2012CB944600 生殖细胞基因组结构变异的分子基础 (2).doc

项目名称： 生殖细胞基因组结构变异的分子基础 首席科学家： 金力 复旦大学 起止年限： 2012.1至2016.8 依托部门： 上海市科委 教育部 一、关键科学问题及研究内容 1、拟解决的关键科学问题： 在人类生殖细胞的形成过程中（包括生殖干细胞的有丝分裂和生殖细胞的减数分裂），基因组会产生多种变异；其中，基因组结构变异（SV）是人类生殖与发育相关疾病的重要致病因素，也是个体间遗传差异的主要形式之一。本项目成员的前期研究发现，SV可以来源于生殖细胞形成过程中的DNA复制、同源重组、DNA损伤修复、染色体的错误分离等多种途径，在神经发育异常、先天性心脏病、男性不育症等多类生殖与发育相关疾病中有重要致病作用。但是，SV在生殖细胞发生过程中是如何突变产生的？有何特征与规律？其致病机制有哪些？SV对人类群体生殖健康的作用是怎样的？这一系列科学问题仍未解答。因此，本项目拟解决的关键科学问题是：人类生殖细胞基因组SV突变的分子机制及其在个体和群体水平上的生物学效应。 2、主要研究内容： 针对上述要解决的关键科学问题，我们将主要开展以下四个方面的研究。其中，生殖细胞基因组SV的特征与突变机理研究针对子问题“生殖细胞基因组SV突变的分子机制”，生殖细胞基因组SV的致病机制与群体效应研究针对子问题“生殖细胞基因组SV在个体和群体水平上的生物学效应”。 1）生殖细胞基因组结构变异的特征研究 生殖细胞基因组稳定性及其遗传变异研究的一个瓶颈是SV突变事件的发现和鉴定。即便基因组SV的突变率高，一个精子和一个卵子结合之前在全基因组范围新产生的SV一般也仅有一个或者数个，不利于研究材料的积累。对SV多发的各类生殖与发育疾病的研究，可以突破上述研究瓶颈。在神经系统发育缺陷（例如，智障）和器官组织的发育缺陷（例如，DMD），新发生的SV是重要的致病因素之一，已知的由致病性SV导致的病例可以占到总病例的20%；并且，随着研究技术分辨率的提高，这一检出率还在不断上升。本项目基于前期工作对致病性SV的研究基础，拟通过全基因组SV分析和定点的定量分析等技术手段相结合，鉴定生殖与发育疾病中的由生殖细胞基因组变异产生的致病性SV，并进行深入的SV特征研究。主要研究： (1) 选择与生殖细胞基因组SV相关的出生缺陷为切入点，包括：智障、DMD等，并同时采集核心家系，用于进行病例与其父母的基因组比较分析； (2) 应用高分辨率的比较基因组杂交芯片、特定SV位点的拷贝数定量分析等技术手段，发现SV变异并通过家系内的比较分析鉴定生殖细胞形成过程中新发生（de novo）的基因组SV； (3) 研究和总结由生殖细胞基因组变异导致的各种致病性SV的结构、基因组上的分布规律、突变热点等特征； (4) 通过对SNP和STR等人类基因组遗传标记在家系内的传递信息，确定SV的亲代来源，探索在精子和卵子的发生过程在基因组SV中的相对贡献。 2）生殖细胞基因组结构变异的突变机理 生殖细胞基因组的重排过程可以由不同的分子机理介导。已知的可以导致SV的突变机理模型有多种，产生具有不同结构和序列特点的SV。SV的结构特征即简单SV和复杂CNV；SV断点序列特征包括：微同源序列，SINE/LINE，无同源序列等多种形式。本项目将研究人类生殖细胞形成过程中基因组SV的突变机理，探讨DNA损伤后引起的基于DNA重组（例如，NAHR和BIR等）及DNA复制（例如，FoSTeS和MMBIR等）的突变机理模型在基因组SV形成过程中的作用。主要研究： (1) 利用覆盖全基因组的SV分析方法以及定点的高密度SV检测方法研究“研究内容一和内容四”中鉴定得到的SV，解析其精细结构及特征，发掘其它低分辨率技术无法检测到的SV复杂结构； (2) 基于高密度SV分析结果，进行SV断点序列的特异性扩增，利用DNA测序技术将SV断点确定到单个碱基水平，并研究其序列特征； (3) 基于大样本、高通量数据的断点和结构特征分析，检测已知的基于DNA重组与DNA复制的不同突变机理在生殖细胞SV中的贡献，并在积累的大量新数据的基础上，研究和揭示新的SV突变模型； (4) 研究人类基因组重复序列的组成特性对生殖细胞减数分裂过程中非等位同源重组的影响，探索人类基因组的特殊结构与其不稳定性之间的关联； (5) 追溯基因组SV的突变起源（生殖干细胞的有丝分裂或生殖细胞减数分裂阶段），用以指导相关生殖和发育疾病的产前诊断。 