2010CB911800-细胞抗病毒先天免疫相关蛋白的生物学研究 (2).Doc

项目名称： 细胞抗病毒先天免疫相关蛋白的生物学研究 首席科学家： 郭德银 武汉大学 起止年限： 2010年1月-2014年8月 依托部门： 教育部 一、研究内容 鉴于突发、重大和难以控制的病毒性疾病对我国人民生命安全和社会经济发展构成的重要威胁，研发特异性抗病毒药物与高效疫苗、有效预防和控制重大病毒性传染病发生和流行进而降低其危害，一直是我国生物医学科学领域的重大国家需求。满足这些国家重大需要的核心在于：首先必须有原创性理论研究的重大突破。通过研究细胞抗病毒反应的免疫识别、信号转导与调控、病毒感染后细胞蛋白的修饰变化以及病毒逃逸免疫识别相关蛋白的结构和功能，获得源头创新的理论研究成果，进而发现关键的抗病毒药物靶点和获得抗病毒药物设计的蛋白结构基础，建立增强免疫效果的新策略，为新型疫苗与佐剂设计提供理论依据。 为此，本项目拟从蛋白质功能与结构层面着手，解决先天免疫应答过程中抗病毒信号传导与调控以及病毒逃避先天免疫反应的分子机制等关键科学问题，以发现参与抗病毒先天免疫信号转导与调节的新蛋白、解析关键蛋白的结晶结构、揭示先天免疫应答与病毒免疫逃逸的新机制。具体科学问题包括：先天免疫抗病毒反应信号通路中重要接头和调节蛋白的发现与结构功能关系；病毒感染后对宿主细胞抗病毒信号转导的抑制以及诱发的宿主细胞蛋白质组修饰（磷酸化、泛素化等）与功能；冠状病毒等主要RNA病毒对其RNA基因组进行保护修饰而引起免疫逃逸的分子机制；揭示抗病毒先天免疫中TLRs和RLR等模式识别受体识别病原相关分子模式（PAMPs）以及下游信号转导的蛋白结构基础和调节机制。 围绕解决上述关键科学问题，本项目拟开展如下几方面的研究： 1. 抗病毒先天免疫信号转导与调控相关蛋白的系统鉴定和功能研究 以抗病毒先天免疫反应的RLR信号通路为对象，揭示信号通路中关键蛋白在抗病毒先天免疫调节中的功能和信号通路的分子机制。结合抗病毒先天免疫应答相关蛋白的鉴定和下游信号通路的研究，开展抗病毒先天免疫调控树突状细胞抗原递呈功能的机制研究，从分子水平揭示先天免疫与获得性免疫如何协作启动机体的抗病毒免疫，为病毒新型疫苗的合理设计提供理论基础。 具体研究内容包括： 1）RLR信号通路分子及其相关蛋白的筛选、克隆和相互作用研究：主要采用酵母双杂交和蛋白芯片技术，筛选、克隆相关的新基因和蛋白。从信号通路及调节分子的相互作用及其机理着手，阐明RLR信号通路的传递以及调节的机制 2）这些新发现蛋白分子在抗病毒细胞免疫调节中的作用研究：着重阐明信号通路分子及调节分子在病毒感染和抗病毒先天免疫中的作用，以及如何通过信号通路的调节发挥作用。 3）抗病毒信号通路的交叉和关联研究：主要研究RLR和TLR在病毒感染时信号通路交叉和影响，研究这种关联在病毒感染和抗病毒先天免疫中的意义。 4）抗病毒先天免疫相关分子调控树突状细胞病毒抗原递呈的机制研究：研究诱导树突状细胞成熟的MyD88依赖型信号通路和MyD88非依赖型/TRIF依赖型信号通路调控病毒蛋白抗原递呈的分子机制，胞内的RLR信号通路对树突状细胞抗原递呈途径的影响，鉴定RLR信号通路参与调控树突状细胞病毒抗原递呈相关囊泡转运的相关分子，研究病毒编码蛋白对抗原递呈途径的影响与其免疫逃逸的关系。 5）抗病毒先天免疫相关分子调控病毒获得性免疫应答机制研究：采用单纯疱疹病毒、鼠肝炎病毒等感染动物模型，通过产生树突状细胞特异性Knock-in/down的转基因小鼠，研究不同抗原递呈途径与病毒免疫应答的关系，揭示抗病毒先天免疫相关分子调控病毒获得性免疫应答与病毒免疫逃逸的机制。 2. 病毒感染导致的宿主细胞蛋白的翻译后修饰与功能研究 许多病毒感染依赖宿主脂筏，胆固醇代谢途径中的蛋白组份也被病毒修饰利用。我们将采用蛋白组学方法，研究病毒对宿主脂筏以及胆固醇代谢途径的影响，特别针对HCV病毒感染，筛选潜在的能够被HCV丝氨酸蛋白酶NS3/4A切割的宿主蛋白并研究其在HCV感染过程中的作用。 已有的研究表明，蛋白质的磷酸化/去磷酸化，泛素化/去泛素化，SUMO化/去SUMO化修饰在调节病毒感染和复制、细胞抗病毒先天免疫反应等过程中具有重要作用。我们将用蛋白质组学方法系统的筛选调节病毒感染诱导I型干扰素表达的蛋白质修饰酶和去修饰酶基因，比较病毒感染前后宿主细胞蛋白磷酸化组学变化，发现受病毒感染调节的磷酸化蛋白，研究这些蛋白及其修饰在先天免疫中的作用机理。 