体内的生物过程，为癌症标志物的甄定、致癌分子机制研究与癌症早期诊断提供灵敏快速便捷的新工具。这部分工作将是课题4的研究内容。 （4）生物标志物甄定和癌症早期诊断与预警： 以肺癌、肝癌、白血病为对象，建立裸鼠移植瘤模型。用筛选得到的核酸适体分离并获得相应的配体靶标，通过质谱技术和蛋白质序列比对、结构功能预测以及树状分类分析等生物信息学手段分析配体的结构和功能；利用建立的传感与活体成像新方法，获得裸鼠接种成瘤后的癌细胞分子指纹图谱，结合临床表现，探讨癌变细胞表面受体的核酸适体特征分子图谱与指纹的早期诊断价值，甄定癌症早期诊断的生物标志物。通过在体、解剖和离体研究手段，建立癌症早期诊断与预警的新方法，并开发具有自主知识产权的配套诊断系统。这部分工作将是课题2的研究内容之一和课题5的研究内容。 二、预期目标 本项目面向我国社会发展中提高人类健康的国家需求，以建立与人类健康密切相关的重大疾病（恶性肿瘤）早期诊断新方法为总体目标，通过揭示仿生分子识别的作用机制，合成与筛选仿生分子识别探针，建立高灵敏传感与分子成像新方法；利用仿生分子识别体系的识别和定位功能，甄定新型癌症标志物，为癌症早期诊断与预警提供新原理和新方法，也为生物医学研究提供支撑平台和理论基础。通过开展多学科交叉与综合研究，将为解决生物医学前沿领域和关系人类健康的重大科学问题提供新思路，形成具有原始创新方法学突破及自主知识产权的支撑平台，获得具有国际影响的重要研究成果，培养造就一支具有多学科知识和创新研究能力的研究队伍。 五年预期目标： 1. 揭示仿生分子识别体系的基本识别规律，发展几类具有自主知识产权的系统研究弱相互作用的计算化学模型，为仿生分子识别体系的设计、筛选、构-效关系和性能评价提供理论指导。 2. 建立针对蛋白质、细胞、组织等不同层次生物靶标的核酸适体筛选方法与可控分子印迹方法，筛选出癌细胞或其特异性标志物的核酸适体6-8种，研制6-8种蛋白质和癌细胞的分子印迹材料与纳米生物探针。 3. 发展基于仿生分子识别体系的检测新原理和分子成像新方法，研制出相应的传感器件、多功能生物识别探针、检测与成像系统，其灵敏度超过目前已有方法，为致癌分子机制研究和早期诊断与预警提供高灵敏高选择性的检测方法。 4. 建立肺癌、肝癌、白血病等肿瘤细胞的特征核酸适体图谱，提出2-3种特异性高的癌症标志物，并完成仿生分子识别体系在癌症早期诊断中的临床意义评估, 开发具有自主知识产权的诊断系统。 5. 取得有国际影响的重要基础研究成果，提出有自主知识产权的新理论和新方法。5年内发表SCI收录论文200篇以上，其中影响因子5以上刊物不少于50篇；获得30件以上发明专利；出版专著2本；获国家级科技奖励1-2项。 6. 在仿生分子识别领域培养一批具有化学与生物医学交叉学科综合知识的研究人才，包括2-4位国家杰出科学基金获得者。通过项目协作，形成一支在相关领域具有国际影响的学术梯队。 三、研究方案 （一）总体思路： （1）面向重大需求，带动仿生分子识别体系的基础研究： 本项目从“国家中长期科学和技术发展规划纲要”中“人口与健康”等国家重大战略需求出发，以2009年度973计划综合交叉领域重要支持方向“生命科学与人口健康的重大交叉科学问题” ——“成像、仿生等技术在生命科学和医学中应用的科学问题和技术基础研究”为依据，发挥分子识别高特异性、高灵敏度的优势，以及仿生分子识别体系高稳定性，可获得病变组织与细胞特征分子指纹的特点，开展仿生分子识别体系的构-效关系研究，形成相应的理论模型，指导仿生分子识别体系的构建与筛选，发展符合人类健康需求的仿生分子识别检测新原理、新方法和新器件，为癌症早期诊断提供特异性生物标志物、分子识别探针、分子识别传感器件与成像系统，满足提升我国人民健康水平的需求。 （2）通过学科交叉，发展癌症早期诊治新方法： 随着核酸适体、分子印迹和纳米生物探针研究方法的发展和成熟, 仿生分子识别在疾病诊治方面的应用正面临新的机遇。利用我们在仿生分子识别体系基础研究和技术创新方面的优势，通过多学科交叉, 联合国内的优势单位组成跨学科的研究团队（包括化学、生物、纳米、材料, 临床医学等学科），系统地开展成像与仿生技术的基础研究，利用仿生分子识别体系进行癌症早期诊断与预警，将仿生分子识别体系在生物医学领域的应用潜力变成现实。 （二）技术路线： （1）仿生分子识别体系分子识别机制的研究： 根据上述总体思路，本项目首先深入研究生物分子识别规律，利用现代波谱技术、多维核磁共振和现代单分子探针技术揭示仿生分子识别体系与靶标分子的相互作用过程与构-效关系，通过化学计算、分子模拟和分子设计，建立相关理论模型，并利用这些模型和机制评估、筛选新的仿生分子识别体系，为分子识别体系的性能研究和器件应用提供理论基础。 （2）核酸适体筛选方法研究： 构建DNA和RNA分子文库，通过对核苷的2’位修饰或对磷酸骨架进行巯基修饰等，改善文库的生物稳定性。对已有明确疾病标志物的体系，以过量表达标志物和不表达标志物的细胞做正、反向筛选；对标志物不明确的体系，直接以病变细胞和正常细胞或不同类型的病变细胞做正、反向筛选，优化DNA/RNA吸附分配、配体洗脱、反向筛选对照细胞选取、PCR扩增条件等筛选条件。对筛选出的核酸适体进行测序、二级结构模拟分析、序列裁减后，用流式细胞仪和荧光显微镜等方法表征筛选出的核酸适体与靶标结合的亲合力和特异性。改变实验的温度、缓冲溶液的pH、离子强度等探求核酸适体探针与靶标结合的最佳条件。 （3）分子印迹材料筛选方法研究： 以纳米材料如石墨烯、纳米金等为蛋白质分子的载体，利用2D分子印迹技术、可控分子印迹技术，在纳米材料表面进行癌症标志物蛋白的分子印迹。通过改变纳米材料表面的疏水性、电荷，以及选择不同的功能单体和交联剂，考察三维空间结构、氢键、静电力、疏水作用对蛋白质分子识别的影响，与课题1所建立的理论模型相结合，优化最佳的蛋白质印迹条件。选择癌细胞表面特异膜蛋白作为印迹对象，通过合成膜蛋白的分子印迹纳米材料，实现对癌细胞的识别检测。结合纳米材料的光、电、磁性能，研究将分子印迹材料的分子识别转化为光电磁信号的方法，探索基于该类型光电磁分子印迹材料的癌症标志物蛋白和癌细胞的检测方法。 （4）纳米生物探针的构建方法研究： 将仿生分子识别体系与纳米技术相结合构建各种功能化纳米生物探针。首先用多种自主设计的的仿生识别分子或生物识别分子修饰纳米金、量子点、多孔纳米材料、碳纳米管和磁性纳米粒子等纳米材料，获得电、光、磁等功能纳米生物探针，实现对单个分子或细胞的快速检测和对病变组织的高灵敏成像，以期用于肿瘤早期诊断；进一步发展可对不同层次生物靶标的电学、光学和力学等特性进行研究和表征的新装置。 1）基于仿生识别分子的纳米生物探针设计和应用：结合纳米技术和仿生分子识别，制备多种灵敏、简便、经济的分子探针；考察探针对单个分子或靶向细胞的识别能力，研究其相互作用的动力学过程，提出改善探针靶向效率的最佳方法。通过反馈与改进，筛选出稳定性好、可以从复杂流体中迅速、特异地识别靶向物质或细胞的分子探针，以期用于癌症早期诊断。 2）仿生分子识别体系在纳米粒子表面的固定化：综合运用各种纳米组装手段，结合仿生分子识别体系功能化方法，构建功能化纳米生物探针；开展自组装、原位沉积、物理插入、化学修饰等传感界面固定化方法研究，实现表面密度与取向可控的仿生分子识别探针的固定化。 3）研究基于仿生分子识别体系的传感器构建的基础条件：利用仿生分子识别的原理，以微纳技术为基础，研究制作基于仿生分子识别体系的纳米传感器、微传感器、微阵列和微芯片的方法。