2010CB529600-精神分裂症遗传发育问题的临床基础研究 (2).doc

项目名称： 精神分裂症遗传发育问题的临床基础研究 首席科学家： 贺林 上海交通大学 起止年限： 2010年1月-2014年8月 依托部门： 上海市科委 一、研究内容 拟解决的关键科学问题 遗传和环境因素共同决定着脑的早期发育和成熟后精神分裂症的发生，相应的异常基因功能导致了高级的神经系统活动出现障碍，如注意力、社会适应力等；相应的环境作用则加快了异常表型的产生。这一复杂而精细的过程，往往表现于神经元生长迁移、轴突导向、树突发育、突触形成、神经递质通路、神经回路、神经新生等环节，从发育早期到成年早期持续发育演化并最终导致疾病的产生。由于孤独症与精神分裂症具有类似的遗传机制、临床表现及治疗手段，但与早期发育相关度更大，持续发育的异常则可能导致精神分裂症，在此引发出了非常有意思的联想，即为什么精神分裂症从具备相关基因到获得症状间存在着一种累积效应？是什么机制或因素导致了这种“累积”或滞后现象的产生？因此孤独症可以作为内参加深对精神分裂症的认识和理解。本项目是以“涉及遗传发育中与疾病相关的关键分子、基因、信号、途径及神经网络、神经回路和整体行为异常导致精神分裂症发生的机制”为理论基础通过“组学”和表观遗传学等进行多层次多视角的研究。在此基础上，我们将具体研究和回答下列关键问题： 1、 遗传学问题：解决以往的局部研究的不足，首先从全基因组角度寻找和识别什么是中国人群中精神分裂症的决定或易感基因？为什么精神分裂症、孤独症有明显的共享位点？相关基因/基因组失衡引发精神分裂症的机制？哪些基因是构成遗传发育学问题产生的关键基因? 2、 环境问题：相关基因单独或与环境因素交互作用引起遗传发育过程中功能变化的构成基础?表观遗传构成遗传与环境的桥梁原理？早期不良应急是如何通过表观遗传在神经发育过程中影响神经网络的构建和影响脑的高级功能？ 以及环境相关基因/基因组失衡引发精神分裂症的机制。 3、 物质载体问题：什么是精神分裂症的物质基础？什么又是对应的神经网络基础？什么是神经网络受损或异常与精神分裂症发生的相关性?如何认识相关基因发生异常的神经元生长迁移、形态、突触功能、神经递质通路的对应变化以及与功能和行为紊乱形成的关系？如何认识相关基因发生异常的神经元生长迁移、形态、突触功能、神经递质通路的对应变化以及与功能和行为紊乱形成的关系。 4、 致病机理问题：精神分裂症的致病遗传发育学基础？是否可以通过动物模型研究已知精神分裂症致病基因引起的神经发育学改变、行为学异常、神经回路变化和对应的致病机理是什么？为什么DSC1基因的断裂与精神分裂症直接相关？ 5、 预警、预防与治疗问题： 能否找到干预与修复“受累”神经回路的新思路？能否为精神分裂症找到进行早期预警、早期预防、早期治疗、少复发、低致残，以及个体化医疗防治新策略提供坚实的理论依据？ 主要研究内容： (1)、 对精神分裂症(孤独症)样品进行全基因组芯片的关联和CNV分析，进一步对证实了候选基因进行遗传学分析。对精神分裂症(孤独症)设计多重检查方法，确定中国人群中的基因组失衡、基因表达及甲基化水平异常，探察早预警、早预防和早治疗的生物标记物。 (2)、 利用表达芯片建立出生前营养缺乏、唐山地震等时期出生的成年精神分裂症患者的小RNA和蛋白、基因表达及甲基化/乙酰化、基因组失衡谱系，通过差异寻找预测精神分裂症的生物标记物。 (3)、 建立出生前营养缺乏等环境因素下的饥荒鼠模型，发现孕鼠和胎鼠器官中基因表达、基因甲基化和蛋白改变的特征，分析表观遗传起到连接遗传与环境（营养缺乏）作用的机制。 (4)、 分析SNPs和/或单体型与精神分裂症发病和临床疗效的关系，观察药物疗效差异所对应的特异蛋白、甲基化/乙酰化水平的动态变化。