973 2012 重大心血管病相关GPCR新药物靶点的基础研究 (2).doc

项目名称： 重大心血管疾病相关GPCR新药物靶点的基础研究 首席科学家： 肖瑞平 北京大学 起止年限： 2012.1-2016.8 依托部门： 教育部 一、关键科学问题及研究内容 本项目拟解决的关键科学问题如下： 1） 发现冠心病相关的新GPCR和已知GPCR的新功能、新机制及信号分子：系统地研究在冠心病发生发展过程中GPCR及其下游信号转导分子的病理生理功能，确定关键GPCR和信号分子； 2） 发现安全有效的治疗靶点：通过对重要GPCR及其信号转导网络的研究，阐明其致病/保护机制，寻找和确定选择性激活/抑制其信号转导的配体，从而发现有效且特异的治疗靶点； 3） 阐明结构与功能的关系：解析关键GPCR的结构，寻找功能选择性配体，阐明结构、配体与不同功能状态之间的关系。 总之，本项目通过解决上述科学问题，拓展丰富GPCR受体理论，同时从功能、结构和配体等各个角度评估关键GPCR及其下游信号分子作为治疗靶点的可行性，为以GPCR为靶点的原创药物研究提供理论依据。 围绕上述关键问题，我们拟采用转化医学的策略，利用分子遗传学、细胞生物学、结构生物学、生物信息学、生物物理学、药物基因组学、高通量配体筛选等现代生物技术以及适用的动物模型，研究、发现冠心病发生、发展中具有重要作用的GPCR及其信号转导分子，分析其结构和功能，以之为靶点开发高效的新筛选技术，设计、合成、优化新配体，并进一步通过临床资源及动物模型验证、评估这些潜在药物作用靶点的安全性和有效性，为创新药物研发及个体化医疗提供新思路。 具体拟开展的研究内容如下： 1. 利用动物模型及临床资料，系统地研究不同病程阶段中具有重要作用的GPCR，深入研究其信号转导网络，尤其是功能选择性信号转导，发现保护性和/或损伤性通路，并阐明其分子机制； 2. 评估甲酰肽受体FPR1~2、蛋白酶激活受体PAR-1~4、CRLR以及β2AR下游信号分子等作为治疗靶点的可行性； 3. 建立配体筛选的新技术、新方法，设计、合成、优化冠心病关键GPCR，如β2AR、FPR、PAR、P2Y12及CGRP等的功能选择性新配体； 4. 解析血管紧张素II受体1（AT1）、二磷酸腺苷受体P2Y12等心血管生理和病理关键GPCR的晶体结构，研究结构与功能的关系。 二、预期目标 １．总体目标 我们计划以高起点、重基础、集智慧、攻难题的策略，联合国内心血管相关GPCR领域的高水平研究队伍，从基础研究、药靶发现、配体设计与合成、药物筛选、临床前评估、临床以及系统生物学等多个角度，以转化医学为导向，阐述冠心病相关GPCR在疾病发生、发展过程中的重要生物学功能及其分子机制，发现疾病治疗的新靶点并阐述其可行性，解析重要GPCR的结构，筛选得到关键GPCR的配体，建立心血管疾病药物靶点筛选平台，为针对重大心血管疾病的药物开发和治疗提供理论依据和导向。通过五年努力，使我国在冠心病发生、发展相关GPCR及其分子机制的研究达到和保持世界先进水平的目标、在选择性信号转导、蛋白晶体结构及配体筛选新技术、新方法等领域取得突破性进展。同时，培养和造就一批高层次的研究人才， 形成4-6个在相关领域有国际影响的研究团队，形成可持续创新的核心力量。 ２．五年预期目标 - 发现一系列与冠心病等发生发展密切相关的新GPCR和已知GPCR的新功能，并阐明分子机制； - 建立疾病模型和GPCR基因工程动物模型10-15种；利用在体和离体模型及临床样本，评估5-10个关键GPCR作为治疗靶点的安全性和有效性； - 建立高内涵高通量的新方法、新技术，并采用该方法筛选具有自主知识产权的GPCR新配体； - 解析1-3个关键GPCR的三维晶体结构，明确其结构功能相关性； - 高水平的SCI原创科学论文，发表影响因子大于5的科研论文50-80篇，申报具有自主知识产权的国际和国家发明专利 8项以上； - 培养若干个国家杰出青年基金人才，培养硕士生50名、博士生80名、博士后20名。 