探讨传感界面体系探针分子的负载量与仿生分子识别能力的关系，优化探针分子的空间分布。探索提高仿生分子识别体系纳米传感器、微传感器、微阵列和微芯片系统的重现性与稳定性的方法。 （5）高灵敏高选择性的传感与成像方法与系统设计： 研究基于仿生分子识别体系的传感器构建的核心技术。探讨多种提高传感器检测灵敏度的手段，尤其是研究微阵列、微芯片检测的信号级连放大技术；在此基础上研制高灵敏的压电、阻抗、电容、荧光成像及表面等离子共振等直接检测靶标分子的传感器，抑制复杂生物体系中的交叉干扰现象，实现对其中特定靶标分子的实时高效监测。着重提高其检测通量和快速信号捕捉能力，以适应某些靶标物质的瞬时响应和快速湮灭过程。进一步发展同步监测技术，通过多靶标的动态跟踪和比对，掌握其浓度的梯度分布情况及其随外部因素变化而产生的涨落，为研究癌症体系分子介导的相互作用及其调控机制打下良好基础。 构筑石英晶体微天平、高灵敏试纸、液相和微流控芯片等几种基于仿生分子识别体系的纳米传感器。针对不同的目标传感器分别采用电化学、物理插入、化学修饰、流体力学等方法在各种微纳结构上进行仿生识别分子的表面修饰，研究界面识别过程中生物量和化学量通过界面效应转换成物理量的机制，建立基于仿生分子识别的生物传感新原理、新方法。引入不同的纳米材料，优化实验条件，寻求放大信号和提高传感器检测灵敏度的办法。 发展用于活体成像的多功能纳米生物探针。利用双色复合物制备具有仿生分子识别功能的纳米比色传感颗粒。例如，首先利用水相合成方法制备具有发光效率高、发光稳定的量子点，然后采用反向胶束法将合成的量子点发光材料外层包埋SiO2壳层以保证内部量子点荧光发光稳定并不受外界条件变化的影响，最后在纳米硅球最外表层修饰仿生分子识别材料，制得纳米比色传感颗粒。微观体系中目标物可利用双色复合光原理进行比色成像检测。探讨利用共聚焦显微镜进行活体成像颜色的观察条件和方法。 利用仿生识别分子的高选择性、高亲和力的优异性能，发展基于光、电、磁信号传导与放大的新方法，结合探针稳定修饰与标记手段，设计体内、体外和细胞等层面的分子成像新原理，建立基于光-磁-生物靶向三功能复合纳米探针的三维成像新方法，为致癌分子机制研究及癌症早期诊断提供方法基础。 （6）特异癌症标志物的甄定： 以癌变组织、细胞为靶标，以正常组织、细胞作对照，设计仿生识别癌变组织和细胞的分子探针，用筛选得到的识别探针分离癌变组织与细胞所特有的功能分子，获得其分子指纹，有效区分癌变组织与细胞和正常组织与细胞在分子水平上差异；对筛选出的差异分子，检测其在癌变组织与细胞及正常组织与细胞中的表达，构建相关载体，并在细胞水平及动物模型中改变其表达，观察其表达改变后对细胞生长及动物模型存活的影响，探讨差异分子在肿瘤发生中的作用，并以此发现特异癌症标志物。 （7）癌症早期诊断与预警方法研究： 从肺癌、肝癌和白血病的诊断入手，以早期肺癌、肝癌和白血病患者血清、不同分型分期的肺癌病理标本、人类小细胞肺癌（SCLC）细胞系NCI-H446、肺腺癌细胞系G148、肺鳞癌细胞系L78、人原发性肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721等为靶标筛选特异性核酸适体图谱。对大量早期肺癌患者、健康对照人群和慢性肺部疾病人群血清样本检测，确认仿生分子识别体系用于癌症早期诊断的价值。检测不同亚型和分期的肺癌病理标本的核酸适体图谱，探索其在肿瘤分型诊断中的临床意义。 以肝癌为例，通过随访资料，将已保存10-15年的肝病患者血清与组织标本分成癌变与没有癌变两组，用筛选得到的核酸适体检测标本中的蛋白质受体，比较两组检测结果，提出有价值的预警指标。