2010CB529500-先天性心脏病形成、发展和干预的基础研究 (2).doc

项目名称： 先天性心脏病形成、发展和干预的基础研究 首席科学家： 胡盛寿 中国医学科学院阜外心血管病医院 起止年限： 2010年1月-2014年8月 依托部门： 卫生部 一、研究内容 本课题拟解决的关键科学问题包括： 1.      什么样的环境因素会促进心脏间隔缺损和圆锥干畸形的发生，如果能甄别到这类环境因素，那么它是如何作用于遗传因素从而导致疾病的发生？ 2.      什么样的遗传因素对导致心脏间隔缺损和圆锥干畸形的发生，如果能甄别到这类易感基因位点或表观遗传学变化，那么它们是如何影响心脏的胚胎期发育从而导致畸形的最终形成？ 3.      什么样的生物标记物可以预测心脏间隔缺损或圆锥干畸形的发生，以及其疾病进展肺血管功能的变化？ 4.      未成熟心脏和肺脏和成熟心肺的超微结构和功能的差异在哪里，针对这些差异是否可以研发出新的肺灌注保护液和内源性的心肌保护措施？ 5.      先天性心脏病发展过程中心肌细胞增殖、凋亡、萎缩等现象在心室重构中起的作用以及相应调控机制如何？     如上所述，课题组从公共卫生学、基因和分子、临床研究三个层次对这几个有机联系的科学问题进行研究。现简述研究内容如下： 公共卫生学层次 1．完善胎儿早期超声诊断技术，建立基于孕妇人群且符合医学伦理的环境因素和遗传因素交互作用的前瞻性研究队列，通过出生缺陷监测医院能够快速早期发现怀有心脏间隔缺损和圆锥干畸形的病例，收集到多种类型的生物标本（如脐血、孕妇血液、尿液、胎盘等），利用代谢组学等技术，进行有效的环境因素和遗传因素研究。 2．在分析检测环境因素和遗传因素的基础数据上，采用系统生物学技术，多种分析模型进行探索和比较，识别出最佳的分析方法，效研究环境因素风险等级与遗传因素之间的相互作用程度，甄别出预测疾病发生的生物标记物。 基因和分子机制层次 1.  利用2个途径获得的疾病的宝贵的生物标本，利用最新的基因组学技术进行全基因组关联分析。由于所聚焦的疾病单一和所具备的网络齐全，为获得大量均质性的样本提供了保障，通过基因组平台的研究，最终为心脏间隔缺损和圆锥干畸形易感基因进行定位。 2.  利用前期获得的两个独特的涉及心内膜垫和瓣膜缺陷的斑马鱼突变体以及圆锥干畸形的小鼠模型，对畸形发生的发育学分子机制进行研究。去获知基因改变后胚胎期的心脏发育是通过何种信号途径逐步趋向畸形发生，从而为宫内干预手段提供理论依据。   临床研究层次 1.   对临床和动物标本中获得的组织和血液标本进行蛋白质组学分析，获知一系列未知的关于心脏疾病进展和肺血管功能的生物信息。从而最终确立若干生物标记物去预测疾病的预后和肺动脉高压的进展。 2.     利用乳猪等体外循环模型，结合实时微渗透、micor RNA谱等技术，对缺血再灌注损伤后未成熟心肺的结构和功能改变进行研究。对前期开发的肺保护液进行改良，对其在液态化通气中发挥作用的机制进行研究，并针对未成熟心肌特点制定新的内源性心肌保护策略。 3.      在心室重构逆转研究中，对临床获得的心肌组织标本进行细致的分析对其细胞增殖、micro RNA表达等进行研究，利用前期内源性磷脂信号分子的研究基础，对心肌细胞蛋白质合成、凋亡、肥厚等基本现象进行研究并提出新的生物治疗靶点，为有效修复心肌提出新的策略。   总之，我们拟围绕基础到临床再到公共卫生层面5个连环且交叉的科学问题就“心脏间隔缺损”和“圆锥干畸形”这二类最常见畸形的成因进行系统研究，并对先天性心脏病临床治疗密切相关的3个科学问题进行研究，从而促使出生缺陷防治向纵深方面发展。   二、预期目标  总体目标 本研究将通过在公共卫生、基因和分子机制和临床研究等三个层面上，紧紧围绕“先天性心脏病形成、发展和干预”这个命题，以我国最常见的2类心脏畸形(心脏间隔缺损和圆锥动脉干畸形)为突破口,针对畸形形成的环境和遗传因素、发育机制；以及和临床密切相关的肺血管功能异常生物标记物、未成熟心肺保护和疾病进展中心室重构和逆转等科学问题进行深入研究。