预期通过本项目的开展，建立我国从功能、机制、结构到配体，从细胞、动物模型到临床的“一条龙”GPCR药物靶点研究体系，在心血管疾病相关GPCR研究领域取得重要原创性研究成果，培养和造就一批高层次的研究人才，形成可持续创新的核心力量。 三、研究方案 本项目拟以冠心病治疗药物新靶点研究为主线，以GPCR为核心，研究其信号转导机制，阐明其在疾病发生发展过程中的作用及其机制，发现影响疾病发生发展的关键信号分子和环节，探讨其作为药物治疗靶标的可行性，为药物研发提供新思路。 为达到研究目标，解决关键科学问题，我们设计的技术路线如下图。我们团队将以集体的力量，从分子到整体，从结构到功能，从基础到临床，并通过实验、临床与计算模拟相结合的方式，围绕冠心病的发生、发展与治疗，以GPCR为核心，尝试建立疾病相关GPCR及其信号传导网络。具体来说，我们从临床、疾病模型入手，利用分子信号通路、群体遗传学、组学等研究手段，寻找和研究与疾病发生发展密切相关的GPCR及其下游信号分子，同时解析其晶体结构，设计、合成并筛选其配体，然后利用动物模型和临床资源进行验证。由此综合评估该受体作为治疗靶标的可行性，为新的治疗策略提供理论依据。 1．创新点及特色：本项目根据国家的重大需求，结合我国在心血管重大疾病的基础和转化医学的研究特色和优势，针对可能获得突破的关键科学问题而提出。其创新性主要体现在： 1) 发现更安全有效的冠心病治疗新靶点：GPCR既是生命科学研究的前沿和热点，也是目前最大的一类药物靶标。随着研究的深入，新的受体、新的通路、新的机制不断被发现，这一受体超家族具有进一步挖掘的巨大潜力。但目前我国尚无一个以GPCR为作用靶点的药物。本项目旨在发现具有自主知识产权的冠心病治疗相关的GPCR新靶点，并为相关创新药物的研发提供理论依据，填补我国在这一领域的空白。 2) 研究冠心病相关GPCR结构与功能的关系：GPCR蛋白结构解析一直是科学研究领域的一大难题，本项目将研究与心血管系统关键GPCR，如AT1、P2Y12等的结构与其生物功能之间的关联，将为基础研究和药物研发提供基础信息。 3) 建立具有自主知识产权的新技术：本项目以技术创新为目标，在新技术新方法的研究开发同时，密切结合理论研究，保证其新颖性、原创性和高效性。开发多种有自主知识产权的新技术、新工具如心脏薄片和活体实时检测技术、配体高通量筛选技术、各种转基因小鼠模型和灵长类动物模型等。 4) 冠心病相关GPCR的群体遗传学与药物基因组学研究：本项目将在多个大样本临床资源基础上，结合候选基因策略和深度测序策略，开展遗传学与药物基因组学研究，明确中国人群中重要GPCR通路基因的遗传多态性与冠心病的易感性及用药个体差异的关系，为建立重大心血管疾病的个体化医疗提供理论依据。 2、课题设置: 课题1：GPCR介导的血管炎症和损伤 研究目标：血管内皮细胞受到炎症性损伤引起冠状动脉狭窄和栓塞，是冠心病的主要起因。单一或同类GPCR在血管炎症损伤中的作用时有报道，但目前对血管损伤过程中相关细胞GPCR在冠心病发生发展中的相互作用网络还缺乏认识。鉴此，本课题提出GPCR在冠心病中的作用为渐进地、系统地推进病理过程这一理论，拟通过实验方法验证多种GPCR在血管炎症病变中活化炎症细胞、血小板和内皮细胞的作用以及调控这些细胞相互作用的网络，在细胞、器官和整体动物三个不同的水平上揭示冠心病发病早期血管炎症病变的分子基础和GPCR在这一过程中的主导作用，从而发现可成为血管炎症病变药物预防和治疗靶点的GPCR和选择性下游信号通路。 研究内容： 1. 采用功能基因组学方法测定蛋白酶激活受体PAR，溶血磷脂酸受体LPAR等GPCR通过转录因子调控引起的内皮细胞基因表达图谱变化。