具体研究内容包括： 1）对病毒感染依赖宿主脂筏的研究：采用分离细胞DRMs (Detergent Resistant Membranes) 技术，富集和提纯脂筏，通过蛋白组学技术与质谱分析相结合，比较病毒感染前后膜脂筏成分和结构差异，阐明病毒感染对脂筏构成宿主蛋白的修饰及其作用机理。另外，脂筏本身富含胆固醇，而胆固醇代谢途径也常常被病毒所利用。拟借助蛋白组学技术研究胆固醇代谢过程中被病毒修饰的位点以及作用机理； 2）NS3/4A丝氨酸蛋白酶在HCV多聚蛋白前体加工成熟中起着关键的作用，是抗HCV的主要靶标。HCV编码的丝氨酸蛋白酶NS3/4A对参与先天免疫的某些细胞蛋白如VISA进行切割，而且与之共定位于线粒体外膜。我们将进一步筛选宿主细胞中所有潜在的NS3/4A丝氨酸蛋白酶底物；同时，通过建立HCV敏感型宿主细胞体系，筛选HCV侵染过程中的宿主靶位点和能够被HCV丝氨酸蛋白酶NS3/4A切割的宿主蛋白，并进行功能研究； 3）病毒感染后细胞蛋白磷酸化修饰研究：采用仙台病毒（Sendai virus）（负链RNA病毒，属副粘病毒科即Paramyxoviridae）和痘苗病毒（vaccinia virus）（双链DNA病毒）分别感染293细胞，用蛋白质组学方法系统地比较病毒感染前后宿主细胞磷酸化蛋白组学变化，发现受病毒感染调节的磷酸化蛋白，进而研究这些磷酸化蛋白的作用机理； 4）病毒感染后引起的宿主细胞蛋白泛素化修饰及其在先天免疫抗病毒反应中的作用研究； 5）筛选调节病毒感染诱导I型干扰素表达的蛋白质修饰酶和去修饰酶基因，研究这些蛋白质修饰酶在病毒感染诱导I型干扰素表达的信号转导中的作用靶点和机理；比较病毒感染前后宿主细胞蛋白磷酸化组的变化，发现受病毒感染调节的磷酸化蛋白，研究这些磷酸化蛋白在病毒复制和细胞抗病毒先天免疫信号转导中的作用和机理。 3. 病毒基因组修饰与免疫逃逸相关蛋白的鉴定与功能研究 在先天免疫识别和抗病毒反应研究领域，过去一直侧重于对宿主细胞蛋白在抗病毒先天免疫中的功能研究。然而，病毒编码蛋白通过对自身基因组RNA或病原识别分子模式（PAMPs）的修饰和保护，直接影响先天免疫模式识别受体对病毒的识别以及下游信号转导和抗病毒反应，致使病毒逃逸细胞的先天免疫和导致感染发生。而对这一重要领域的研究明显不足，本项目将选择几种有代表性的RNA病毒为研究对象，试图揭示RNA病毒非结构蛋白对病毒基因组RNA修饰和保护的功能及其在先天免疫识别和抗病毒反应中的作用，为阐明细胞先天免疫识别和病毒免疫逃逸机理，进而发现新的抗病毒药物靶点以及为建立高通量的药物筛选平台提供新知识。 具体研究内容包括： 1）冠状病毒RNA 5’端修饰与先天免疫识别和病毒免疫逃逸的关系：冠状病毒为最大的RNA病毒，其庞大的RNA基因组在复制过程中很容易被宿主细胞识别，但SARS病毒却可以很成功地在细胞内复制并引起严重疾病，说明该病毒具有抑制或者逃逸宿主先天免疫反应的能力。最近的研究表明，RNA 5’端结构对于先天免疫系统的识别（如RIG-I受体和PKR激酶）至关重要，而RNA 5’端的加帽（capping）可能会使RNA避免被先天免疫系统识别。我们最新的研究表明，SARS冠状病毒非结构蛋白nsp14为病毒RNA加帽的关键酶之一（Chen et al., 2009）。我们将利用本实验室构建的酵母菌功能筛选系统，筛选降低nsp14甲基化酶活性的点突变体（point mutants），将点突变位点克隆到携带报告基因的SARS病毒复制子，筛选加帽功能受到影响但仍然能够进行一定程度基因组复制的突变体；分析比较不同突变体引起宿主细胞I型干扰素反应和白细胞介素产生的情况；如果发现加帽功能减弱或丧失能够增强先天免疫反应，将利用SARS病毒5’端RNA寻找RNA结合蛋白（结合质谱分析），鉴定可能的细胞内识别受体；最终的功能将使用完整的活病毒进行验证。鉴于使用活病毒的生物安全性考虑，该项工作将不会使用SARS活病毒，取而代之的是同属II组冠状病毒的小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus， MHV）。MHV对人无害，而且具有成熟的MHV反向遗传操作系统可供使用。 2）冠状病毒核衣壳蛋白N对基因组RNA的保护与对先天免疫受体识别的屏蔽作用：冠状病毒庞大的RNA基因组只有受到RNA结合蛋白的保护，才能免受先天免疫系统的识别。