建立抗精神分裂症药物治疗鼠器官中异常基因、蛋白表达和基因甲基化/乙酰化谱系，摸索特异性治疗途径。 (5)、 对精神分裂症（孤独症）相关基因及其各种选择性剪接产物，进行亚细胞定位、功能验证，并研究其如何影响其他蛋白的功能和信号转导。通过体内外实验，观察相关基因表达水平改变后，对神经元生长迁移、轴突导向、树突修剪、突触形成/成熟和细胞与细胞之间相互作用的机制，认识精神分裂症的形成机制。 (6)、 选择2-3个相关基因构建敲除、点突变敲入或过表达等转基因的精神分裂症动物模型。确定这些小鼠中与神经递质分泌密切相关的突触发育与可塑性变化的形态与功能特征及行为学变化，并根据表达模式的时间和空间变化预测相关基因在神经发育过程的作用，阐述目标基因对精神分裂症大脑皮层模式形成和神经回路的影响。 (7)、 利用多种DISC1、DISC1/GFP、DISC1/FosGFP双重转基因小鼠，结合抗精神分裂症药物，研究DISC1功能在不同神经发育时间对神经形态、突触功能、神经电生理特性、海马神经回路特性改变及行为学异常的作用机制。利用DISC1、ErbB4等转基因、定位knockdown动物模型，揭示DISC1基因功能障碍所导致的成年期海马神经新生缺陷与精神分裂症相关行为学的关系。 (8)、 研究饥荒鼠后代的神经递质受体、功能、脑代谢及精神分裂症相关行为学改变。研究MK-801/抗精神分裂症药物大鼠的NMDA受体占有率及脑组织不同区域NMDA受体分布和葡萄糖代谢特征，利用FosGFP转基因小鼠建立MK-801小鼠模型并进行分子生化、神经回路、电生理、行为学研究，认识环境影响后的遗传效应。 (9)、 完善“光-神经界面”技术并制备多种新型针对神经细胞的光敏感型质粒载体。利用立体定向技术，评价多种药物作用下MK-801大鼠中光刺激对病理及不同药物作用状态下动物的类似精神分裂症行为改善，在体记录不同波长的光调控前后的动物模型事件相关电位的变化，如有可能，将在灵长类动物模型中进一步评价相关疗效，为精神分裂症的干预与治疗奠定实践基础。 (10)、 对相关脑区进行常规光镜、电镜形态学分析以及急性脑片组织水平上的基因表达、电生理学和神经回路上的研究，全面地理解精神分裂症的病理生理特征，及其分子和细胞调控机制，从而探讨此类疾病神经回路水平上的新的治疗机制；从DNA、单细胞、动物整体水平三方面评估光敏感型基因ChR2和NpHR表达于哺乳动物体内和激光刺激特定的神经回路后动物的安全性。通过对机体个体差异的分析与研究，提供个体化治疗的理论依据。 二、预期目标 总体目标： 本项目旨在分子、网络、整体三个层次、体内体外两个侧面及遗传环境两个视角对精神分裂症的遗传发育、发生机制取得重要认识，在光感基因-神经调控等干预和治疗途径有重要进展，在精神分裂症的遗传发育问题的解决上有所突破，并为将来发现具有发明专利的临床精神分裂症早期预警、早期预防、早期治疗、少复发、低致残，以及个体化医疗防治新策略提供临床理论基础。 通过本项目的实施，将在我国形成一支高度互补、密切合作的高水平创新学术团队，并通过合作研究强化各个单位已有的优势与特色，为多个研究基地的建设和发展打下坚实基础，凝聚起一股宝贵的思想和人力财富，使我国在精神疾病研究和治疗领域占据国际领先地位。 五年预期目标： 1、 在分子层次，定位与克隆2-6个精神分裂症的染色体异常区域和易感基因，明确全基因组精神分裂症（孤独症）基因组失衡及易感基因或致病基因的甲基化修饰情况。建立不同亚型精神分裂症的小RNA和基因表达数据库，力争建立并验证精神分裂症的新型基因筛查和诊断技术。