通过系统研究GPCR连接转录因子活化的机制，寻找相关靶点，发现阻断血管内皮细胞损伤和炎症发展的新药靶。 2. 研究GPCR介导的活性氧产生过程和重要调控机制，发现激活白细胞和内皮细胞活性氧产生的信号转导通路，以及两种细胞相互作用的模式。利用自主研发的动物模型，复制人类血管炎性疾病中活性氧如超氧阴离子对血管壁造成的损伤；通过发现内在的白细胞-内皮细胞相互反馈机制，寻找可能的GPCR药物作用新靶点并以此阻断活性氧对内皮细胞损伤所引起的微血栓形成、白细胞浸润、血管平滑肌增生、脂肪堆积、血管变窄等冠心病相关病理变化。 3. 运用分子细胞生物学技术和蛋白质组学技术，研究血小板GPCR如血小板活化因子受体(PAFR)、二磷酸腺苷受体(P2Y1和P2Y12)等介导和调控的血小板活化，以及血小板与内皮细胞和白细胞相互作用的分子机制；对血小板释放的GPCR配体在血管慢性炎症导致的动脉粥样硬化，以及血管急性损伤导致的血栓事件如冠心病和心肌梗塞中的作用及其机制展开研究；对血小板GPCR在血管炎性损伤的修复过程中对内皮祖细胞(EPC)的招募作用及其机制开展研究，并构建相应的药物筛选平台；鉴定血小板表面孤儿受体，研究其在冠心病发生发展中的作用及其机制。 课题承担单位：上海交通大学 课题负责人：刘俊岭 学术骨干： 叶德全，奚晓东，周虎臣 经费分配比例：16％ 课题2：内源性血管活性物质及其GPCR在动脉粥样硬化中的作用 研究目标： 动脉粥样硬化的发生发展以血管细胞和炎症细胞的激活，分化，迁移，增殖，凋亡为共同特征。在此过程中，多种趋化因子通过和相应GPCR受体结合，影响血管细胞和炎症细胞的趋化迁移，促进新生内膜的形成，从而介导了动脉粥样硬化的发生发展。另一方面，多种内源性血管活性多肽又对心血管系统有着广泛的调节和保护作用。因此，本研究将以我们自主发现的新趋化因子及心血管调节功能强大的CGRP家族成员为切入点，揭示其对血管细胞和炎症细胞生物学活性及动脉粥样硬化等血管病变中的作用；确认内源性血管活性物质与相应受体/受体调节蛋白的结合位点及下游信号传导途径，为发现血管疾病新的防治靶点提供依据。 研究内容： 1. 通过筛选和鉴定，阐明受体活性修饰蛋白RAMP1/2/3如何通过影响CGRP家族成员的受体CRLR，调节配体的不同的血管生物学保护作用。 2. 明确CGRP超家族的不同成员及其活性片段与血管相应受体/受体复合物结合的关键功能位点及主要下游信号转导通路，阐明CGRP超家族的不同成员通过结合相应的受体/受体复合物，对血管细胞和免疫炎症细胞生物学功能（增殖，迁移，分化和炎症等）的影响；阐明在以动脉粥样硬化性疾病模式动物为主的血管重塑中的保护作用机制。 3. 利用趋化因子筛选平台继续筛选原始创新的趋化因子，明确新趋化因子相互作用的受体和结合的关键功能位点，及主要下游信号转导通路； 阐明新趋化因子及其受体对血管细胞和免疫炎症细胞生物学功能的影响。 课题承担单位：北京大学 课题负责人：孔 炜 学术骨干：徐 萍，王 应，徐明江 经费分配比例：15％ 课题3：肾上腺素受体功能选择性信号转导与心力衰竭治疗 研究目标： 功能选择性信号转导是当今GPCR研究领域的一大热点。在前期研究基础上，本课题拟通过进一步的研究肾上腺素受体在心力衰竭发生发展过程中的作用，阐明功能选择性信号转导发生的机制，不同信号转导通路之间的相互作用及其机制，由此发现更安全有效的心力衰竭治疗靶点和自主知识产权的创新药物。 研究内容： 1. 基于肾上腺素受体选择性信号转导的研究基础，利用心肌细胞，以及急性心梗及慢性心力衰竭大小动物模型，确定Gs通路选择性β2AR激动剂的心肌保护作用及其机理； 2. 深入研究非G蛋白依赖的β肾上腺素受体在心力衰竭发生发展过程中的变化，阐明这一功信号转导通路在心力衰竭治疗中的潜在意义和应用前景；在此基础上，设计及筛选出具有功能选择性的β2AR的配体，全面评估其作为治疗靶点的安全性、有效性和特异性； 3. 