同时，利用前期已得到的肝病患者的4个基因，合成筛选纳米生物探针，联合监测这些基因在上述血清与组织标本中的表达，通过分析随访资料，提出癌变预警指标。利用高灵敏的生物探针和纳米传感器，结合这些提出的癌症与癌变标志物，开发快速诊断与预警系统。 （三）创新点与特色 本项目立足于项目组在化学、材料学、医学、传感与纳米生物技术等方面良好的研究基础，结合项目组成员在核酸适体、分子印迹和纳米生物领域取得的重要进展，尤其是细胞筛选法和可控分子印迹法的初步结果，系统开展仿生分子识别体系应用于癌症早期诊断与预警的基础研究，具有以下多方面的创新性： （1）以建立的仿生分子识别体系理论模型为指导，使项目在有序的层次上展开： 提出系统研究仿生分子识别体系对靶标分子的识别机制与结合位点，揭示这些体系的三维结构信息，阐述分子识别体系的构-效关系与相关的理论模型，指导分子识别研究在理性和设计的层面进行，实现从“被动模仿”到“主动模拟”的飞跃，将极大地促进分子识别理论的深化，对仿生分子识别体系的构建、筛选和性能评估，以及新型仿生分子识别体系的开发具有至关重要的影响。 （2）针对多层次靶标揭示核酸适体的筛选规律： 提出生物大分子、细胞、组织等多层次靶标的核酸适体筛选与识别方法，可获取癌变细胞或组织的核酸适体分子图谱，并提供癌症发生、发展过程中特异生物靶标的分子指纹与表达模式，研究成果将为癌症诊断治疗、分子机制研究与癌症标志物的发现与鉴定提供新的重要资源。 （3）提出高效发现与检测癌症标志物的分子识别新方法： 所提出的肿瘤细胞核酸适体筛选方法可在更接近生理条件，尤其是在未知标志物条件下进行筛选，揭示肿瘤细胞与正常细胞分子水平上的差异，为癌症标志物的甄定提供捷径。在发展分子印迹材料与纳米生物探针方面，将在理论模型指导下，结合可控印迹与功能化技术，形成结合位点均匀、结构有序和传质速度快的仿生分子识别结构，实现蛋白质与癌细胞的分子识别与高效检测。 （4）提出仿生分子识别体系用作成像检测的物质基础： 利用仿生分子识别体系易于功能化的特性，将仿生分子识别体系与功能纳米材料、传感电/光极、微芯片的直接结合，通过分子探针的有效固定和微区成像系统的构建，实现传感单元的成像检测和目标分子的高通量检测。该研究成果将为建立仿生分子识别传感和成像方法提供重要的物质基础。 （5）构建的方法可用于癌症早期准确诊断与预警： 提出以核酸适体图谱为工具，高效发现肿瘤相关标志物与癌症预警指标的新思路，并利用这些标志物建立癌症早期准确诊断与预警的新方法。发现癌变标志物与药物靶点的筛选有异途同归、异曲同工之功效，因此可为癌症早期治疗方案的确立提供新的依据，可望在疾病的早期诊治方法学方面取得创新性成果。 本项目具有以下特色： （1）创新性强。面向国家需求发展癌症早期诊断新方法，提出核酸适体筛选与分子图谱新概念，以及分子印迹材料的可控制备方法，已积累了前期实验的大量数据，为本项目的开展提供了坚实的基础，可望获得突破性的创新成果。 （2）突出理论与应用的交叉。系统研究仿生分子识别体系的识别规律，建立分子识别模型，在理论层次上指导仿生分子识别体系的设计与应用。 （3）研究内容覆盖了生物、材料、临床医学、化学、纳米技术等学科，体现了多学科交叉融合的特色，学科交叉与综合明显。 （4）项目组在肿瘤研究与治疗、传感技术、生物成像、纳米生物分析技术等方面具备很强的研究基础，起点高，为项目的高效率实施提供了保障。 （四）取得重大突破的可行性 本项目所组织的研究团队及其研究骨干皆有多年从事相关领域基础研究的经验，又大多经过了包括“八五”、“九五”、“十五”国家自然科学基金重点、国家重大科技攻关项目，科技部国际合作重点项目等一系列重大基础研究的历练和磨合，凝聚了一支来自国内主要优势单位的多学科紧密配合的创新研究群体，包括教授18人，副教授9人，其中“新世纪百千万人才工程国家级人选” 2人，“长江学者”特聘教授2人，国家杰出青年基金获得者1人、国家自然科学基金委优秀中青年人才基金1人，教育部新世纪优秀人才7人，研究条件互补性强，具备化学、生物医学、肿瘤细胞生物学、材料、纳米、传感器等不同学科专业背景，已经基本具备了开展研究的软硬件条件。