拟在上述三个层面和八个方向上取得突破性学术成果（成果以国际高影响因子的SCI 期刊收录论文为标志）；同时结合目前我国实际，从研究结果出发发展一套适合临床和公共卫生政策制定需求的新的三级预防方案，在这个理论的指导下尝试新的治疗策略或可行的公共卫生政策，从而降低先心病发病率、提供预警指标和提高治疗疗效（成果以实施新卫生政策后地区先心病发病率变化的年度统计报告、国家发明专利、新药临床研究证书等为标志），最终为提高我国人口质量做出积极的贡献。 五年预期目标： 1. 在公共卫生研究层次，通过改善胎儿超声诊断技术来提高畸形检出率，通过出生缺陷监测网络获取大样本量流行病学数据和生物学标本，获知针对心脏间隔缺损和圆锥动脉干畸形形成明确的环境致畸因素，并在细胞和模式动物学水平说明其机制。利用多中心的合作，在发展先心病的临床数据库的基础上，建立国内最大的基于先心病病种的多源环境资源和生物资源标本库，为基因定位等研究提供标本，发现若干新的遗传位点。 2. 在基因和疾病形成分子机制上，利用临床资源和流行病学研究获得的生物标本，从易感基因定位和表观遗传学角度揭示心脏间隔缺损和圆锥干动脉畸形形成的分子遗传机制。在模式动物学水平，从心内膜祖细胞和心脏胶质发育缺陷的斑马鱼突变体和心脏神经脊细胞缺陷的小鼠突变体入手对畸形形成的发育机制进行研究，发现4-6个关键基因并鉴定其功能，为开发药物宫内干预胎儿心脏畸形形成提供靶点。 3．在临床研究层次上，紧扣“肺血管功能异常生物标记物”、“围手术期未成熟心肺保护”和“疾病进展中心室重构和逆转”三个和临床紧密结合的科学问题，利用医院临床资源、动物实验和分子生物学研究平台，从临床获得组织标本中获取相关2-3个可以有效判断肺血管预后的生物标记物；从大型动物体外循环模型中获得优化的肺灌注液配方和2-3种内源性心肌保护手段；从临床组织标本和大鼠动物模型上对在、未成熟心肌组织在心室重构等进行研究，开发若干基于细胞或基因治疗的新的生物治疗手段。 4.力争在五年时间内取得有影响力的研究成果，具体考核指标是在Nature、Science、Cell以及其姊妹期刊、Circulation、Circulation Research、Development等高影响力SCI 收录学术期刊发表学术论文4-6篇，在国际先心病领域较高影响力（以美国心胸外科协会会刊Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery 和英国心血管病协会会刊Heart的IF>3.0-3.5 为标志）学术期刊发表学术论文50-60 篇。国家发明专利、实用专利等受理或授权15 项左右。 5．以课题所在单位为人才培养基地，培养博士后20-25 名，培养博士生100-120 名，硕士生80-100 名。 三、研究方案 本课题的总体研究思路就是从前期工作基础和临床实践出发，选择二类常见先心病——“心脏间隔缺损”和“圆锥动脉干畸形”开展研究。在总体上我们从公共卫生学、基因和分子机制以及临床研究三个层次去设置了紧密联系、以临床疾病为主线的5个科学命题即“环境和遗传因素影响”、“易感基因定位和模式动物中心脏发育分子机制”、“疾病中肺血管功能异常生物标记物”“未成熟心肺保护”和“疾病进展中心室重构和逆转”。总体研究方案本着从基因到细胞，再到人类患者器官学水平，直至群体的公共卫生学层次；从斑马鱼等模式动物到大型动物模型（猪，犬等），到人类生物标本，去集中探讨环境-遗传-心脏发育异常之间的相互作用，通过揭示心脏畸形发育异常形成和进展的分子机制进而提出预防和治疗的新策略。 研究技术路线： 本研究的技术路线如上图所示。 我们将利用课题中包括的中国出生缺陷监测网和地方专业先天性心脏病监测网，结合多家大型先心病临床中心，收集流行病学资料和生物标本。标准化生物样本库和高质量研究队列的建立，将为畸形形成的环境和遗传因素研究提供材料。