3）生殖细胞基因组结构变异的致病机制 基因组SV与人类疾病密切相关，特别是在出生缺陷中高发。同时，部分在人群中常见的SV对人体生理功能及性状有重要影响。但是SV的致病机制仍未被阐明清楚，相关研究报道较少。已有的SV致病的分子机制模型主要有：基因失活、剂量效应、基因融合、位置效应、二次突变等。这些机制或者假说为我们进行生殖细胞基因组SV发现后的致病机制研究提供了理论指导。主要研究： (1) 针对“研究内容一”中鉴定得到的出生缺陷等常见生殖与发育疾病中的致病性SV以及“研究内容四”中发现的中国人群中常见的SV变异，基于基因组SV的断点序列分析数据，确定SV中涉及的单个或者多个功能性基因； (2) 根据SV的变异形式，在“基因失活、剂量效应、基因融合、位置效应、二次突变”等机制的理论指导下，针对不同SV提出合理的SV致病机制假说； (3) 借助于基因表达分析、基因过表达或基因敲除、斑马鱼等模式动物、体外细胞培养及功能鉴定等技术手段，进行SV致病机制假说的检验； (4) 研究生殖细胞基因组SV导致生殖与发育疾病的分子机制。 4）生殖细胞基因组变异在中国人群中的群体效应 生殖细胞的基因组发生变异之后，除了直接的致病性导致包括生殖与发育疾病在内的多种先天性疾病之外，也可以作为一类常见变异存在于人群中，是人类基因组遗传多样性的重要形式，并影响人体的生理功能及性状，可能和人类常见疾病相联系。因此，生殖细胞SV的群体效应是SV的生物学功能和致病作用的重要组成部分。此外，本项目“研究内容一”选择SV高发的相关疾病为切入点，突破生殖细胞SV突变难以发现和鉴定的瓶颈；但同时，也可能会造成后续的SV突变机理与生物学功能研究的偏向性。因此，本“研究内容四”将纳入中国人群中较为常见的SV，检验生殖细胞基因组SV突变后的长期的群体效应。主要研究： (1) 选择具有代表性的基因组SV多发的人类17号常染色体和X性染色体为主要研究模型，利用高分辨率的基因组学技术进行大样本量和高密度的基因组SV分析和鉴定； (2) 利用人类群体的基因组学数据，在全基因组水平进行系统的SV变异分析，研究SV的性质和分布规律； (3) 借助于基因组连锁不平衡的规律与SNP信息，在群体水平上估计SV发生的突变率； (4) 研究人类基因组上减数分裂重组的热点及其序列或结构特征，探索热点区域形成的分子基础； (5) 利用群体遗传学分析手段，结合“研究内容三”的SV生物学功能研究，系统地揭示生殖细胞基因组SV所产生的群体效应，探讨SV对人类性状的多样性、自然选择、环境适应、以及人群健康的重大意义和作用。 二、预期目标 1. 本项目的总体目标： 以基因组SV高发的出生缺陷病例及其家系为切入点，突破生殖细胞基因组SV新发生突变难以鉴定的瓶颈，同时结合中国人群中常见的SV，综合遗传学、生殖医学、细胞生物学、人类生物学、生物信息学与系统生物学等现代生命科学研究手段和工具，研究生殖细胞的发生过程中基因组SV的特征、突变机理、致病机制、以及群体效应，揭示生殖细胞基因组稳定性的重要作用和意义，在解答科学问题和取得理论突破的同时，指导SV相关生殖与发育疾病的分子诊断与防治。 通过本项目的实施，预计将在以下几个方面取得突破： (1) 系统阐明生殖细胞减数分裂与生殖干细胞有丝分裂中产生SV突变的分子机理，为相关生殖与发育疾病的诊断和防治提供理论基础； (2) 深入揭示生殖细胞基因组SV的生物学效应，解析相关疾病的致病机制及其群体效应的分子基础； (3) 建立具有国际竞争力的创新型研究团队，并培养一批优秀中青年人才，使我国在生殖细胞基因组稳定性研究进入国际前沿。 2. 