利用出生前营养不良精神分裂症患者的遗传数据库，明确这些患者的基因表达/甲基化、基因组失衡与一般患者的差异，观察出生前营养不良对孕幼鼠基因和蛋白水平等的影响。寻找早期诊断与疗效评价模式指导下临床个体化治疗的生物遗传标记。利用抗精神分裂症药物的鼠模型，重点发现精神分裂症（孤独症）相关基因在脑内基因、蛋白及基因甲基化/乙酰化水平与药物相关性。研究多个遗传因素和环境因素对精神分裂症患病危险度及治疗效果的生物信息学综合评估体系，为精神分裂症的神经发育机制和干预手段研究提供线索。 2、 在网络层次，确定5-10个可能对神经发育中某些重要分子和信号通路起特定调节作用的候选基因，发现新的候选非编码RNA，找到在人脑组织细胞各主要发育阶段中，各目标基因选择性剪接的表达谱。初步确定与目标基因作用的相关蛋白，对其在神经发育中的可能功能进行预测。进一步确定目标基因在神经发育中细胞水平的功能，建立相关基因、RNA、蛋白质的调控网络，形成目标基因与精神分裂症关系的分子细胞水平的模型。在组织和器官水平上对目标基因在中枢神经系统发育过程中的功能进一步验证。从神经调控网络层次上为精神分裂症药物的发现提供细胞内或细胞外的靶点。 3、 在整体层次，通过特有的定时开关DISC1转基因鼠模型，动态地了解这一主要精神分裂症相关基因的神经细胞形态及疾病相关行为学改变，同时找到神经电生理特性及活体海马神经回路特性改变与精神分裂症的关系。通过DISC1 /GFP、DISC1/FosGFP 双重转基因鼠，了解与精神分裂症相关的神经元形态改变及活体行为与突触功能的关系，发现抗精神分裂症药物可能的作用靶点和信号途径。利用DISC1、ErbB4等转基因/基因敲除及特定脑区knockdown的动物模型，重点发现基因功能障碍引起的成年期海马“神经新生”缺陷，明确成年期“神经新生”与精神分裂症发生的关系。利用饥荒鼠等模型，重点关注成年后脑内神经递质受体及脑代谢特征的变化，结合行为学结果说明易感自然和社会环境因素对后期精神分裂症发生的促进作用。利用MK-801及FosGFP转基因鼠模型，说明谷氨酸神经递质系统和脑代谢异常与精神分裂症发生的关系。 4、 在疾病机理与神经回路干预与修复方面，通过使用光感基因-神经调控设计并制备至少5种不同(启动子)的携带有光敏感基因（ChR2或NpHR）的光敏感型质粒载体，建立啮齿类动物类精神分裂症模型。在精神分裂症动物模型中建立靶点立体定位技术，结合“光感基因-神经调控界面”技术和在体记录技术及PET/CT与SPECT评价脑神经递质受体与代谢表现。研究光调控特定神经回路对精神分裂症模型鼠及抗精神分裂症药物和尼古丁类似物作用下动物行为和病理神经回路的影响，并完成动物行为学的评估。光感基因神经调控技术结合急性脑片记录技术研究疾病模型动物中神经回路的特征，以及在体光调控后神经回路功能特征的变化。对光感基因神经调控技术在啮齿类动物中应用的安全性进行评估。在条件允许的情况下，对治疗效果通过灵长类动物进行重复和评估。 5、 量化考核指标：以通讯作者在SCI和国内核心杂志发表论文80篇以上,在国际一流学术期刊（IF>10）发表论文8-12篇，（IF>5）杂志发表论文30-50篇，国内和国际(PCT)专利受理或授权15-30项专利。 6、 人才培养：培养硕士博士65-80名，博士后若干名，国家杰出青年基金获得者、教育部“长江学者奖励计划”教授、中科院“百人计划”等各级学术带头人4-8名。 三、研究方案 1）学术思路： 目前研究的结果表明，精神分裂症是遗传因素单独或遗传与环境因素通过表观遗传学搭建的桥梁所引发，发生的核心由遗传发育过程体现。要很好地解决前文所提到的科学问题，我们将在相互交叠的几个层面对精神分裂症的临床基础问题展开研究（总体研究方案图）。