我们将利用高通量基因组学平台进行易感基因定位研究，利用系统生物学方法进行高危环境因素的甄别。 针对心脏间隔缺损和圆锥动脉干畸形，我们前期已经获得了较好的模式动物模型,包括心内膜垫缺损和瓣膜畸形的斑马鱼模型和心脏神经嵴细胞缺陷的小鼠模型等，我们将利用此模型进行深入的发育学机制研究。同时这些模式动物将用于流行病学研究中获知环境污染因素机制的研究。 在进行对畸形形成的病因学研究同时，课题组将对疾病形成后发展以及治疗中相关的两个主要课题开展研究。我们将使用新的技术（包括蛋白质组学，microRNA组学、微渗透技术等）对前期从临床中心获取的肺、心肌组织标本进行研究，从而寻找预测肺血管功能变化的生物标记物以及影响未成熟心肺损伤的主要环节。同时从microRNA变化和小分子溶血卵磷脂等改变，对未成熟心肌细胞在心室重构中作用进行研究。 四、年度计划 2010.1-2010.12 研究内容: 1一系列新的检验技术改良研究和关键实验技术和动物模型建立研究； 2 心脏间隔缺损发育形成中Lycat基因启动子研究 3 圆锥动脉干畸形遗传易感位点全基因组高密度SNP和CNV扫描； 4 心室肥厚和萎缩中微小RNA变化研究 研究目标: 1 一系列检验和实验关键技术的确立： 包括 胎儿超声技术改良（三维超声在胎儿先心病检查中应用）。新的流行病学采集工具的设计和生物标本采集新流程的确立。新的先心病易感基因互作模型的建立 低阻力膜肺的确立。构建溶血磷脂受体不同亚型基因的腺病毒重组体和其siRNA腺病毒重组体。 2一系列关键研究人群的入选和组织标本的获取：包括 1500份间隔缺损血液标本的收集和50份间隔缺损心脏样本的收集。 心脏圆锥动脉干畸形家系入选。同卵双生先天性心脏病患儿的入选 收集先天性心脏病肺动脉高压的肺组织样本(50例) 肥厚心室和萎缩心室等心脏组织标本的获取 肺灌注损伤组织标本的获取。 3. 一系列关键动物模型的建立： 包括 建立lycat转基因斑马鱼和小鼠 建立肺动脉高压和心室肥厚和萎缩的大鼠模型 4. 鉴别调节lycat基因表达的顺式作用元件；确定sco的mRNA和蛋白在斑马鱼心脏发育各阶段中表达情况。 5，筛选、定位心脏圆锥动脉干畸形的遗传易感基因位点，在鉴定出显著互作位点基础上，采用通径分析方法构建基因互作网络。 6筛选在心脏肥厚及心脏退化过程中特异性改变的miRNA，并对其改变进行验证。并对心脏肥厚及心脏退化过程中特异性改变的蛋白进行检测。 2011.1-2011.12 研究内容： 1. 心脏间隔缺损易感基因和表型关联性研究 2. 环境危险因子在模式生物的宫内胚胎体液环境和心脏组织中的分布和含量研究 3. 利用遗传和环境交互作用的系统生物学对圆锥动脉干畸形的基因互作网络分析研究 4. 分离Lycat相互作用蛋白和研究调节lycat的转录因子，揭示sco突变体心脏心胶质缺陷的分子基础 5. 肺动脉高压和正常肺组织差异蛋白质研究；心肺灌注损伤组织和正常肺和心肌组织差异micro RNA研究 6. 溶血磷脂受体亚型和溶血磷脂对心肌细胞生长调节研究；特异变化的miRNA基因片段转染心肌细胞及心脏成纤维细胞后表达研究 研究目标： 1. 完成双生子正常个体血液样本测序，分析间隔缺损致病因素；GWAS研究确定心脏间隔缺损候选基因 2. 明确关键环境污染物质（如苯）在胚胎心肌细胞的蓄积、转化规律及细胞毒性，明确导致心脏发育毒性的剂量-效应关系、作用的敏感期以及靶组织和靶细胞。 3. 建立基于圆锥动脉干畸形发生机制的生物信息学模型，提出以机制为基础的环境致畸因子暴露标志物、遗传易感标志物和效应标志物。 4. 获取研究 lycat和scotch tape基本实验材料， 并分析lycat和scotch tape在心脏内膜和心间隔发育分子机制。 5. 获得肺动脉高压相关差异蛋白质和肺灌注损伤相关microRNA 6. 确认溶血磷脂受体不同亚型在上述细胞生长中的作用；获得肥厚或萎缩miRNA特定表达细胞 2012.1-2012.12 研究内容： 1. 