五年预期目标: 在已有的前期工作与成果发现的基础上，选择生殖细胞基因组SV这一新的学术增长点为突破口，研究其在生殖细胞发生过程中的突变机理、在人类疾病中的致病作用、以及在人群中的群体效应，使我国在生殖细胞基因组稳定性研究领域进入国际领先水平。项目的具体预期目标包括： (1) 在SV相关的出生缺陷中全面发现由生殖细胞发生过程中产生的基因组SV，建立一个具有可扩展性和可移植性的疾病相关SV的信息和特征数据库； (2) 研究已知机理模型在生殖细胞基因组SV突变中贡献的同时，探索具有特殊结构的SV，发现1-2类未知的SV突变新机理； (3) 建立细胞水平的和模式动物（例如，斑马鱼）水平的SV功能研究方法； (4) 通过生殖细胞基因组SV突变途径的不同特点，完善相关疾病的分子诊断和产前诊断技术； (5) 建立中国人群的高密度基因组SV突变谱，揭示生殖细胞SV突变的群体遗传规律； (6) 课题有机地紧密联系、充分利用团队优势开展协作，取得生殖细胞基因组SV相关的重要科研成果和突破，发表高水平论文50篇以上； (7) 通过高质量的基础研究训练来提高研究生和博士后的科研素质，培养学术带头人2人以上，研究生60人、博士后5-10人，为我国生殖细胞基因组稳定性及健康研究储备后备人才。 三、研究方案 1. 学术思路 生殖细胞基因组的稳定性对于人类生殖健康和子代发育至关重要。在生殖干细胞的有丝分裂和生殖细胞的减数分裂过程中，基因组结构变异（SV）突变率高、变异程度大、覆盖面广，是各类生殖与发育相关的先天性疾病的重要致病因素。研究SV的突变及致病的分子机制具有重大的科学意义与临床应用价值。但是，现阶段的相关研究遇到了生殖细胞中新发生基因组SV难以鉴定的瓶颈。 本项目以基因组SV高发的出生缺陷疾病家系及大规模人群研究为切入点，主要利用我们已经建立的高密度比较基因组杂交芯片分析等先进技术平台，对长期积累的丰富的SV相关病例资源进行全面的家系分析和群体分析，突破生殖细胞基因组SV新发生突变难以鉴定的瓶颈，系统高效地鉴定生殖细胞基因组上产生的SV，为研究其突变机理及致病机制提供大量的分析材料，并揭示精子与卵子基因组稳定性对生殖健康的相对贡献，在解答科学问题和取得理论突破的同时，指导SV相关生殖与发育疾病的分子诊断与防治。 2. 技术途径和总体技术路线 本项目从出生缺陷病例及家系、大规模的中国人群入手，通过高密度CGH芯片等全基因组SV分析手段以及定量PCR、FISH等定点SV分析手段相结合，鉴定生殖细胞发生过程新产生的基因组SV以及可通过生殖细胞遗传的SV。 课题一还将对SV的结构和重排模式进行解析，研究SV的变异特征，并揭示精子和卵子的发生对生殖细胞基因组SV突变的贡献。 课题二以DNA重组、错误复制等理论假说为基础，通过序列捕获和高通量测序等技术，研究SV突变的分子机理，阐明生殖细胞减数分裂重组和生殖干细胞有丝分裂等过程在SV突变中的作用。 课题三根据SV的结构特征提出SV发挥生物学功能的可能的途径，借助于细胞模型、斑马鱼模式动物模型、基因体外操作和调控技术等，模拟和检验SV致病的分子机制假说。 课题四除了对中国人群进行基因组规模的SV分析之外，还将利用精子分型技术对SV的突变率进行检测，同时借助于群体遗传学手段，研究生殖细胞基因组SV产生后的群体效应，服务于人群的生殖健康。 3. 创新点与特色 关键科学问题的前沿性：新近大量发现的人类基因组SV的突变率高、变异程度大、致病性强，是近年生命科学研究的热点。生殖细胞基因组上新发生的SV被认为是各类原因未明的先天性疾病的重要致病因素，对这一前沿问题的进一步探索有望取得重大突破。本项目以我国优生优育的生殖健康重大需求为导向，瞄准基因组SV这一国际科学前沿，集中开展生殖细胞基因组SV突变及其致病的分子机制的科技攻关。通过对生殖细胞基因组SV的特征、突变机理、致病机制、群体效应等内容的研究，鉴定一系列生殖与发育疾病相关的生殖细胞基因组SV，阐明其突变产生的分子机理、解释其在生殖与发育疾病中的生物学功能以及在中国人群中的群体效应，在解答科学问题和取得理论突破的同时，指导SV相关生殖与发育疾病的分子诊断与防治。 