最新研究表明，冠状病毒结构蛋白N可以抑制宿主细胞的I型干扰素反应和抗病毒作用，但其机制仍然不清楚。我们推测，N蛋白抑制I型干扰素反应的功能可能与其RNA结合能力有关，即N蛋白通过结合病毒RNA而阻止模式识别受体对病毒RNA的识别。本研究将通过N蛋白缺失突变和点突变研究N蛋白的RNA结合能力、与RIG-I/MDA5等RNA识别受体的竞争关系以及对I型干扰素信号通路的影响。 3）甲病毒（alphavirus）加帽酶及RNA 5’端结构与先天免疫识别的关系：甲病毒为一类较小的RNA病毒，本研究选择Semliki森林病毒（SFV）为模式，其对人无害，具有良好的小动物模型。过去对该病毒加帽相关的病毒蛋白研究较多，但RNA加帽与先天免疫识别的关系尚没有研究。我们将利用SFV全长侵染性克隆反向遗传操作平台，构建加帽酶的各种突变体，在细胞培养系统中筛选各种病毒突变体。因为RNA 5’端帽子对RNA的蛋白翻译是必需的，为排除对蛋白质翻译的影响，本研究将改造病毒RNA 5’端结构，使之成为不依赖于cap进行蛋白质翻译。然后研究各种突变体在细胞培养和小鼠模型中对I型干扰素的诱导变化。 4）瘟病毒逃逸先天免疫识别的机制：瘟病毒为重要的RNA病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（pestivirus），其特点是RNA 5’端不具有甲基化的cap结构，其RNA如何避免先天免疫模式受体的识别仍然是个谜，因此本研究以猪瘟病毒(CSFV)为研究对象，探讨瘟病毒基因组编码蛋白对病毒RNA的修饰与保护作用。另外，瘟病毒编码的Npro蛋白酶和分泌性囊膜糖蛋白Erns对I型干扰素反应具有抑制作用，我们将进一步研究Npro和Erns对I型干扰素信号通路的抑制与调节机制。 4. 细胞抗病毒先天免疫识别与应答的结构生物学研究 细胞的抗病毒先天免疫主要通过两种受体途径发挥作用，即细胞膜和内体（endosome）膜上的TLR通路和胞质内的RLR通路。对这些病毒信号受体以及下游的信号分子之间通过何种方式协同和调节至今仍然是一个亟待回答的问题，特别是对这些蛋白的三维结构的解析，目前远远落后于对它们的功能、蛋白相互作用等的认知。对于这些重要的信号分子以及蛋白复合物的三维结构的研究，将使我们了解这些信号分子在先天免疫调节中发挥作用的结构基础。 本课题拟结合生物信息学、结构生物学、分子生物学、免疫学和细胞生物学等技术，对抗病毒先天免疫途径TLR和RLR信号通路中的重要模式识别受体、信号调控因子，识别DNA病毒的胞质内DNA sensor DAI、AIM2以及新发现的在先天免疫中具有调节作用的人类分泌蛋白为研究对象，解析重要蛋白及蛋白-受体复合物的三维晶体结构，揭示它们的信号通路和在抗病毒的免疫调节中的功能。 具体研究内容包括： 1）病毒识别受体的晶体结构研究 宿主细胞受到病毒感染时，主要通过TLR和RLR来识别病毒的RNA和DNA。与病毒侵染相关的TLR主要有TLR3，TLR7，TLR8，TLR9；而RLR主要包括RIG-I，MDA5和LGP2。这些病毒受体通过一些特征的结构域模块来识别病毒核酸，如LRR，helicase domain等。本课题将研究这些蛋白的单体结构以及它们与病毒核酸形成的复合物的晶体结构。另外，已有的研究表明，细胞内存在一些不依赖于RLRs的其它PRR，它们通过不依赖于RLR的方式来识别细胞内的病毒核酸，如宿主细胞能够识别DNA病毒、宿主坏死细胞等释放到细胞内的dsDNA，以不依赖于TLR和RLR的机制来诱导I型IFN的合成，进而引发抗病毒反应，所以本课题还计划对先天免疫应答的激活子，胞内DNA sensor DAI (DLM-1/ZBP1)和AIM2的结构进行解析。细胞内以识别细菌为主的部分NLR受体蛋白，由于它们与病毒感染的密切关系，也将包括在本课题的研究之内，如NAL12、NALP2、NLRC4、NLRX1、CAR14等。 2）TLR和RLR信号通路的重要蛋白、新发现的信号分子以及重要蛋白复合体的晶体结构的解析 本题目将对TLR和RLR信号通路的重要蛋白、新发现的信号分子以及重要蛋白复合体的晶体结构进行测定。主要针对RIG-I重要位点突变体（以比较其与野生型RIG-1蛋白构象之间的变化）、RIG-I的CARD与相互作用的RD domain的复合物、gC1qR、gC1qR与VISA复合物、VISA和MITA的复合物以及其它重要蛋白及复合物的晶体结构进行测定。 