建立从小鼠到灵长类动物的冠心病及心力衰竭等疾病模型，用于课题5所发现新配体的鉴定，同时通过高通量测序及基因芯片等技术研究疾病不同阶段GPCR及其信号分子的变化，发现新的疾病相关蛋白分子并研究其作用机制。 课题承担单位：北京大学，中国石油大学（华东） 课题负责人：肖瑞平 学术骨干：王 珏，黄 方 经费分配比例：20％ 课题4：冠心病相关GPCR的群体遗传学与药物基因组学研究 研究目标：首先利用新技术对重要的GPCR基因进行重测序，在确定中国人基因多态性的基础上研究其与中国人高血压、冠心病和心力衰竭发病的关系；寻找与GPCR药物治疗预后密切相关的基因多态性，建立基于药理遗传学指导临床用药和预后评估个性化医疗的新算法。进一步通过机制研究，阐明重要GPCR基因多态性影响高血压、冠心病和心力衰竭发病易感性的分子机制。同时通过生物信息学数据整合分析和分子生物学验证，获取全面、可靠的GPCR基因型与上述重大心血管疾病表型关系数据，并在此基础上开展基于候选基因策略和深度测序策略的药物基因组学研究，为基于基因型-表型关系的个体化用药提供基础。 研究内容： 1. 开发1-2套生物信息学数据整合算法，系统整合和分析现有重大心血管疾病的遗传学研究数据(包括候选基因遗传关联分析和全基因组关联分析)和功能基因组学研究成果，获取全面的GPCR基因型与重大心血管疾病表型关系数据集合。 2. 在上述研究基础上，结合本课题其他研究组鉴定的心血管相关GPCR基因，采用课题组已有的大样本高血压、冠心病、心力衰竭病人人群资料和临床样本，针对中国人群，开展心血管疾病相关重要的GPCR基因及其相关调控因子的基因型-临床疾病表型遗传关联研究。 3. 针对上述重大心血管疾病易感基因集合，对重要的GPCR基因多态性与以此GPCR为药靶的临床药物，结合临床药效与副作用数据，开展基于候选基因的药物基因组学研究，鉴定重要GPCR基因突变(如βAR、AT1等)影响中国人高血压、冠心病和心力衰竭治疗中的药效与毒副作用差异；同时在全基因组范围内开展基于新一代靶向测序技术的药物基因组学研究，从头筛选并验证与中国人心血管疾病用药差别密切相关的基因多态性。在此基础上，开发基于GPCR及相关基因多态性指导临床用药和预后评估的药物基因组学预测系统，为建立重大心血管疾病的个体化医疗提供依据。 课题承担单位：华中科技大学同济医学院，北京大学 课题负责人：汪道文 学术骨干：李川昀，赵春霞，郭小梅，丁 虎 经费分配比例：15％ 课题5：冠心病关键GPCR的结构及功能相关性研究 研究目标： 通过建立和发展GPCR晶体结构测定技术平台，解析与冠心病相关的重要GPCR蛋白质的三维晶体结构，为相关的功能研究提供结构信息，为配体筛选及先导化合物的设计提供结构依据，为其他子课题进行GPCR功能研究提供技术支持。 研究内容： 1. 测定关键GPCR三维结构。应用膜蛋白样品稳定性的测试方法、膜蛋白脂立方相结晶技术、高通量膜蛋白结晶条件筛选技术以及受体配体结合活性测试等方法，测定与心血管疾病密切相关的重要GPCR，如AT1、P2Y12等的三维结构。根据目标GPCR的氨基酸序列特点，对基因进行改造以提高蛋白稳定性；结合亲和力强的小分子或多肽配体，利用内容1中的GPCR结构生物学技术平台，对目标GPCR蛋白进行表达、纯化、稳定性测试、结晶；得到高质量的蛋白晶体，收集X射线衍射数据，并解析其三维晶体结构。 2. 基于目标GPCR的三维结构的配体设计和复合物晶体结构测定。与课题5合作设计并筛选新配体；测定目标GPCR与新配体复合物的晶体结构，为配体的结构优化提供进一步的结构依据；与课题1-3合作研究结构与不同功能状态的关系。 3. 根据现有GPCR的配体(激动剂和拮抗剂等)结构与活性的关系建立药效团模型，基于药效团模型筛选研究GPCR的新配体，进行活性筛选和结构优化，获得特异性配体，为GPCR功能研究提高良好的探针分；同时运用所获得的新配体稳定蛋白质的结构，协助晶体解构。 