来自临床的的问题，通过实验室解答又回到临床，有效地形成病床-实验桌-病床循环，为精神分裂症的早预警、早预防、早治疗的终目标提供最直接的科学依据。 遗传 基本遗传学问题 精神分裂症遗传发育问题的临床基础研究 遗传与环境的交互作用 神经网络异常的基础 疾病产生的机理 防治等干预手段 早预警　　　早预防　　　早治疗 遗传发育 表观遗传学 环境 分子 环境 网络 整体 防治 基础 临床 总体研究方案图 ２）技术途径： 总体技术路线参照总体研究方案图和课题设置图。在精神分裂症研究的技术途径上，本项目集中了该领域具有世界先进技术的多名成员，拥有独特的创新性技术优势和科研积累，例如两位课题负责人已经在国际上率先完成了精神分裂症（孤独症）的全基因组扫描，并具备Affymatrix官方实验室及最新的全基因组芯片操作技术，如ABI PRISM 3100 DNA 分析仪(Appliedbiosystems) 、CGH array 、SNP Hybrid array、Affymetrix超高通量SNP芯片分型工作平台、DNA测序平台Illumina Genome analyzer 2.0，定量MLPA及高通量测序、质谱技术；建立了原代培养神经元电转方法（Amaxa Nucleofector，具有极高的转染效率），多种神经细胞组织培养技术（Olfactory bulb migration assay、growth cone turning assay、growth cone collapse assay、neurite outgrowth assay等），鸡胚显微注射，小鼠子宫内胚胎电转、RNAi knocking down/转基因和基因敲除等技术；制备了多种DISC1 可诱导转基因鼠，是世界上唯一的可以迅速开关DISC1蛋白功能的转基因鼠，可以在小鼠胚胎晚期及出生后的一生中任何一天开关DISC1蛋白功能, 从而研究DISC1功能在不同神经发育时间对精神分裂症相关动物行为学异常的作用机制；制备的DISC1/GFP双重转基因鼠，除了可以利用共聚焦显微镜来探讨常见于精神分裂症患者的神经元的树突结构和突触密度变化，更可以利用双光子显微镜调查活体小鼠在不同行为实验中突触的动态变化，这是一项非常前沿的工作，将为我们带来对精神分裂症许多全新的认识；制备的DISC1/FosGFP双重转基因鼠，使我们可以调查疾病模型鼠是否像疾病患者使用异常脑区处理行为学任务，这也是世界上独一无二的，保证了我们研究的领先性；MicroPET/CT目前主要应用在癌症和心血管疾病研究中，在精神分裂症动物模型研究领域中尚不多见。此次应用在精神分裂症动物模型神经递质受体的研究，将为该病机制研究提供新的证据和有力工具；光感基因神经调控技术是对治疗精神分裂症干预和防治等应用的基础研究，国内外尚无报导。该项技术可通过用不同波长的光调控某种疾病中只具有治疗作用的细胞亚群的活性而实施治疗，同时，由于根本不影响无治疗作用的细胞群的功能，从而能在最大程度上降低治疗的副作用，具备细胞水平上特异性和时间上毫秒水平上的精确性等特点。该技术体系在临床疾病治疗中具有巨大的应用前景，可以揭示疾病在神经回路水平上的发病机制，从而探索疾病的新治疗靶点。 ３）创新点与特色： 本项目的创新点表现在多个方面：本项目为我国精神分裂症系统和完整的研究提供了恰如其分的时间节点，同时为推动精神分裂症的临床医学转化提供了必要的准备工作；项目不但融入了最新的技术方法，而且特别注重尝试不同交叉学科在精神分裂症研究中的应用；项目中增加了大量活体和动态的精神分裂症相关研究，这为项目中临床前防治和干预的创新手段和方法的尝试提供了崭新的机会；项目内容涵盖广泛，从微观到整体、从动物到患者、从儿童到成人、从体外到体内、从环境到遗传、从零散数据到信息体系、从基础到临床等等，都标志着精神分裂症的系统生物学研究和临床转化时代的来临。 