3）由病毒感染导致的宿主细胞蛋白的修饰和加工引起的蛋白结构变化 病毒侵染过程中经常会利用自己编码的酶或劫持宿主的一些酶为己所用，对一些宿主蛋白进行修饰和加工，如糖基化、泛素化、Sumo化、磷酸化和降解等。这些蛋白在修饰前后会有很大的结构变化，从而影响它们的功能。拟对未知结构的HCV NS3/4A底物蛋白进行结构解析；分析受病毒感染调节的磷酸化和泛素化蛋白变化，并对本项目内相关课题得到的新功能蛋白进行结构生物学研究。 4）先天免疫激活的不同信号通路之间的相互调节 由于TLR、RLR等信号转导可活化NF-κB、IRF3等转录因子并诱导TNF-α等促炎症细胞因子和先天免疫反应抗病毒作用的主要效应因子-I型干扰素等多种免疫介质的产生。适量的炎症因子对免疫反应起促进作用，过量的炎症因子的产生会导致炎症性组织损伤及内毒素休克等病理过程的发生。因此，识别和研究免疫失活途径中重要调控蛋白的结构和功能，对于我们了解免疫系统如何保持相对平衡并使机体维持免疫稳定、有效清除入侵病原并避免自身免疫病的发生有重要意义。本课题还将研究新发现的、在先天免疫中发挥调节作用的分泌蛋白SI-CLP在抗病毒先天免疫调节中的作用机制，寻找SI-CLP蛋白在细胞表面的受体，解析蛋白-受体的复合物结构，明确其信号转导通路以及与炎症免疫性疾病的相关性。 二、预期目标 1. 总体目标 通过对蛋白质和蛋白质复合物的结构、功能及其相互关系研究，明确细胞抗病毒先天免疫过程中模式识别受体与病毒的病原相关分子模式；发现先天免疫抗病毒信号通路与调控的新蛋白分子；阐明抗病毒反应的信号通路及其调控分子机制，以及病毒感染引起宿主细胞蛋白质修饰及其在先天免疫抗病毒中的作用；揭示病毒编码蛋白对病毒基因组和宿主细胞蛋白修饰与病毒免疫逃逸的关系。进而实现在抗病毒先天免疫基础理论研究领域取得源头创新性成果与重大突破；初步建立蛋白质组学高通量筛选体系，发现一批能用于抗病毒药物筛选的药物新靶标；为抗病毒新型疫苗和佐剂设计寻找新理论依据和途径。 整体研究结果将进一步巩固和提升我国在抗病毒先天免疫领域研究的国际地位，为抗病毒疫苗研制、药物设计和筛选提供创新性思路、理论依据和研发平台，提高我国重大病毒性疾病防治水平和应对处理重大病毒传染性疾病突发事件的能力，为促进人民生命安全和社会经济发展提供科学技术保障，持续性地为我国重要病毒性疾病防治和国际前沿学科的发展做出贡献。 2．五年预期目标 本项目预期在如下方面能够取得具有源头创新的研究成果： 1） 解析至少两种与先天免疫病原识别有关的模式识别受体的晶体结构，揭示受体结构与病原识别的功能关系； 2） 发现3种以上参与抗病毒先天免疫（以RLR信号通路为主）转导与调控的新型蛋白分子，明确其在先天免疫反应中的作用与功能； 3） 解析6种以上先天免疫识别与应答相关蛋白或复合体的晶体结构，弄清其结构功能关系； 4） 深入研究在自身免疫调控中具有炎症抑制作用的分泌蛋白SI-CLP，鉴定其发挥作用的信号通路以及相互作用蛋白，明确它们在抗病毒免疫调控中的作用，以及对病毒识别和侵染过程的抑制功能，为基于蛋白质三维结构的创新药物的设计提供可靠的靶点； 5） 构建出HCV敏感型细胞培养系统，筛选出5种以上能够被HCV丝氨酸蛋白酶NS3/4A切割的宿主蛋白，并明确其在HCV感染过程中的作用； 6） 揭示HCV感染后参与胆固醇代谢的途径中有哪些蛋白组份被病毒修饰利用及其作用，以及细胞膜脂筏结构与病毒感染的关系； 7） 弄清RNA病毒感染后宿主细胞蛋白质组磷酸化状态的改变，鉴定若干参与先天免疫反应的磷酸化蛋白以及泛素化修饰的宿主蛋白； 8） 明确冠状病毒非结构蛋白对病毒RNA 5’端修饰与病毒免疫逃逸和基因组复制的关系与机制； 9） 揭示冠状病毒核衣壳蛋白N在病毒抵抗干扰素产生信号通路中的作用与机制； 10） 揭示瘟病毒Npro蛋白酶、Erns和RNA 5’端结构与病毒抑制先天免疫反应的关系与作用机理。 在完成上述基础理论研究目标基础上，发现4种以上具有广谱抗病毒特性的药物靶点，建立2种以上针对主要病毒的高通量药物筛选平台；发表SCI论文50篇以上，其中高水平论文（影响因子>10）10篇以上，申请发明专利10项以上；培养博士研究生30名以上，培养教育部长江学者、国家杰出青年基金获得者等2名以上，在抗病毒先天免疫相关的蛋白质研究领域形成一支团结协作、具有创新能力和国际竞争力的高水平研究队伍。 三、研究方案 1．