课题承担单位：中国科学院上海药物研究所 课题负责人：吴蓓丽 学术骨干： 柳 红，阳怀宇 经费分配比例：18％ 课题6：冠心病关键GPCR的配体设计、合成与筛选 研究目标：针对不同GPCR靶点，设计和发展基于实时精细构象变化原理的新的高通量/深度功能分析的药物筛选方法；采用生物信息学的方法建立GPCR和不同小分子相互作用的模型；设计，合成并建立小分子化合物库， 筛选出可以特异作用于不同GPCR的激动剂和拮抗剂；研究相关GPCR受体功能及其作用机制。 研究内容： 建立心血管疾病相关的GPCR的高通量/高内涵筛选模型：针对研究靶标建立高敏高效的细胞水平的高通量筛选平台，快速筛选所建立的化合物库，以获得针对心血管疾病的关键靶标的活性分子。 1. 采用钙离子浓度检测、cAMP浓度检测、报告基因检测、GTPgS结合、受配体结合、受体转位、β抑制蛋白转位、MAPK活化、细胞毒性等方法对现有的化合物库进行筛选，全面评价新型配体的活性及可能存在的毒性，初步筛选出其中具有激动剂或拮抗剂活性的候选小分子化合物。 2. 构建细胞水平基于BRET和FRET方法的检测受体细微构象变化的新的的筛选方法：在转染的细胞中，用BRET检测小分子和受体作用后对β抑制蛋白募集的影响；通过TR-FRET的方法来观察候选配体分子对膜表面GPCR自身二聚化和多聚化所产生的影响；以及在原代细胞表达待筛选GPCR，建立基于单细胞膜片钳电生理和荧光共聚焦显微成像的实时-高分辨率检测方法。 3. 采用上述方法进一步进行高通量/深度功能分析的目标GPCR配体的筛选，尤其是功能选择性配体，研究内源性配体发生机制及其与新药物配体的功能差异。 课题承担单位：北京大学，华中科技大学 课题负责人：周 专 学术骨干：刘剑峰，蒋新农，易平 经费分配比例：16％ 3、课题之间的相互关系 整个项目按照病程发展和药靶发现两条线索交叉展开。首先以冠心病的发生发展为线索，系统研究病程不同阶段中具有重要病理生理功能的GPCR。其次，遵从药物靶标发现与验证的研究思路，从基础研究开始发现潜在靶标，通过解析其蛋白结构，指导设计并合成配体，利用各种动物模型及临床资料验证与评估其作为药靶的可行性。所设置的6个课题拟采用不同的研究方法、在不同层次、在不同病理生理过程中最大限度地发现与鉴定疾病相关GPCR及其信号分子，为新药研发提供新思路。 发现冠心病相关GPCR及其信号分子是本课题的基础，课题1-3是分别从病程发展的不同阶段入手开展研究工作。急性血管损伤造成血管壁的破坏、血栓形成等变化，目前被公认为许多主要心血管疾病如动脉粥样硬化的前奏。动脉粥样硬化是一种慢性血管炎症性疾病，早期表现为脂质的沉积及炎性细胞的粘附和浸润，逐渐发展到粥样斑块的形成，影响到冠状血管即为冠心病，疾病发展到一定程度，心脏功能失代偿即表现为心力衰竭。三个课题以疾病的早、中、晚三个阶段对其中GPCR及其信号转导网络进行研究，相互补充、相互印证，以期更全面、更准确地评估其作为药物靶点的可行性。 在课题1-3的基础上，通过课题4-6从蛋白结构、配体及临床角度对关键GPCR进行进一步研究，评估其作为药靶的安全性和有效性。课题4选择与冠心病密切相关的GPCR开展蛋白结构研究，为课题5的配体设计及将来的先导化合物设计提供必要信息，同时也有助于进一步理解受体及其配体相互作用的分子机制。在此基础上，利用课题5所建立的各种配体高通量筛选技术及合成的小分子化合物库，筛选关键GPCR，尤其是孤儿受体的配体，既可用于相关GPCR的生物学功能研究，也可用于干预实验，以检验相应蛋白作为药物靶点的可行性。 课题6主要利用临床资源，开展群体遗传学及药物基因组学研究，通过相关GPCR的遗传多态性与药物反应个体差异的关联研究，验证课题1-3所发现的关键GPCR作为药物靶点的可行性，并为GPCR相关的个体化医疗提供了理论依据。 