项目的特色是紧扣国家重大需求，以精神分裂症“早预警、早预防、早治疗”的目标为研究动力和设计依据。在具体研究中，项目组把握精神分裂症发生的遗传发育这根核心线，以孤独症为内参，在相互交叠的几个层面对精神分裂症的临床基础问题展开研究，努力破解遗传因素单独或与环境因素通过表观遗传学搭建的桥梁所引发精神异常和神经网络/神经回路“受累”的机制，为临床问题寻找答案，完成病床-实验桌-病床的健康循环。 ４）可行性分析： 本项目是对评为“优”的上一“973”项目《中国人口出生缺陷的遗传与环境可控性研究》中的子课题“遗传与营养等因素对导致精神疾病发生机理的研究”的拓展和深入。结题项目取得了显著的进展，如发表在JAMA（2005）期刊上的证实了“出生前的营养缺乏会显著增加成年后精神分裂症的发病风险”的结果等。项目成员的后继工作中与国际实验室合作完成了精神分裂症全基因组扫描分析，结果发表在Nature Genetics(2008)，对精神分裂症CNV的分析发表在Molecular Psychiatry (2008)。此次申请的项目是对前期项目和研究成果很好的延续与发展。 参与本项目的科学家积累了大量前期工作的基础，近五年在New England Journal of Medicine, JAMA，Lancet(接收修改), Cell, Nature，Nature Medicine, Nature Genetics，Nauture Methods, Neuron，American Journal of Human Genetics, Current Biology, Molecular Psychiatry, Proc Natl Acad Sci USA, American Journal of Psychiatry, EMBO J, Biol Psychiatry等世界优秀杂志上发表与项目相关的论文300多篇。参与本项目的研究单位和学术队伍是有机自然组成的整体，成员单位拥有一流遗传资源库、信息资源库、病例资源库和多个研究平台，能保证本次研究有足够的精神疾病样品，在疾病国际诊断标准和疗效评估方面具有丰富的经验和实力。成员单位同时还具备有实力的研究实验室、医院基地、仪器设备和研究队伍等，项目课题组分别依托5个国家重点实验室（遗传工程、医学遗传学、医学分子生物学、生物大分子、脑与认知科学）、1个教育部重点实验室（遗传发育与精神神经疾病）、1个卫生部重点实验室（精神卫生学）、1个中国科学院重点实验室(生物医学信息与健康工程学)、1个中国科学院蛋白质研究平台和1个国家985工程重点建设创新技术平台。项目成员还与实力雄厚、技术一流的国际实验室保持着密切的合作关系。 本项目学术骨干的年龄、结构和配置等合理，都是积极进取的中青年研究工作者及我国在本领域中的中坚力量，在精神分裂症研究的前沿领域具有创新优势和优越的科研成绩。基于上述分析，项目目标明确、技术途径新颖并切实可行，我们认为项目具有低风险和取得重大突破的可行性。 5）课题设置： 课题1、精神分裂症及孤独症相关基因的发现及其遗传发育的分子机制 预期目标： 总体目标是利用传统遗传学和组学/表观遗传学技术对精神分裂症和孤独症的易感基因/甲基化、基因组失衡及小RNA进行检查，并对确定的候选基因及小RNA进行部分功能研究及临床应用。具体目标：1）、定位与克隆2-6个精神分裂症家系的染色体异常及易感基因，并完成验证和功能性实验。2)、明确全基因组精神分裂症（孤独症）基因组失衡及易感基因的甲基化修饰情况。3)、筛选到一批精神分裂症特异性表达或表达差异明显的小RNA和基因，建立不同亚型精神分裂症的小RNA表达数据库。