总体学术思路 先天免疫是宿主抵御病毒侵染的第一道防线，先天免疫之所以能够较广谱地识别病毒并迅速发挥效应，主要是基于先天免疫系统通过模式识别受体（PRRs）识别病毒具有一定结构特征的分子模式（molecular pattern），触发信号途径，诱导广泛的抗病毒反应；另一方面，为了逃逸宿主的免疫清除，病毒则进化出具有逃避宿主先天免疫反应的能力。因此，要揭示细胞抗病毒先天免疫反应与病毒免疫逃逸过程的分子机制，必须从研究宿主与病毒编码相关蛋白的结构、功能及其相互关系入手。本项目围绕抗病毒先天免疫领域的重要科学问题，以先天免疫模式识别受体、抗病毒信号转导与调控、宿主蛋白修饰和病毒逃逸先天免疫监控为主线，选择合适模式识别受体、信号通路和病毒作为研究对象，从不同层次和角度进行研究，以获得具有普遍科学意义的研究成果。 2．主要技术途径与方案 1）信号转导与调控 在已知的RLR信号分子中，关键分子RIG-I和MDA5与下游接头蛋白MAVS的相互作用都是通过它们结构中CARD结构域来介导的，并传递信号。但是这种相互作用是否需要其它蛋白的协同和调节至今未明。我们将以CARD结构域为诱饵，利用酵母双杂交系统，进行大规模筛选，同时也将采用蛋白质芯片技术进行规模化筛选，进而发现和克隆与CARD相互作用的蛋白。从这些潜在RLR信号分子着手，分析和研究它们的功能、机制和结构。 主要技术和实施要点 1.1) RLR信号的受体和下游接头蛋白分子相互作用和信号传递主要是依赖于两者的CARD结构域，而CARD结构域又是介导蛋白相互作用和调控细胞周期、凋亡等重要细胞效应的蛋白结构域。因此，从这个结构域着手，会发现更多的信号分子传递的信息。为此，我们将分别以RIG-I和其接头蛋白MAVS的CARD结构域为诱饵，利用酵母双杂交技术寻找相互作用的蛋白及其基因。同时，我们也将采用蛋白质芯片技术，以CARD作为探针进行筛选，从已知的蛋白质库中去发现相互作用分子。 1.2) 在获得候选基因后，我们将从分子水平研究分子间相互作用的机制，同时分析候选基因编码蛋白在抗病毒信号途径中作用。 1.3) 进一步通过分子和细胞水平的技术，研究候选基因编码蛋白在病毒感染和抗病毒先天免疫中的作用，以及利用这些候选基因编码蛋白进行细胞抗病毒调节的可能性。 1.4) 利用DNA重组技术，制备候选基因的表达产物，通过结构分析技术，解析蛋白的结构和其功能的关联，为进一步研究机制和药物研发提供依据。 2）病毒感染后对宿主蛋白的影响以及细胞蛋白质组结构变化 研究病毒侵入机制中对富含胆固醇脂筏的利用，主要通过体外富集DRMs的方法，结合蛋白组学特别是质谱分析手段，对脂筏的组成以及其中蛋白的修饰变化进行研究。由于许多病毒的复制依赖宿主的胆固醇，我们将针对胆固醇合成的mevalonate 通路进行研究，特别是胆固醇代谢途径里的中间代谢产物。 HCV是慢性病毒，不会对宿主肝细胞造成立即杀伤。为了有效研究HCV病毒感染导致的宿主细胞蛋白的翻译后修饰，我们设计了一个HCV敏感型细胞系，以筛选得到病毒感染的宿主靶位点的目标。具体来说，我们利用HCV编码的NS3/4A丝氨酸蛋白酶具有序列识别特异性，构建了一个表达重组PE（Pseudomonas exotoxin A）毒蛋白的真核载体，其中PE蛋白中的furin切割位点被NS3/4A识别位点（i.e., ATVSEEASEDVVCCSMSYTWTGAL）所取代，表达这种重组PE蛋白的细胞系预期将对HCV病毒感染特异性敏感。这种系统的建立，将极大地促进我们筛选获得病毒感染所利用的宿主蛋白，为进一步研究其对宿主蛋白的翻译后修饰及功能研究打下基础。我们还计划直接筛选能够被HCV丝氨酸蛋白酶NS3/4A切割的宿主蛋白。这些NS3/4A蛋白底物的发现，主要依赖蛋白组学结合质谱分析的方法。随后利用生物信息学方法，对得到的宿主细胞中的类似蛋白，进行再验证和结构功能研究。 为了进一步研究病毒感染导致的宿主细胞蛋白的翻译后修饰与功能，我们将系统地筛选调节病毒感染诱导I型干扰素表达的蛋白质修饰酶和去修饰酶基因，包括蛋白质的磷酸化/去磷酸化酶，泛素化/去泛素化酶，SUMO化/去SUMO化酶等基因家族成员。我们将购买商品化的蛋白质修饰酶和去修饰酶表达栽体，转染入包含IFN-荧光素酶报告基因的293细胞，在病毒感染和不感染的情况下，检测这些蛋白质修饰酶对IFN-启动子的调节作用。