心脏间隔缺损流行病学调查资料的分析，以及2-3种高危环境因素的机制研究；胎儿超声早期诊断间隔缺损影像学标记的研究 2. 500: 500 PLaS-GWAS中心脏间隔缺损易感基因分型研究 3. 圆锥干畸形环境因素致畸的信号通路以及圆锥动脉干畸形的遗传易感标记物和效应标志物在临床大样本群体中验证研究 4. 肺动脉高压预测蛋白生物标记物在血液和临床预警中作用研究 5. 微渗透技术对心肌灌注损伤中内源性神经递质研究 6. 细胞凋亡和存活通路中磷脂分子生长双向调节的作用关键位点研究，几种关键micro RNA中其前体和抑制剂的研究 研究目标： 1. 心脏间隔缺损高危环境因素的甄别和早期预警疾病发生胎儿超声影像学标记的确认 2. 心脏间隔间隔缺损易感基因的确认 3. 筛选鉴定与圆锥干畸形密切相关的miRNA的靶向分子，阐明心脏致畸因子导致DNA甲基化和/或组蛋白修饰改变对靶基因表达调控的影响。 4. 确定若干预警肺动脉高压形成血液生物标记物。 5. 未成熟心肌再灌注损伤过程中神经递质变化规律和新的保护液灌注策略确立 6. 溶血磷脂分子和microRNA对心肌细胞生长调控信号传导机制的确立 2013.1-2013.12 研究内容： 1. 心脏间隔缺损形成易感基因的确立，以及环境和遗传因素交互作用的统计模型研究 2. Lycat和sco在心脏间隔缺损中基因和蛋白功能研究，以及其在人类心脏中表达研究 3. 圆锥动脉干畸形致畸因子作用的靶基因的结构以及表观遗传修饰变化对心脏神经嵴细胞发育及分化的影响机制研究。 4. 前瞻性大样本研究中检测相关生物标志物在圆锥动脉干畸形手术前后的变化，评价相关生物标志物在圆锥动脉干畸形手术预后预测中的作用和意义。 5. 预测肺动脉高压生物标记物的机制研究 6. 心肺灌注损伤组织差异表达microRNA所参与调节的靶蛋白与心肺组织发育和损伤相关重要蛋白研究 7. 心室重构的早期和晚期，溶血磷脂酸受体不同亚型对心肌肥厚、凋亡和纤维化以及心功能的影响。相关关键miRNA的靶点蛋白和相应蛋白的RNAi抑制其他蛋白通路研究 研究目标： 1. 获知心脏间隔缺损的易感基因，完成其特征描述并并在临床和流行病学样本中验证。 2. lycat和scotch tape在心脏内膜和心间隔发育分子机制的确认 3. 明确圆锥干畸形形成中信号转导通路和蛋白质相互作用，在基因水平阐明它们在突变或异常修饰后转录产物的变化机理。 4. 确认若干评价圆锥干畸形发生和外科治疗的代谢或蛋白水平的生物标记物 5. 在模式动物水平确认蛋白质生物标志物在先心病肺动脉高压发生分子机制中所起的作用，以及其在肺动脉高压信号转导、增殖和凋亡等途径中的意义。 6. 利用针对差异microRNA和蛋白质设计新的心肺保护液配方 7. 在整体动物水平验证溶血磷脂酸受体不同亚型在心室重构不同阶段是否扮演着保护心脏和加重心肌损伤的双重角色以及microRNA调控相关蛋白，并对心肌细胞和心脏成纤维细胞的功能产生影响 2014.1-2014.8 研究内容： 1． 新的环境危险因素控制和干预策略在公共卫生学水平的有效性研究 2. 间隔缺损发育关键基因在正常和病理人类心脏的表达和突变研究 3. 新的基因芯片预测间隔缺损和圆锥动脉干畸形的流行病学研究 4. 生物标记物预测肺动脉高压进展的临床研究 5. 新的肺灌注液、内源心肌保护和心室修复手段的应用研究 6. 一系列研究的补充实验和汇总 研究目标： 1 确认评价国人心脏间隔缺损和圆锥动脉干畸形的高危人群筛检及风险评估模型，提出早期诊断以及环境干预策略。并结合研究结果，配合当地卫生行政部门提出干预措施，建立预测和预警机制。 2. 完成lycat和scotch tape在心脏内膜和心间隔发育分子机制研究并将其在临床中得以验证， 3. 通过流行病学研究，验证新的基因芯片对于间隔缺损和圆锥动脉干畸形的可行性。 4. 通过临床前瞻性研究，确认新的生物标记物在临床上预测肺动脉高压的可行性 5. 在大型动物上验证新的心肺保护策略和心室修复micro RNA和磷脂分子相关生物治疗的有效性