研究策略和方法的独特性及有效性：本领域研究的重大难点和瓶颈是生殖细胞中新发生基因组SV难以被鉴定，从而妨碍了后续的对SV突变机理和致病机制的研究。本项目以基因组SV高发的生殖与发育疾病家系及大规模人群研究为切入点，对长期积累的丰富的SV相关病例资源进行全面的家系分析和群体分析，突破生殖细胞基因组SV新发生突变难以鉴定的瓶颈。并设计并完善了不同的SV发现策略，满足不同研究的需求。本项目的前期工作中，通过上述研究策略和方法已鉴定了大量生殖细胞基因组新产生SV。 技术平台的先进性：本项目已建立了最新一代的基于寡核苷酸探针的比较基因组杂交芯片技术平台（Agilent G3），可进行高密度全基因组的SV结构分析；同时，配备了高效的基因组目的片段捕获技术（Agilent SureSelect）和高通量测序技术平台，可以对SV的断点序列进行细致分析，将SV的局部解析度提升到单个碱基水平；借助于SNP基因分型芯片平台（Illumina及Affymetrix），可对SV的亲代来源进行追溯，揭示精子与卵子基因组稳定性对生殖健康的相对贡献，指导SV相关生殖与发育疾病的分子诊断与防治。 4. 可行性分析 先进理论和模型的指导：本项目成员在前期工作中揭示了FoSTeS/MMBIR新模型在SV突变中的重要作用，并研究了生殖细胞减数分裂重组机理NAHR突变率的影响因素，相关成果发表于Nature Genetics、AJHG等知名科学期刊，为本项目的研究提供了理论指导。综合先前的研究成果，针对本项目的研究，我们提出了生殖细胞减数分裂和生殖干细胞有丝分裂中分别产生的SV在基因组重排模式上可能存在明显差异的假说，为本项目中SV突变机理研究指明了方向。 宝贵的SV相关疾病家系资源以及大量人群样本的积累：中南大学医学遗传学国家重点实验室近5年共完成来自全国各地的26529例疑难病例的遗传学筛查，其中很大一部分涉及生殖和发育的异常，例如，其中因智力障碍原因就诊者就有2890例。以上病例都有详细的临床资料，DNA样本，EB病毒转化B淋巴细胞株，为开展创新性研究奠定了独特的资源基础。同时，还建立有“中国人染色体异常核型数据库”，“中国遗传病家系收集数据库”以及“人类孟德尔遗传疾病数据库管理系统”。中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室与McKusick-张孝骞协和遗传医学中心建立了包括近百种遗传病的数据库，有3000多病例的数据资料和样本。复旦大学遗传工程国家重点实验室与现代人类学教育部重点实验室长期从事中国及东亚各族人群的群体遗传学研究，建立了覆盖全国和东亚大部分地区的现代人群DNA资源库及数据库。上述病例、家系和人群样本是本项目进行SV研究的宝贵材料。 高水平技术平台的支撑：本项目已建立了一系列高密度高通量的基因组分析平台，是进行生殖细胞基因组SV鉴定及突变机理研究的保障。包括：基于寡核苷酸探针的比较基因组杂交芯片技术平台（Agilent G3），用于高密度全基因组的SV结构分析；ABI 7900HT实时定量PCR仪和染色体图文工作站，用于定点的SV分析；基因组目的片段捕获技术（Agilent SureSelect）和高通量测序技术（ABI SOLiD和Illumina GAIIx）平台，用于SV断点序列分析；SNP基因分型芯片平台（Illumina BeadArray及Affymetrix），用于SV亲代来源及基因组重排模式的检测。 5. 课题设置 各课题间相互关系 生殖细胞基因组的稳定性对于人类生殖健康和子代发育至关重要；其中生殖细胞基因组的SV是各类先天性出生缺陷等重大疾病的重要致病因素。但是，生殖细胞基因组SV的突变、致病、以及对人群健康影响等过程的分子基础还不明确。因此，本项目相应地设立四个课题，分别着重研究生殖细胞基因组SV的特征研究（课题1）、突变机理（课题2）、致病机制（课题3）、及其在中国人群中的群体效应（课题4）。 四个课题之间相互衔接、互相支持呼应、有机地结合在一起。