4)、通过遗传标记（诊断芯片）结合神经影像新技术（sMRI／fMRI-EEG／ERP），建立并验证精神分裂症（孤独症）的新型基因筛查和诊断技术。5)、通过本项目中确定的早期识别指标，结合课题2研究患者的遗传、环境因素交互作用机制，推动最终阐明精神分裂症的遗传发育机制。6）、发表论文14-18篇, 申请发明专利3-6项。 研究内容： 1、 对精神分裂症家系的细胞采用高分辨染色体核型和显带技术，寻找与精神分裂症相关的染色体异常，并采用FISH等技术精细定位并验证致病位点。 2、 利用illumina全基因组分型实验平台，对精神分裂症家系样本进行基因分型，连锁分析，进一步通过家系发现精神分裂症可能连锁的新区域、验证我们新发现的12p12-q13区域和已报道的区域，如1和6号染色体等。利用target sequence的高通量测序等方法，对可能连锁或相关的区域测序，寻找易感基因。 3、 用国际上最新的实验技术平台如SNP array 6.0芯片或者CGH array 244k芯片，在全基因组范围内筛查中国人群中与精神分裂症和孤独症关联的基因组失衡, 包括CNV，SNP和LOH。针对性地在中国人群中对国际上已确认的阳性关联位点进行验证，从而确定那些在中国人群中出现较多的遗传病因。 4、 针对性地设计一个高通量综合性的鉴定基因组失衡的微阵列芯片系统检测技术平台, 其技术关键是探针的筛选, 既要包含所有与人体精神和神经发育相关的基因和基因组区域, 又要尽量避免良性基因拷贝数变异（CNV）, 以达到全面检测重复发生或随机发生的基因组失衡位点的目标。并在中国人群中对精神分裂症和孤独症病例进行扫描验证。 5、 针对性地设计一个低通量目标性的鉴定基因组失衡的多重检测方法, 其技术关键是将几十个遗传位点在一个检测系统同步进行分析, 以达到高效、特异、灵敏、简便、低耗, 检测已知基因组失衡位点的目标。并在临床试验中对精神分裂症和孤独症病例进行基因筛查和诊断。 6、 筛查脑内表达的小RNA基因附近SNP位点，利用illumina公司最新的小RNA和表达芯片，结合定量PCR技术寻找病例和对照样本中存在的表达及调控差异基因。利用illumina公司的DNA甲基化分析芯片，进行全基因组范围内大规模的甲基化分析，比较病例与对照样本之间甲基化修饰的存在差异基因。 7、 对重复发生的或者新发生的拷贝数变异区域上的基因进行关联分析，确定致病基因，采用实时荧光定量PCR或“构建定点突变体-体外表达-蛋白质检测”的方法进行易感基因的功能的研究，并进一步在细胞或者模式动物水平上研究基因在遗传发育中的作用机制。 8、 与其他课题组合作，对全基因组芯片上百万余个检测位点所得到的海量数据，在全基因组范围内检测到的CNV、SNP、LOH及甲基化区域等的基础上, 注重生物信息学的发掘和进一步研究，寻找早预警、早预防等生物学标志物。 承担单位：中南大学、复旦大学 课题负责人：吴柏林 学术骨干：赵靖平、王红艳、David Saffen、徐秀、陈莉、胡正茂、向新颖、朱赞华、李小平、王浩 经费比例：19.9% 课题2、遗传与环境因素在精神分裂症遗传发育中的交互作用 预期目标： 总体目标是对出生前营养不良、自然和社会环境、抗精神分裂症药物影响下精神分裂症人群和鼠模型中基因、蛋白、小RNA表达和基因组失衡、基因甲基化/乙酰化差异进行分析。通过与“营养、心理正常”等患者比较，观察在精神分裂症发生中表观遗传学对遗传变异和易感环境的交互作用。具体目标：1）、利用出生前营养不良、自然和社会环境影响下的精神分裂症患者的基因、蛋白、小RNA表达和基因甲基化的数据库，明确这些患者的基因表达/甲基化、基因组失衡与“营养正常”患者的差异。