而且，各参加单位已经开展了与本项目相关的前期研究工作，取得了一些创新性成果，并在国际上已有一定的影响。 （1）仿生分子识别体系的分子识别机制研究： 项目承担单位南京大学研究团队从宏观的表面电化学入手，深化了自组装膜长程电子传递和跨膜电子传递的物理模型，并自编程序进行细致的数学模拟，澄清了分子间强相互作用对电子传递行为的影响。开展了扫描探针显微术的纳米操纵与纳米尺度电子传递的创新性研究，基于纳米图案化自组装膜的导电分布，提出了多进制超高密度信息存储的原理。探索了蛋白质在扫描探针针尖上的修饰，从微观水平阐述了生物活性和分子结构的关系。 该团队在量子化学计算、第一性原理非平衡态格林函数计算和超大规模分子动力学计算等方面有坚实的基础。建立并完善了分子电子材料在电场作用下的量子化学研究方法，系统考察了一系列共轭分子导线在电场作用下的几何特征和电子结构的变化，提出了构象分析新方法。与微观的单分子测量技术相结合，从第一性原理计算研究了一系列分子导线的电子输运行为，提出了分子整流器件的设计原则，被诺贝尔奖获得者Zewail教授评价为该领域的“Significant contribution”。独立开发了具有完全自主知识产权的超大规模分子动力学仿真程序，获得国家软件著作权。相关成果在包括化学领域影响最为广泛的J. Am. Chem. Soc.和Nano Lett.等刊物发表论文90余篇。 （2）核酸适体分子的筛选、识别与生物医学应用： 项目承担单位厦门大学研究团队在核酸适体生物传感技术、核酸适体筛选技术等诸多方面积累了相当丰富的经验，具有较强的综合研究能力，并与美国Florida大学合作建立了以癌细胞为靶标的核酸适体筛选新技术，筛选出与白血病癌细胞特异结合的核酸适体，发现了不同类型癌细胞具有不同的特征核酸适体分子指纹。研究成果发表在PNAS上，并被Anal. Chem.以news形式着重报道，被认为“为第一个在分子水平上诊断癌症的系统方法开启了大门，也能在癌症个性化治疗方面起到重要作用”。近年来该团队筛选出肺癌细胞、肝癌细胞特异结合的核酸适体，并以此发现了一批与肺癌细胞、肝癌细胞相关的生物标志物，为核酸适体技术用于癌症的早期诊断和治疗奠定了基础。在核酸适体应用方面，建立了激发态缔合物的适体标记新方法，实现了在复杂生物样品中检测癌症标记物的特异性高灵敏检测（PNAS 2005）。利用化学组装方法，合成了系列荧光超猝灭剂（JACS 2005），首次报道了荧光放大高分子与核酸分子可控定量偶联新方法，为核酸探针设计提供了信号放大新方法（Angew Chem 2005）。探索和总结了各种提高核酸的生物稳定性的修饰方法（JACS 2005，NAR 2007），为适体在临床应用提供了重要保障。制成了我国首个玻璃/PDMS/玻璃微泵芯片，成功地实现了纳升级液滴中微球表面PCR和反转录PCR，为在微纳流控器件上开展核酸适体的高通量、高灵敏传感检测提供了重要的驱动控制技术和有效的信号放大方法。 （3）分子印迹材料的设计、合成与生物传感： 福州大学研究团队在分子印迹方法学研究、分子印迹材料纳米结构及组装方法研究、生物大分子印迹、分子印迹仿生传感等方面积累了丰富的经验。