课题一以SV相关的出生缺陷为切入点，依靠高分辨率的基因组分析技术和全面的家系分析，高效地鉴定新发生的生殖细胞基因组SV并解析其特征，为课题二和课题三中分别研究SV的突变机理和致病机制提供研究材料并打下研究基础，与课题四中发现的人群中常见的SV进行比较，区分致病性SV与常见SV多态间的分布和特征差异，指导SV相关疾病的分子诊断。课题四于课题一互补，从大规模人群的角度发现与先天性疾病无关的常见的SV，研究生殖细胞基因组SV突变后在世代间的传递规律，使对生殖细胞基因组稳定性的研究更加全面，同时也为课题二和课题三的研究提供大量研究材料。课题二以课题一和四中分别发现的生殖细胞新发生SV及其后的部分可遗传的SV为对象，通过对SV结构、序列的特征以及基因组重排模式的研究，揭示不同突变机理在SV发生中的作用；归纳总结得到的突变机理与规律可以反过来预测不同SV突变的特征（课题一）和帮助鉴定SV突变热点（课题四）。课题三以课题一中发现的先天性生殖与发育疾病相关的生殖细胞基因组新发生SV和课题四中检测到的人群常见SV为主要对象，研究其产生生物学功能的分子基础，即致病机制与群体效应，从而阐明生殖细胞基因组的不稳定对生殖健康的重大影响，从而指导相关疾病的预防、诊断、治疗。 通过上述课题间的紧密协作，共同达到如下目标：（1）全面发现生殖细胞发生过程中产生基因组SV的位置、序列与结构特征；（2）系统阐明生殖细胞减数分裂重组与生殖干细胞有丝分裂中产生SV突变的分子机理；（3）深入揭示生殖细胞基因组不稳定的致病机理和群体效应。 课题一：生殖细胞基因组结构变异的特征研究 预期目标： 在SV相关的出生缺陷中全面发现由生殖细胞发生过程中产生的基因组SV，并研究其结构和序列特征，同时建立一个具有可扩展性和可移植性的疾病相关SV的信息数据库；在国际学术刊物上发表有较大学术影响的论文15篇以上，确定我国在SV检测和发病机制研究的学术地位；培养研究生10－15人。 主要研究内容： 对SV多发的各种出生缺陷的研究，可以突破SV突变事件难以鉴定的研究瓶颈。在神经系统发育缺陷（例如，智障）和器官组织的发育缺陷（例如，DMD），新发生的SV是重要的致病因素之一，已知的由致病性SV导致的病例可以占到总病例的20%；并且，随着研究技术分辨率的提高，这一检出率还在不断上升。本项目基于前期工作对致病性SV的研究基础，拟通过全基因组SV分析和定点的定量分析等技术手段相结合，鉴定出生缺陷中的由生殖细胞基因组变异产生的致病性SV，并进行深入的SV特征研究。具体包括： (1) 选择与生殖细胞基因组SV相关的出生缺陷为切入点，并同时采集核心家系，用于进行病例与其父母的基因组比较分析； (2) 应用高分辨率的比较基因组杂交芯片、特定SV位点的拷贝数定量分析等技术手段，发现SV变异并通过家系内的比较分析鉴定生殖细胞发生过程中新发生（de novo）的基因组SV； (3) 研究和总结由生殖细胞基因组变异导致的各种致病性SV的结构、基因组上的分布规律、突变热点等特征； (4) 通过对SNP和STR等人类基因组遗传标记在家系内的传递信息，确定SV的亲代来源，探索在精子和卵子的发生过程在基因组SV中的相对贡献。 承担单位：中南大学、中国医科大学、中国医学科学院基础医学研究所 课题负责人：邬玲仟 主要学术骨干：罗阳、尹飞、孙淼、郭纪锋 经费比例：25 % 课题二：生殖细胞基因组结构变异的突变机理 预期目标： 研究已知机理模型在生殖细胞基因组SV突变中贡献的同时，探索具有特殊结构的SV，发现1-2种未知的SV突变新机理；在国际学术刊物上发表有较大学术影响的论文15篇以上。培养博士研究生8-12人，硕士研究生5-8人。 主要研究内容： 生殖细胞基因组的重排过程可以由不同的分子机理介导。已知的可以导致SV的突变机理模型有多种，产生具有不同结构和序列特点的SV。本项目将研究人类生殖细胞形成过程中基因组SV的突变机理，探讨DNA损伤后引起的基于DNA重组及DNA复制的不同突变机理模型在基因组SV形成过程中的作用，并在积累大量数据的基础上发掘新的SV突变机理。