获得激活或抑制病毒诱导IFN-表达的蛋白质修饰酶后，将用过量表达和RNAi Knock down等细胞生物学、分子生物学、病毒学和免疫学方法研究这些蛋白质修饰酶作用的靶点和机理。 此外，我们将用SILAC(稳定同位素标记)、磷酸化多肽富集及蛋白质质谱定量鉴定等方法，以仙台病毒为模式病毒，系统的比较病毒感染前后宿主细胞蛋白磷酸化组的变化，发现受病毒感染调节的磷酸化蛋白。候选蛋白获得后，用一系列的细胞、分子生物学、病毒学和免疫学等方法研究这些磷酸化修饰蛋白在病毒复制或细胞抗病毒天然免疫反应中的作用和机理。 3）病毒逃逸先天免疫识别的机制研究 3.1）病毒非结构蛋白引起的基因组修饰与病毒免疫逃逸的关系：我们前期的工作证明，SARS冠状病毒非结构蛋白nsp14为参与病毒RNA 5’端加帽修饰的关键酶，本研究将利用业已建立的酵母菌功能测定系统，对nsp14的保守氨基酸位点进行系统的alanine突变扫描分析，筛选不同程度影响RNA 5’端加帽的突变体克隆到SARS病毒复制子中，使用各种突变复制子转染细胞，分析I型干扰素反应的变化。重要的突变位点也将克隆到小鼠肝炎病毒（MHV）的全长克隆中，在细胞培养和动物模型中分析突变体对I型干扰素途径的影响。对于影响到干扰素反应的突变体，还将设计针对不同模式识别受体的siRNA，通过下调模式受体表达观察冠状病毒RNA的5’端变化与识别受体的关系。 3.2）冠状病毒核衣壳蛋白N对先天免疫的抑制作用：使用N蛋白表达质粒与I型干扰素通路中不同的蛋白表达载体进行共转染，通过beta干扰素－荧光素酶基因报告系统观察N蛋白对不同蛋白诱发I型干扰素的影响；目前初步的实验已经证明N蛋白可能在模式受体识别这一环节，因此将通过RNA结合实验分析N蛋白与RLR受体对RNA结合的竞争关系，探索是否由于N蛋白屏蔽病毒RNA后抑制RLR的识别。同时，将利用质谱技术分析N蛋白在细胞内的磷酸化，揭示磷酸化状态与RNA结合的关系，并通过点突变去除相关磷酸化位点，分析N蛋白磷酸化位点与先天免疫抑制作用之间的关系。 3.3）SFV病毒RNA 5’端结构与I型干扰素诱导：使用全长SFV cDNA克隆，构建不影响蛋白翻译但5’－RNA结构不同的病毒RNA；通过点突变构建5’端加帽酶的各种突变体，结果测定与分析类似技术方案4.1。 3.4）CSFV病毒抑制I型干扰素反应的研究：构建表达CSFV各种编码蛋白及相关蛋白剪切中间体的真核重组质粒，利用I型干扰素启动子荧光素酶报道系统，采用质粒共转染和检测荧光素酶活性等方法，在CSFV敏感细胞系和分离的动物淋巴细胞上，扫描病毒编码蛋白产物对不同信号通路分子激活I型干扰素启动子的抑制作用，鉴定出可能的抑制I型干扰素基因表达的病毒蛋白产物；确定这些病毒抑制蛋白作用可能靶点。基于CSFV全长感染性cDNA克隆操作，构建病毒抑制蛋白单基因和多基因缺失突变体病毒，研究不同病毒抑制蛋白缺失对β-干扰素产生抑制的相互作用。根据CSFV 3´末端非编码区(3´UTR)二级结构与决定病毒基因组复制效率密切相关的特点，采用体外遗传操作技术，通过对CSFV全长感染性cDNA 3´UTR末端进行突变，拯救出具有不同复制效率的CSFV突变体。用这些突变体病毒感染敏感细胞系，研究病毒基因组复制效率与抗宿主细胞先天免疫的关系。 4）先天免疫相关蛋白的晶体结构分析与功能研究 对这些抗病毒先天免疫相关的蛋白，从目的基因的克隆开始，按照蛋白的表达和纯化，晶体的筛选和优化，衍射数据的收集和结构解析的顺序，逐步深入研究，并依据获得的结构信息随时构建新的蛋白突变体，使结构研究和其它方面的研究形成一个有机的整体。 4.1) 目的基因的克隆和蛋白的表达和纯化 依托现有的结构生物学平台，克隆目的基因，利用大肠杆菌、昆虫杆状病毒和人细胞株表达体系表达目的蛋白和蛋白复合体，利用亲和层析、离子交换和凝胶层析法等方法分离纯化目的蛋白。 4.2) 蛋白质晶体生长和结构解析 将获得的高纯度、均一的、稳定的蛋白经过系统全面的生长条件筛选，并将初步得到的蛋白晶体进行生长条件优化，采用X射线方法结合其他生物物理学手段测定、分析这些蛋白质、蛋白质复合体以及蛋白质复杂体系的三维精细结构。具体可以利用重原子浸泡，分子置换，SAD（single wavelength anomalous diffraction）或MAD（multiple wavelength anomalous diffraction）等方法解析初步位相，然后利用CNS（Crystallography and NMR Suite）或CCP4 package进行结构解析和分析比较，为深入了解抗病毒免疫调节作用机制和治疗靶点的筛选提供结构基础。 