总之，所设置的6个课题密切联系，以转化医学为导向，寻找和鉴定重大心血管疾病相关重要GPCR及其信号分子；通过细胞模型、动物模型、计算机模拟、蛋白质结构生物学，结合临床，分析这些关键GPCR分子的结构和功能，发掘新药物靶点；并通过配体设计与化学合成、高通量配体筛选以及基于小动物、大动物、非人灵长类动物模型的临床前评估，最终为针对冠心病的GPCR药物开发提供理论依据与研发导向。 四、年度计划 研究内容 预期目标 第 一 年 PAR1等GPCR活化引起的血管内皮细胞基因表达调控模式。 GPCR介导和调控的血小板活化以及血小板与内皮细胞和白细胞相互作用的分子机制研究。 明确CGRP家族成员及其受体相关蛋白的表达情况，并利用化学合成的CGRP家族肽，研究对改善动脉粥样硬化发病的高危因素和斑块进展的作用 表达、纯化新发现的人趋化因子蛋白；制备其多克隆及单克隆抗体，在细胞、动物模型及临床样本多个层面研究其生物学功能； 利用细胞及动物模型对Gs通路选择性β2AR激动剂的心脏保护作用进行研究，并探讨其中的机理; 克隆相关GPCR及其配体的基因，建立相关GPCR的过量表达系统及纯化方法， 并对其进行荧光标记，开展受体与配体的相互作用研究。 完善冠心病、高血压和心力衰竭人群样本量和数据库；进行GPCR基因及相关信号基因深度测序，确定中国人基因变异及其频率； 采用钙离子浓度检测、cAMP浓度检测、报告基因检测、GTPgS结合、受配体结合、受体转位、β抑制蛋白转位、MAPK活化、细胞毒性等方法对化合物库进行筛选； 构建AT1、P2Y12等GPCR蛋白的表达载体, 利用昆虫细胞表达系统进行蛋白表达，并摸索表达条件; 根据蛋白性质筛选配体。 4. 寻找若干与内皮炎症相关的治疗靶点，发现阻断炎症发展和内皮细胞损伤的新药靶；阐明GPCR调控内皮细胞和炎症细胞活性氧产生的分子机理。 5. 阐明CGRP超家族的不同成员对以动脉粥样硬化性疾病模式动物为主的血管重塑中的保护作用； 6. 确定新发现的人趋化因子表达及功能表型与动脉粥样硬化发生发展的相关性并申请专利； 7. 在小动物离体和在体模型中，确定Gs通路选择性β2AR激动剂的心肌保护作用，并确定其中的机制； 8. 克隆得到2-3种GPCR及其配基的基因，建立受体与配体的高效表达，初步揭示GPCR及其配体相互作用的机理。 9. 明确中国人群20个左右GPCR基因及相关信号基因的遗传多态性及其频率； 10. 高量表达AT1、P2Y12等GPCR蛋白,筛选出可稳定受体分子的配体。 11. 评价新型配体的活性，初步筛选出具有激动剂或拮抗剂活性的候选小分子化合物。 第 二 年 运用分子细胞生物学技术和蛋白质组学技术，系统研究炎症细胞、血小板、血管内皮细胞参与血管炎症过程中的信号调控网络。 研究不同受体活化修饰蛋白（RAMPs）在动脉粥样硬化发生发展中的不同作用，阐明不同RAMP与CGRP家族成员的受体CRLR结合后产生的受体后信号和生物学功能的异同。 利用动脉粥样硬化的动物模型探索新发现的人趋化因子对动脉粥样硬化发生发展的体内调控作用；探索新发现的人趋化因子作用的受体。 利用大动物急性心梗及慢性心力衰竭模型，利用他们对Gs通路选择性β2AR激动剂的心脏保护作用进行研究，并探讨其中的机理。并利用建立的心力衰竭模型，深入研究非G蛋白依赖的β肾上腺素受体信号转导在心力衰竭发生发展过程中的变化。 利用荧光共振能量转移和荧光相关光谱技术对GPCR受体蛋白在细胞膜和模拟细胞膜上的寡聚化行为进行研究，分别测定寡聚化行为的动力学和热力学参数，研究配体蛋白对GPCR受体蛋白寡聚化行为的影响，探讨调控GPCR寡聚化的可行性。 开展中国人群GPCR基因及其相关信号基因多态性与心血管疾病的大样本遗传关联研究； 开展β1和β2AR、AT1基因态性与药物疗效和副作用关系的药物遗传学研究； 完成对现有候选基因遗传关联分析和全基因组关联分析的整合，获取全面的GPCR基因型与重大心血管疾病表型关系数据集合。 