具体包括： (1) 利用覆盖全基因组的SV分析方法以及定点的高密度SV检测方法研究“研究内容一和内容四”中鉴定得到的SV，解析其精细结构及特征，发掘其它低分辨率技术无法检测到的SV复杂结构； (2) 基于高密度SV分析结果，进行SV断点序列的特异性扩增，利用DNA测序技术将SV断点确定到单个碱基水平，并研究其序列特征； (3) 基于大样本、高通量数据的断点和结构特征分析，检测已知的基于DNA重组与DNA复制的不同突变机理在生殖细胞SV中的贡献，并在积累的大量新数据的基础上，研究和揭示新的SV突变模型； (4) 研究人类基因组重复序列的组成特性对生殖细胞减数分裂过程中非等位同源重组的影响，探索人类基因组的特殊结构与其不稳定性之间的关联； (5) 追溯基因组SV的突变起源（生殖干细胞的有丝分裂或生殖细胞减数分裂阶段），用以指导相关生殖和发育疾病的产前诊断。 承担单位：复旦大学、中南大学、香港中文大学深圳研究院、北京大学第一医院 课题负责人：张锋 主要学术骨干：段然慧、蔡光伟、王静敏、熊晖 经费比例：25% 课题三：生殖细胞基因组结构变异的致病机制 预期目标： 建立细胞水平的和模式动物（如，斑马鱼）水平的SV功能研究方法；明确3－5个重要SV及其相关基因在神经发育性疾病等出生缺陷中的作用；在国际学术刊物上发表有较大学术影响的论文10篇以上。培养博士研究生8－12人，硕士研究生5－8人。 主要研究内容： 基因组SV与人类疾病密切相关，特别是在生殖与发育疾病中高发。同时，部分在人群中常见的SV对人体生理功能及性状有重要影响。但是SV的致病机制不十分清楚。已有的SV致病的分子机制模型主要有：基因失活、剂量效应、基因融合、位置效应、二次突变等。这些机制或者假说为我们进行生殖细胞基因组SV发现后的生物学效应研究的理论指导。具体包括： (1) 针对“研究内容一”中鉴定得到的出生缺陷及其它常见生殖与缺陷疾病中的致病性SV以及“研究内容四”中发现的中国人群中常见的SV变异，基于基因组SV的断点序列分析数据，确定SV中涉及的单个或者多个功能性基因； (2) 根据SV的变异形式，在“基因失活、剂量效应、基因融合、位置效应、二次突变”等机制的理论指导下，针对不同SV提出合理的SV致病机制假说； (3) 借助于基因表达分析、基因过表达或基因敲除、斑马鱼等模式动物、体外细胞培养及功能鉴定等技术手段，进行SV致病机制假说的检验； (4) 研究生殖细胞基因组SV导致生殖与发育疾病的分子机制。 承担单位：中国医学科学院基础医学研究所、中国医科大学、复旦大学 课题负责人：赵秀丽 主要学术骨干：张学、张阳、姚纪花、孟岩 经费比例：25 % 课题四：生殖细胞基因组变异在中国人群中的群体效应 预期目标： 通过生殖细胞基因组SV突变途径的不同特点，完善相关疾病的分子诊断和产前诊断技术；建立中国人群的高密度基因组SV突变谱，揭示生殖细胞SV突变的群体遗传规律；在国际学术刊物上发表有较大学术影响的论文10篇以上。培养博士研究生10－15人，硕士生5－8人。 主要研究内容： 生殖细胞的基因组发生变异之后，除了直接的致病性导致多类先天性疾病之外，也可以作为一类常见变异存在于人群中，是人类基因组遗传多样性的重要形式，并有可能影响人体的生理功能及性状而与人类常见疾病相关。因此，生殖细胞SV的群体效应是SV的生物学功能研究的重要组成部分。此外，本项目“研究内容一”选择SV高发的相关疾病为切入点，突破生殖细胞SV突变难以发现和鉴定的瓶颈；但同时，也可能会造成后续的SV突变机理与致病机制研究的偏向性。因此，本“研究内容四”将纳入中国人群中较为常见的SV，检验生殖细胞基因组SV突变后的长期的群体效应。具体包括： (1) 选择具有代表性的基因组SV多发的人类17号常染色体和X性染色体为主要研究模型，利用高分辨率的基因组学技术进行大样本量和高密度的基因组SV分析和鉴定； (2) 利用人类群体的基因组学数据，在全基因组水平进行系统的SV变异分析，研究SV的性质和分布规律； (3) 借助于基因组连锁不平衡的规律与SNP信息，在群体水平上估计SV发生的突变率； (4) 研究人类基因组上减数分裂重组的热点及其序列或结构特征，探索热点区域形成的分子基础； (5) 利用群体遗传学分析手段，结合“研究内容三”的SV生物学功能研究，系统地揭示生殖细胞基因组SV所产生的群体效应，探讨SV对人类性状的多样性、自然选择、环境适应、以及人群健康的重大意义和作用。 