4.3) 基于蛋白质结构的功能研究 利用多种生物化学和分子生物学、免疫学、细胞生物学的技术和方法对上述结构解析蛋白的抗病毒特性及机制等进行研究，进一步确定靶蛋白在自身免疫中的作用途径和机制，分析蛋白的结构与功能间的关系。其中，细胞表面信号分子受体的鉴定是富于挑战性的，我们计划采用免疫沉淀、Expression cloning、cross link等不同方法并行的策略，寻找具有炎症抑制作用的分泌蛋白SI-CLP在细胞表面的受体，解析其蛋白-受体的结构，明确其作用通路，以帮助我们明确其在自身免疫调控中的分子机制。 3．本项目创新性与特色 本项目的创新性和特色主要表现在三个方面： 1）本项目研究内容是基于本领域的最新国际前沿进展，项目组成员也都具备很强的工作基础，因此，本项目预期将发现抗病毒先天免疫应答与调节过程中新的重要蛋白、解析若干关键蛋白的晶体结构、揭示一些蛋白的新功能及其新机制。这些新蛋白、新结构、新机制的发现将会对抗病毒先天免疫这一生命科学前沿与热点领域做出重要贡献； 2）过去的抗病毒先天免疫研究主要是针对宿主蛋白和病毒本身对宿主蛋白的改变，而本项目还将研究病毒RNA加工酶对病毒本身的保护性加工修饰以及由此引起的免疫逃逸机制，这是一个崭新的研究领域，因此为本项目的一个明显特色； 3）本项目把前沿基础研究与实际应用紧密结合起来，所发现的新结构和新功能将为药物设计提供新的靶标与理论基础，而所建立的蛋白功能筛选与测定系统将可以直接成为抗病毒药物高通量筛选平台。 对于该项目具体研究工作的创新性和特色，举例说明如下： 以RLR信号分子的关键结构域CARD为诱饵，筛选信号通路分子和相关蛋白，可以比较系统研究该信号通路。以抗病毒信号通路信号分子相互作用为对象，尝试解析蛋白－蛋白相互作用的结构是本课题研究的一个重要特色。建立HCV敏感细胞系统，筛选能够被HCV丝氨酸蛋白酶NS3/4A切割的宿主蛋白的方法具有创新点。 病毒基因组修饰引起病毒逃逸先天免疫识别的研究是个崭新领域，本项目在冠状病毒研究方面已经有很好的积累，建立了一套测定病毒非结构蛋白功能和RNA末端修饰的方法，利用安全型SARS冠状病毒复制子可以构建影响RNA末端修饰的各种突变体。因此，在此基础上研究病毒RNA末端修饰与病毒免疫逃逸的关系是本项目的特色之一，在基础理论上具有明显创新性，并有望建立抗病毒药物筛选体系。 系统地研究先天免疫中识别胞内病毒核酸的模式识别受体及其所介导的信号通路中重要信号分子和相应功能复合物的三维晶体结构，揭示特异性识别胞质内病毒核酸的蛋白质活性位点及其激活免疫系统的结构基础，阐明病毒感染引起先天免疫激活的相关蛋白结构变化过程，结合对重要蛋白质例如VISA和MITA等的结构生物学解析，丰富对细胞抗病毒先天免疫识别与应答的分子机制的认识，为抗病毒药物筛选、新型抗病毒疫苗和分子佐剂设计提供理论依据和新的思路。因此，本项目从新型模式识别受体与病原相关的分子模式鉴定、结构与功能及其相互关系研究、蛋白质及其功能复合物三维结构解析，再到相关筛选平台的建立，以及将理论的重大发现应用于抗病毒药物靶标筛选和疫苗及分子佐剂的设计等，这种把解决重大科学问题的创新性理论研究与实际应用相结合的研究策略，是本项目的一大创新和特色。 先天免疫所涉及的蛋白种类繁多，蛋白与蛋白之间的相互作用复杂，所以不论是研究这些蛋白的单体结构还是研究它们之间形成的复合物结构，都将是一个很大的挑战。我们将利用先进的LIC（ligation independent cloning）技术，实现对多个蛋白的快速构建和表达；由于原核和真核表达系统表达蛋白时各具特色和优势，我们拟采取将原核表达系统和真核表达系统整合为一个整体，即先利用原核表达系统获取蛋白的稳定性、溶解度和蛋白的变性复性条件等参数，再经真核表达系统进一步优化，充分利用原核表达快速和真核表达高效的特点，加快获得蛋白晶体的几率和速度。 此外，本课题将结构研究和功能研究有效地结合起来，综合利用生物信息学、分子生物学、免疫学、细胞生物学和结构生物学等多学科的技术和手段，对新识别的在自身免疫调控中具有炎症抑制作用的分泌蛋白SI-CLP进行研究，从不同角度解释SI-CLP蛋白的功能，既从分子水平探讨SI-CLP作用的分子机制和作用途径，并利用免疫性疾病小鼠模型进一步研究SI-CLP蛋白对炎症反应的调节作用，又从临床上检测SI-CLP蛋白与免疫性疾病的相关性，以明确SI-CLP蛋白作为免疫性疾病的临床检测分子marker的可能性和在治疗免疫性疾病中的作用。