根据蛋白稳定性，对表达载体进行优化，扩大蛋白表达规模，对蛋白纯化条件进行优化。 针对不同GPCR靶点，设计和发展基于实时精细构象变化原理的新的高通量/深度功能分析的药物筛选方法。 1. 通过发现内在的白细胞、血小板和内皮细胞相互作用反馈机制，寻找到可能的药物作用新靶点。 2. 阐明CGRP超家族的不同成员通过结合相应的受体/受体复合物，对血管细胞和免疫炎症细胞生物学功能（增殖，迁移，分化和炎症等）的影响； 3. 体内确定新发现的人趋化因子对动脉粥样硬化发生发展的调控作用。 4. 在大动物模型中，进一步确定Gs通路选择性β2AR激动剂的心肌保护作用。同时确认非G蛋白依赖的β肾上腺素受体在心力衰竭发生发展过程中的变化，发现新的信号分子以及已知信号分子的新功能； 5. 获得GPCR受体蛋白在细胞膜上的寡聚化动力学和热力学参数，为GPCR在细胞膜上的寡聚化行为提供直接证据。 6. 揭示调控GPCR寡聚化的可行性并建立调控方法； 7. 完成10-20个心血管疾病相关重要的GPCR基因及其相关调控因子的基因型-临床疾病表型遗传关联分析； 8. 阐明β1和β2AR、AT1基因态性与AT1阻断剂、ACE抑制剂及β受体阻断剂治疗效果及副作用的关系 9. 完成对现有候选基因遗传关联分析和全基因组关联分析的整合，获取全面的GPCR基因型与重大心血管疾病表型关系数据集合，建立相关数据库系统和在线查询系统。 10. 获得高纯度、高稳定性的蛋白质样品。 11. 建立心血管疾病相关的GPCR的高通量/高内涵筛选模型以及功能选择性配体筛选。 第 三 年 对GPCR在血管炎性损伤的修复过程，尤其是对内皮祖细胞(EPC)的招募作用及其机制展开研究。 构建血管炎症相关GPCR药物筛选细胞系和建立相应快捷检测方法。 研究CGRP家族肽与不同RAMP结合的结构基础，分析其配体受体亲和力不同的分子生物学基础；系统研究新发现的人趋化因子的相互作用受体，及其下游信号传导途径；构建新发现的人趋化因子或/和其相互作用受体的转基因或/和基因敲除鼠。 设计及筛选出具有功能选择性的β2AR的配体，并且评估其作为治疗靶点的安全性、有效性和特异性。 合成高亮度无镉量子点，并标记GPCR受体蛋白，研究GPCR受体蛋白在细胞膜和模拟生物膜上的运动方式及动力学过程。 随访病人，研究特定基因多态性与疾病进展和预后关系、根据重要的变异位点制备转基因模型，深入研究2-3个重要基因多态性与临床表型的关系，研究药效学； 筛选蛋白质结晶条件，对初始结晶条件进行细致优化，收集晶体衍射数据，并进行结构解析。 采用生物信息学的方法建立GPCR和不同小分子相互作用的模型。 1. 发现参与血管损伤修复的关键GPCR。 2. 筛选治疗血管炎症的小分子先导化合物。 3. 明确CGRP超家族的不同成员及其活性片段与血管相应受体/受体复合物结合的关键功能位点及主要下游信号转导通路， 4. 阐明新发现的人趋化因子的相互作用受体；申请专利。 5. 设计并筛选出具有功能选择性的β2AR的配体，确定其作用靶点的安全性、有效性和特异性。 6. 建立研究GPCR在细胞膜和模拟生物膜上运动的新方法。 7. 确定几个主要GPCR基因及其相关信号基因多态性与中国人冠心病、高血压和心力衰竭、与疾病预后关系 8. 获得高质量蛋白晶体，解析高分辨率晶体结构。 9. 构建细胞水平基于BRET和FRET方法的检测受体细微构象变化的新筛选方法 第 四 年 对血小板释放的GPCR配体在血管慢性炎症导致的动脉粥样硬化，以及血管急性损伤导致的血栓事件如心肌梗塞中的作用。 自主研发动物模型，复制人类感染及非感染炎性疾病中活性氧如超氧阴离子对血管壁造成的损伤。 获得组织特异RAMP敲除与apoE-/-或者LDL受体双敲的小鼠，在整体模型中观察各种RAMP对敲除后对动脉粥样硬化斑块的影响。 