建立了可控分子印迹技术，实现了在多种材料、传感器、微芯片表面的分子印迹纳米结构的可控合成，提高了分子印迹材料的识别性能和应用的简便性(J. Am. Chem. Soc., 2004, 2006; Anal. Chem., 2007)；利用纳米材料为模板实现了蛋白质的2D分子印迹，为分子印迹材料在生物医学领域的应用提供了支持(J. Am. Chem. Soc., 2005; Anal. Chem., 2006）；将分子印迹材料与纳米功能材料和传感技术相结合，合成了分子识别探针，实现了靶标分子的仿生识别检测（J. Am. Chem. Soc., 2008; Anal. Chem., 2004）。 （3）分子探针设计、识别与传感器研究： 项目承担单位南京大学研究团队近期研制成一系列安培生物传感器和电致化学发光传感器，开辟了纳米量子点电化学传感新领域，研制成第一支量子点电致发光传感器和第一支酶/量子点电致发光生物传感器，提出了电致化学发光能量转移新概念，并用于生物分子检测，论文2007年10月发表后被美国化学会选为2007年第4季度Most-Accessed Article；原创性地提出了无试剂免疫分析和靶DNA序列检测新原理；制得可控银-DNA杂化纳米粒子、碳-硅介孔泡沫纳米笼、钯纳米粒子修饰纳米笼，构建了30多种仿生界面；结合PCR技术建立了极高灵敏度的DNA电化学检测方法；创建了细胞毒效应电化学研究、药敏检测与细胞膜上核苷载体与蛋白质受体的检测新方法；建立了肿瘤细胞表面糖基数原位检测的新原理，为细胞糖基化和相关致病机制研究提供了可靠方法。这些成果在J. Am. Chem. Soc., Anal. Chem., Adv. Mater., Adv. Funct. Mater.等SCI刊物发表论文100多篇，其中>5.0刊物30多篇。 项目承担单位福州大学研究团队近几年来承担了与分子识别传感技术有关的863计划、国家重大科技计划等省部级以上课题20多项，在生物传感与电致化学发光探针方面取得一系列创新性成果。通过建立数学模型，提出了抑制Ru(pby)32+电致化学发光反应的新机理，可以解释近年来发现的众多抑制电致化学发光现象，有助于发现更多的发光抑制剂，并建立它们的灵敏检测方法。提出了一类化合物增强Ru(bpy)32+电致化学发光的机理，成果被国际权威评论杂志Chemical Review大篇幅介绍。首次将热控微电极系统引入电致化学发光研究，解决了控制电致化学发光反应温度的难题，将检测灵敏度提高了2至3个数量级，并成功地开发了次黄嘌呤的热控电致化学发光酶生物传感器，该研究成果为开发一系列热控酶生物电致化学发光传感器开拓了新途径。 项目承担单位青岛科技大学研究团队以肿瘤相关标志物为对象，发展了特异、高灵敏的分子识别分析新方法，克服了常规生物传感分析交叉干扰的影响。采用聚合物等材料修饰电极、纳米粒子放大、生物条形码等技术研制出新型高灵敏的生物传感器。利用核酸适体开关和生物条形码信号放大技术，研制成腺苷生物传感器，一个纳米金颗粒上可以固定100多条信号DNA，使腺苷的检测灵敏度提高了6个数量级；用PbS和CdS半导体纳米粒子标记编码不同的DNA探针，实现了凝血酶、腺苷的同时检测。利用苤硒脑作为电化学探针，建立了快速测定细胞中谷胱苷肽的分析方法，检测限达83 pM，满足了实际样品分析测定的要求（J. Am. Chem. Soc. 2008）。利用生物相容性物质掺杂纳米粒子，构建了高灵敏的电化学免疫传感器，获得了有特色的创造性成果。利用抗原-抗体的特异性识别作用，将在线预富集、毛细管电泳分离（多维分离）、电化学分析相结合，实现了复杂样品中多种肿瘤标志物的同时测定。 项目推荐单位东南大学团队在纳米生物探针与传感技术的研究方面成功地得到了一系列多功能、可调制光电功能的纳米材料与分子探针。运用超分子识别和组合化学，设计和研究了特异性识别蛋白质或核酸序列分子等的新型电活性探针和荧光探针，并通过分子自组装和纳米技术获得对生物分子具有特异性识别功能的分子探针，实现了在纳米界面体系中极高灵敏度的生物分子识别检测及表面可控功能膜的组装和分子基功能器件的在线控制与表征。