承担单位：复旦大学 课题负责人：金力 主要学术骨干：李士林、杨亚军、杨雪艳 经费比例：25 % 四、年度计划 研究内容 预期目标 第 一 年 1. 在前期已有大量出生缺陷样本的基础上，继续收集智障、DMD、及其它出生缺陷病例及其家系； 2. 基于全基因组规模的SV发现或疾病相关位点的定点SV 分析的不同策略，设计基于Agilent寡核苷酸探针高密度CGH芯片技术的SV检测方法； 3. 对智障病例的核心家系进行全基因组SV检测，并采用FISH或定量PCR进行验证； 4. 采用MLPA技术对以往收集和新收集的DMD家系进行检测，并进行断点扫描； 5. 对收集到的SV相关的其它出生缺陷进行全基因组规模或者定点的高精度SV 分析； 6. 收集中国代表人群样本1000例，其中80%选择为女性样本；主要人群样本包括南方汉族、北方汉族，以及蒙古族、维族、藏族、回族、壮族、黎族等样本； 7. 利用高分辨率的基因组定制芯片，对中国人群样本进行高密度基因组芯片分析； 8. 构建先天性全身终毛增多症、IV型并指（趾）畸形和三节指节拇指-多并指综合征等疾病SV基因组元件的野生型和突变型表达载体，用体外转染技术和基因表达分析完成致病机制的初步评估； 9. 构建上述三种疾病SV基因元件的报告基因载体（pEGFP），显微注射斑马鱼模型快速验证SV致病机制； 10. 构建SV可能调控基因表达载体或反义RNA，通过其在斑马鱼中的表达分析，验证SV作用的可能机制（重复型，缺失失活型或基因融合型）。 1. 完成MR患者的全基因组CGH芯片分析； 2. 总结FXS和SCA患者CNG动态扩增规律，根据嵌合体和双胞胎特殊病例确定这些动态扩增发生在减数分裂还是胚胎发育的过程中； 3. 检出DMD基因缺失或重复突变共300例以上，明确缺失/重复型DMD患者断裂点分布范围； 4. 获得1000例中国人群样本的基因组DNA，并记录这些样本的表型； 5. 设计得到全基因组水平的以及针对出生缺陷相关基因的多种SV检测芯片； 6. 通过生物信息学方法，对疾病病例的基因组CGH芯片数据分析得到SV变异位点信息，作为生殖细胞基因组新生SV的候选位点； 7. 初步确定先天性全身性终毛增多症及遗传性并指综合症相关SV的作用机制； 8. 建立模式动物（斑马鱼）水平的SV功能研究方法和表达分析系统； 9. 发表10篇左右的研究论文。 第 二 年 1. 利用定量PCR 技术和断点特征性序列的PCR 分析，针对出生缺陷病例中发现的SV，在其父母基因组中进行定量和定性检测，鉴定源于生殖细胞新突变产生的基因组SV； 2. 利用Gap-PCR/长片段PCR扩增缺失/重复型DMD患者断点，确定断点区域DNA测序； 3. 对鉴定得到的基因组SV，利用高密度的定点aCGH 芯片进行SV 精细结构的解析以及断点的精确定位； 4. 对于断点处于重复序列或者SV 结构复杂而导致的断点序列PCR 不成功情况，使用DNA pooling技术和断点序列捕获后测序的策略，进行SV断点序列分析； 5. 构建先天性全身终毛增多症、IV型并指（趾）畸形和三节指节拇指-多并指综合征3种疾病SV基因组元件的基因打靶载体； 6. 建立同源重组ES细胞系，获得SV嵌合体小鼠； 7. 获得SV突变的胚系杂合子（SV/+）； 8. 开发SV相关数据分析工具，通过挖掘全基因组数据，借助于基因组连锁不平衡的规律与SNP信息，在群体水平上估计SV发生的突变率。 1. 完成智障患者的全基因组SV变异检测及验证，并完成SV断裂位点的精确定位； 2. 完成DMD家系MLPA检测及DMD基因的位点特异性高密度基因芯片扫描，完成缺失/重复型DMD患者断裂点序列检测； 3. 确定出生缺陷相关的生殖细胞基因组新生SV的精细结构，鉴定其结构特征，并定位SV的断点区间； 4. 通过SV的断点序列分析，将生殖细胞基因组SV 的解析到碱基水平； 5. 