根据上述对CGRP家族太以及其受体结构序列的分析，设计相应的小肽或者化合物，用来替代内源性肽，激动或者阻断相应的受体信号，最终得到2~3种特异的激动剂或者阻断剂。 利用新发现的人趋化因子或/和其相互作用受体的转基因或/和基因敲除鼠，进一步阐明新发现的人趋化因子及其相互作用受体对动脉粥样硬化发生发展的体内调控作用。 在动物模型中，鉴定课题5所发现的新配体，并开始利用高通量测序及基因芯片等技术研究疾病不同阶段GPCR及其信号分子的变化。 研究细胞状态及配体对GPCR蛋白在细胞膜上运动的影响，继续深入研究相关GPCR受体蛋白与配体的相互作用机制。 在全基因组范围内开展基于新一代靶向测序技术的药物基因组学研究，从头筛选并验证与中国人心血管疾病用药差别密切相关的基因多态性。 合作进行基于结构的配体设计和筛选，新配体复合物蛋白质样品的纯化和结晶。 设计，合成并建立小分子化合物库， 筛选出可以特异作用于不同GPCR的激动剂和拮抗剂。 1. 阐明血小板来源的GPCR配体参与动脉粥样硬化及血管急性损伤的作用。构建新型模式动物模拟人类血管炎症发生发展过程。 2. 通过筛选和鉴定，阐明受体活性修饰蛋白RAMP1/2/3如何通过影响CGRP家族成员的受体CRLR，调节配体的不同的血管生物学保护作用。 3. 明确新发现的人趋化因子及其相互作用受体是否可作为动脉粥样硬化防治的候选药物靶。 4. 对于发现的新配体的治疗效果进行评价，确定疾病不同阶段GPCR及其信号分子的变化。 5. 阐明配体对GPCR寡聚化及运动的影响关系，深入解析配体与受体相互作用的分子机制，为相关药物设计提供重要的理论基础。 6. 明确5个以上有临床意义突变位点的功能、机制；获取全面的GPCR基因型与重大心血管疾病表型关系数据集合 7. 获得高特异性新配体，获得高质量的受体/新配体复合物晶体。 8. 通过TR-FRET的方法来观察候选配体分子对膜表面GPCR自身二聚化和多聚化所产生的影响；在原代细胞表达待筛选GPCR，建立基于单细胞受体内吞原理的光电检测、鉴定和分析技术，包括膜片钳电生理和荧光共聚焦显微成像的实时-高分辨率检测方法。 第 五 年 鉴定血小板表面孤儿受体，研究其在心血管疾病发生发展中的作用。 筛选可结合或激活CRLR/RAMP的天然化合物，然后对其进行修饰或改造，提高其与受体结合的亲和力和特异性。 研究新发现的人趋化因子或/和其相互作用受体的结构、结合位点，为进一步药物开发提供依据。 继续第四年的高通量测序及基因芯片等技术检测研究疾病不同阶段GPCR及其信号分子的变化。 利用单分子荧光技术研究GPCR蛋白以及G蛋白在信号转导过程中的构象变化。 在前述基础上，将中国人GPCR基因及其相关信号基因多态性与临床表型的关系进行整合、及基因多肽与药物效果和毒性研究； 收集新配体复合物晶体的衍射数据，并进行结构解析，合作进行配体结构优化和功能研究。 研究相关GPCR受体功能及其作用机制。 1. 发现新的血小板表面GPCR，并对其在心血管疾病的作用有初步了解。 2. 阐明CGRP家族及其GPCR受体的心血管保护的作用机制及结构基础，阐明新发现的人趋化因子及其相互作用受体在动脉粥样硬化中的作用机制。 3. 通过对GPCR及G蛋白在信号转导过程中构象变化的研究，揭示GPCR蛋白信号转导的机理。 4. 确定5个以上重要GPCR基因及其相关信号基因多态性对药物治疗有效性和毒理性的影响； 5. 获取全面的GPCR基因型与重大心血管疾病表型关系数据集合，为基于基因型-表型关系的个体化用药提供理论依据； 6. 获得新配体复合物的晶体结构。 7. 采用上述方法进一步进行高通量/深度功能分析的目标GPCR配体的筛选，尤其是功能选择性配体，研究内源性配体发生机制及其与新药物配体的功能差异。 8. 实现高敏高效的细胞水平的GPCR药物筛选技术应用和深度受体功能研究