在超分子识别生物分子及其分子基器件和生物芯片的研究、纳米生物传感技术的应用、基于纳米生物界面的高灵敏肿瘤检测、靶向控释治疗及其抑制肿瘤多药耐药性作用机制的研究、现场光谱电化学接触角检测系统及其微纳界面分析新方法的构建等方面做了大量而有成效的研究工作，取得了一系列创新性研究成果，为开展本项目工作奠定了研究基础。 （4）基于仿生分子识别的成像分析新方法研究： 项目承担单位厦门大学团队利用具有恒定光强的背景光，耦合具有不同于背景光波长，且能够灵敏响应目标物浓度变化的荧光信号，通过双色复合光颜色的变化发展了目标物的半定量可视检测新原理，并用于氧的快速简便检测，为其它与氧浓度变化有关的生化过程及其产物的分析建立了新的平台，结合显微技术可进行细胞体内代谢等生命过程研究的实时和动态检测(Angew. Chem. Int. Ed., 2008)，研究成果被Nature Materials和Nature Asia Materials作为亮点报道。使用包埋高浓度联吡啶钌的纳米硅球提高ECL强度，利用双色复合光混合显色原理，将随样品浓度变化的ECL强度变化信息转化为颜色变化信息，进一步发展了可视比色法电致化学发光（ECL）传感检测技术(Anal. Chem. 2009)。这些工作为基于仿生分子识别的成像分析新方法的建立积累了经验。 （5）重大疾病早期诊断新原理与新方法： 项目承担单位第四军医大学是长期从事恶性肿瘤和病毒性疾病基础和临床研究的国内优势单位，获得了相关疾病的多个重要标志物和蛋白质靶标，建立了靶向治疗载体平台技术与相关动物模型，成功研制了多种抗肿瘤疫苗与药物。在肝癌研究领域，成功克隆一组HBV相关基因，其中4个为国际上未见报道的新基因：（1）新基因URG11：该基因全长3074 bp，编码673 个氨基酸，定位在人类11号染色体（Neoplasia 2003）。近期不仅成功制备出该基因的单抗（Hybridoma 2006），并发现乙肝病毒X蛋白可下调E-Cadherin（Oncogene 2006），通过新基因URG11促进β-连接蛋白（β-catenin）的表达激活Wnt通路，促进肝癌发生（Hepatology 2006），该成果被Nat. Rev. Cancer 2007 作为DNA病毒的致癌机理进行评述。（2）新基因URG7：该基因全长745 bp，编码99个氨基酸的蛋白，定位在人类16号染色体，为新癌基因，可使细胞抵抗TNF杀伤(Hepatology 2001 )。此发现部分解释了乙肝感染的肝细胞可在体内长期生存并逃避机体免疫攻击的机理。（3）新基因URG4：该基因定位在人类7号染色体，全长3607 bp，编码104 KD的蛋白，为新癌基因（Neoplasia 2002）。近期研究发现，此基因可调控肿瘤细胞周期，促进肿瘤细胞生长（Neoplasia 2006）。（4）新基因HuSui1：此基因定位在人类17号染色体，全长1370 bp，编码113个氨基酸的蛋白（Oncogene 1999）。乙肝病毒对此基因的下调，将使乙肝感染的宿主肝细胞减低或失去对蛋白翻译的总监控作用，进而导致宿主细胞的恶性转化。（5）S15a：此分子全长535 bp，编码130个氨基酸的蛋白(Molecular Carcinogenesis 2004)。此基因可被乙肝病毒上调，参与肝癌发生。（6）VEGFR-3s：此分子定位在人类5号染色体，全长4765 bp，编码130 个氨基酸的蛋白(Hepatology 2007)。此基因可被乙肝病毒上调，参与肝癌发生，通过联合监测URG11、URG7、URG4、HuSui1、S15a和VEGFR-3s在肝硬化病人血清中的表达，可以提前3到5年预警肝硬化发生癌变 (Cancer Research 2004)。