同时，我们将建立起一整套完善有效筛选先天免疫中相关的功能蛋白的技术平台，用于先天免疫信号通路新功能蛋白的筛选，发现和鉴定与自身免疫相关的用于疾病风险预测及诊断的生物标志物。这种理论与应用研究的紧密结合是本项目的创新点之一。 4．取得重大突破的可行性分析 本项目具备了在生命科学领域从事高水平研究和产生重大突破的前提条件：完善的科研条件，勇于创新的人才队伍，处于学科前沿的科学问题和深厚的前期工作基础。 项目申请人和学术骨干分别来自武汉大学生命科学学院、北京大学生命科学学院、南开大学生命科学学院和第三军医大学。研究工作主要依托于武汉大学病毒学国家重点实验室、北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室和南开大学蛋白质研究平台，这些依托单位不仅具有完善的从事免疫学、病毒学、细胞生物学和蛋白质科学的研究条件和仪器设备，而且近几年在先天免疫领域都取得了国内外瞩目的成绩，形成了非常优良的研究氛围，这为本项目的完成和研究目标的实现提供了重要基础。 本项目申请团队集中了一批在国内外受过良好训练、学科背景优势互补、创新能力强和有丰富研究经历的中青年学术骨干，近几年均在与本申请相关的病毒学和先天免疫或蛋白质科学领域做出了出色工作，均以独立通讯作者或者第一作者身份在国际主流期刊PNAS或者影响因子更高的杂志杂志（如Cell、Immunity等）上发表过与本申请相关的研究论文，表明了该研究团队具有源头创新的能力，这是本项目获得创新性理论研究成果和实现重要突破的原动力和人力保证。 抗病毒先天免疫研究是当今生命科学和生物医学研究的热点和前沿领域，该领域的发展日新月异。在这个快速发展的领域，仍有诸多科学问题亟待解决，因此，在这个科学前沿领域的任何创新和发现都可能成为重大的研究突破。本项目提出的科学问题都是基于本领域研究的最新进展和发展趋势，又都是基于申请人良好的前期工作基础，因此，这些处于本领域前沿的科学问题和我们的前期工作积累保证了本项目能够顺利实施并取得重要研究结果。 5．课题设置 本项目围绕抗病毒先天免疫识别、信号转导与调控、病毒免疫逃逸等关键科学问题，研究相关蛋白质结构和功能及其分子机制。根据针对的科学问题，项目共设立4个课题：1. 抗病毒先天免疫信号转导与调控相关蛋白的系统鉴定和功能研究；2. 病毒感染导致的宿主细胞蛋白的翻译后修饰与功能关系研究；3. 病毒基因组修饰与免疫逃逸相关蛋白的鉴定与功能研究；4. 细胞抗病毒先天免疫识别与应答的结构生物学研究。 课题1为旨在发现抗病毒先天免疫信号转导通路中新的蛋白分子及调节机制，为其它3个课题进行相关蛋白结构功能研究的基础和平台；课题2研究病毒蛋白对宿主细胞的修饰和病毒感染后细胞蛋白质组的改变，其病毒感染部分来自课题3的研究平台，相关蛋白功能的深入研究与课题1和课题2相互交叉；课题3从新的视角研究病毒逃逸先天免疫识别的机制和病毒非结构蛋白功能，与课题2紧密相关，病毒干扰先天免疫信号转导的研究要利用课题1的研究平台，相关蛋白的结构研究与课题4合作进行。课题4从解析抗病毒先天免疫相关蛋白的结构入手，研究模式识别受体、接头蛋白和调控因子行使功能的结构基础和作用机制，其涉及重要蛋白来自以前工作基础和其它3个课题的相关研究；因此，所设置的4个课题分别针对1个科学问题的4个研究层面，研究内容相互交叉与互补。 各课题的主要研究内容、预期目标以及人员组成等分述如下： 课题1：抗病毒先天免疫信号转导与调控相关蛋白的系统鉴定和功能研究 主要研究内容 以抗病毒的RLR信号通路为对象，阐述信号通路的分子机制，揭示信号通路中关键蛋白在抗病毒的先天免疫调节中的功能，包括RLR信号通路分子及其相关蛋白的筛选和克隆，这些分子在抗病毒细胞免疫调节中的作用，抗病毒信号通路的交叉和关联。另外，在体（in vivo）研究抗病毒先天免疫相关分子调控病毒获得性免疫应答的机制，以及抗病毒先天免疫相关分子调控树突状细胞病毒抗原递呈机制等。 五年预期目标 筛选并鉴定2种以上参与RLR通路信号转导与调控的新蛋白分子，揭示关键蛋白在抗病毒先天免疫调节中的作用与机制，阐明RLR信号通路与其它抗病毒信号通路之间的关联，揭示2种以上先天免疫相