通过生物信息学和基因组学方法，对利用新一代高通量测序技术得到的SV断点序列进行分析，系统得到出生缺陷相关病例源于生殖细胞基因组SV的突变断点序列信息； 6. 在积累大量中国人群SV数据的基础上，建立中国人群的高密度基因组SV突变谱； 7. 在建立中国人群的高密度基因组SV突变谱的基础上，估算出全基因组水平的SV突变率； 8. 获得先天性全身终毛增多症、IV型并指（趾）畸形和三节指节拇指-多并指综合征3种疾病的小鼠模型； 9. 发表10－15篇高水平研究论文。 第 三 年 1. 对已检出SV的患者及其父母的SNP和STR进行分析，明确SV的亲本来源，并其推测SV在生殖细胞中发生的阶段； 2. 根据已知的SV突变机理及前期提出的理论模型为指导，对多种出生缺陷中发现的源于生殖细胞的SV 进行结构和断点序列分析，区分不同SV突变机理产生SV 的结构和断点序列的特点； 3. 对人类基因组上的多种重复序列及其它特征进行分析，寻找可能与生殖细胞基因组SV突变热点相关的基因组建构特征； 4. 完成先天性全身终毛增多症、IV型并指（趾）畸形和三节指节拇指-多并指综合征3种SV/+杂合小鼠形态观察，测量； 5. 通过基因表达芯片对上述3种SV/+小鼠的多种器官进行分析，进一步初步确定在SV/+杂合小鼠中差异表达基因； 6. 应用免疫组织化学和组织原位杂交确定SV下游调控基因； 7. 采用全标本包埋原位杂交技术鉴定SV元件及其下游调控基因的时空表达谱； 8. 建立其他生殖、发育疾病相关的SV小鼠动物模型。 1. 通过核心家系分析，确定SV在家系中的不同传递模式，明确精子和卵子的发生过程在基因组SV中的相对贡献； 2. 根据重复序列的复杂结构，分析影响重复序列稳定性和复制的关键因素，深入探讨这些关键因子在基因组结构稳定性和复制过程中的作用； 3. 鉴别不同的已知SV突变机理在生殖细胞基因组SV 突变中的作用； 4. 揭示1－2种与生殖细胞基因组SV突变热点相关的基因组建构特征； 5. 根据全基因组中SV的性质和分布规律，探讨基因组SV与人类性状的多样性、自然选择、环境适应以及人群健康的重要关系； 6. 完成先天性全身终毛增多症、IV型并指（趾）畸形和三节指节拇指-多并指综合征形态和基因表达分析； 7. 确定了相应SV调控基因及其时空表达谱，从分子水平明确了上述三种疾病中SV的致病机制； 8. 获得3-5种生殖发育疾病SV突变小鼠模型； 9. 发表10－15篇高水平研究论文。 第 四 年 1. 运用生物信息学方法对致病性SV的结构、分布规律、突变热点等特征进行深入分析； 2. 总结所检测得到的SV数据，构建一个中国人群种族特异性的SV数据库； 3. 建立国际先进水平的SV相关出生缺陷的诊断及产前诊断技术平台； 4. 根据SV特征性断点序列，检测病人父亲精子中的SV 突变频率，判断突变发生的阶段； 5. 研究人类基因组上减数分裂重组的热点及其序列或结构特征； 6. 建立，优化SV突变的小鼠模型的研究平台。 1. 建立一个具有可扩展性和可移植性的SV信息和特征数据库； 2. 预测DMD基因中SV突变发生的基因组结构基础,为疾病相关SV突变机制的阐明提供依据； 3. 建成国际先进水平的出生缺陷产前诊断基地； 4. 追溯生殖细胞基因组SV突变发生的阶段，判断源于生殖干细胞的有丝分裂或是减数分裂； 5. 明确3-5种生殖发育疾病SV致病机制； 6. 通过生殖细胞基因组SV突变途径的不同特点，完善相关疾病的分子诊断和产前诊断技术； 7. 发表10－15篇高水平研究论文。 第 五 年 1. 项目各课题组信息整合，完善中国人群致病性SV突变数据库； 2. 基于大样本，高通量数据的断点和结构特征分析，归纳和揭示生殖细胞基因组SV的突变规律； 3. 整理资料、总结分析； 4. 课题及项目总结，准备相关结题汇报材料。 1. 全面总结生殖细胞发生过程中产生基因组SV 的位置、序列与结构特征； 2. 建成较为完善的SV数据库； 3. 归纳和揭示得到1－2中生殖细胞基因组SV突变的新机理； 4. 建立国内SV相关疾病的研究平台； 5. 发表10－15篇高水平研究论文；按时结题验收。