这些研究结果为实现癌症早期诊治提供了可能。 项目承担单位南京大学研究团队近期在肿瘤疾病诊断新方法研究方面取得了一批高水平的创新研究成果。在多通道、多标志物同时免疫检测方面取得突破，构建了5种多通道免疫检测新概念，发展了免疫分析新原理、新方法，被Science 316 (5825) (2007) 695-696引用，提出的无试剂免疫分析方法被Proc Natl Acad Sci USA 104 (4) (2007) 1401-1406应用；研制成10多种高效、快速、灵敏的免疫检测芯片，提出了2种、2种、4种和8种标志物同时安培与化学发光免疫检测的免疫芯片和自动化检测装置；提出了3种加速免疫反应的方法，使肿瘤标志物免疫检测的分析时间从近1小时降为3分钟，建立的化学发光免疫检测方法简便、快速、价廉、准确，适用于在线检测和临床诊断；利用RT-PCR技术建立了外周血中肿瘤细胞的高灵敏检测方法，可测定低至3个肿瘤细胞；提出了多肿瘤标志物基因的多点测定方法，阐明了2种癌症患者循环微转移的特性与过程，对开展相关恶性肿瘤的临床实验诊断具有指导意义，相关成果被Clin. Cancer Res.列为highlight论文，并被Nat. Rev. Cancer 2008, 8, 329引用2次。这些成果近5年在Anal. Chem., Adv. Funct. Mater., Clin. Cancer Res., Clin. Chem.等SCI刊物发表论文40多篇，其中>5.0刊物18篇。 项目承担单位福州大学研究团队开发了一系列电化学生物传感器，并成功地应用于慢性髓细胞白血病（CML）的BCR/ABL fusion gene的检测。尤其是采用了锁核酸（LNA）修饰的单链DNA作为捕获探针，该探针选择性地与目标DNA杂交，然后用电化学方法监测杂交反应，从而实现了DNA片段的检测。该方法具有极高的灵敏度（检测限达到9.4×10-13 M）和极佳的特异性，能灵敏地检测单错配DNA片段，为特异性电化学核酸探针的发展开拓了一条全新的道路。系列研究成果已经在Anal. Chem., Biosens. Bioelectron.等刊物发表。 总之，本项目给出的技术路线和研究思路充分考虑了原理与方法的可行性，既考虑了创新性和预期成果的水平，又充分考虑了已有工作的基础以保障研究目标的实现。因此，研究技术路线先进可行，已经具备了取得重大突破的条件。经过本项目的研究，可望在仿生分子识别体系的分子识别理论机制、仿生分子识别体系筛选方法学、新型癌症标志物的甄定、传感与成像新方法、癌症早期诊断与预警等仿生分子识别体系新原理、新方法等方面取得重大突破。 （五）课题设置： 本研究项目将以癌症早期诊断为总目标，围绕三个关键科学问题，发展仿生分子识别新体系及其相关检测原理与新方法。根据四个方面的主要研究内容与预期目标，设置五个课题： 课题1仿生分子识别体系识别机制的基础研究 经费比例：21.1% 承担单位：南京大学 课题负责人：鞠熀先 学术骨干：赵健伟、于俊生、张志洁 研究目标： 利用先进的研究方法和仪器，通过化学计算与分子模拟，研究仿生分子识别体系特别是分子印迹材料与核酸适体对目标分子的识别机制与构效关系，为仿生分子识别体系的构建、筛选和性能评估，以及新型仿生分子识别体系的开发提供理论指导。 研究内容： 1．利用现代波谱技术、单分子探针技术研究仿生分子识别体系（以核酸适体、分子印迹材料和纳米生物探针为主）分子识别过程中分子间弱相互作用的重要物理化学参数，如分子间键力常数、离解能、电荷分布和质子转移等；通过晶体结构分析及多维核磁共振研究分子识别体系的三维结构信