2)、通过建立各种营养不良的饥荒鼠模型，观察出生前营养不良对孕幼鼠基因和蛋白表达水平等的影响。3)、对常用抗精神分裂症药物进行药物基因组学和表观遗传学分析，寻找早期诊断与疗效评价模式指导下临床个体化治疗的生物遗传标记。4)、利用抗精神分裂症药物的鼠模型，重点发现精神分裂症（孤独症）相关基因在脑内基因、蛋白及基因甲基化/乙酰化水平与药物相关性。5)、结合课题1研究多个遗传因素和环境因素对精神分裂症患病危险度及治疗效果的生物信息学综合评估体系，为精神分裂症等神经发育机制和干预手段研究提供理论依据。6）、发表论文10-20篇, 申请发明专利1-3项。 研究内容： 1、 利用illumina公司最新的小RNA芯片和Affymetrix公司的表达芯片，对三年自然灾害最严重（出生前营养缺乏模型）、唐山地震等社会心理记录人群中当年出生的成年精神分裂症患者及其一级亲属和匹配正常对照人群进行全基因组范畴内小RNA和候选基因的表达差异分析，并与课题1得到的精神分裂症表达图谱进行比较。 2、 利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳分离质谱鉴定（2DE-MS）技术和基于多维液相色谱质谱技术，开展代谢组学分析，进行“血清双向电泳凝胶蛋白谱”和“血清质谱多肽谱”分析，确定出生前营养缺乏等模型下人群，尤其是精神分裂症患者与营养、心理条件较好条件下出生人群的代谢谱系变化。 3、 对课题1中鉴定的所有精神分裂症易感基因、基因组失衡及甲基化异常，利用代表性的寡核苷酸微芯片分析（ROMA）、高效液相色谱柱（HPLC）、SNP array 6.0芯片或CGH array 244k芯片等技术对出生前营养缺乏的这些精神分裂症患者及其一级亲属和正常对照人群进行验证，寻找与一般精神分裂症患者的共同区域或差异程度。 4、 对孕鼠的食物限制19天，分别建立胚胎期蛋白质缺乏、热量缺乏、维生素A缺乏、叶酸缺乏等出生前营养缺乏/饥荒鼠模型。取饥荒鼠模型及对照组中孕鼠胎盘和羊水及胎鼠的脑和肝脏等器官进行基因甲基化和蛋白质组学研究，以发现特征性的改变。应用表达芯片筛查饥荒鼠模型及对照组中孕鼠胎盘和羊水及胎鼠的脑和肝脏等器官的基因表达差异。 5、 研究精神分裂症和孤独症共用治疗药物利培酮和奥氮平等的血药浓度与临床效应的关系与差异。对疾病严重程度、药物疗效和副作用根据PANSS、GAF、CGI、AIMS量表分组，针对课题1筛选出来的候选基因和营养环境，分析SNPs和/或单体型与精神分裂症发病和临床疗效的关系，发现与精神分裂症早期诊断与疗效评价相关的易感性基因和环境因素。 6、 对药物疗效差异各组患者及正常对照人群进行蛋白质组学分析。利用高效液相色谱柱（HPLC）法、MeDIP-chip技术、重亚硫酸盐测序法（MSP）、染色质免疫沉淀法对全基因组芯片技术提示的易感基因进一步验证基因甲基化及组蛋白的乙酰化/去乙酰化水平，并进一步监测药物治疗前后的特异蛋白、甲基化/乙酰化水平的动态变化，对相应的环境影响效率进行评估。 7、 建立利培酮和奥氮平给药的精神分裂症治疗鼠模型。在相同遗传背景/不同环境下和不同遗传背景/相同环境下，取治疗鼠及对照组中血液、脑皮层和海马等器官进行基因甲基化/乙酰化和蛋白质组学研究，以发现特征性的改变。筛查治疗鼠及对照组中血液、脑皮层和海马等器官的基因表达差异，通过与疾病相关的差异表达基因验证药物疗效的遗传与环境影响作用。 8、 建立基因甲基化、蛋白和小RNA的数据库，结合不同的环境因素进行多因素、多位点和多途径联合作用分析，建立相应的多元Logistic回归模型，得到携带与不携带某种异常遗传因素与易感环境因素组合的精神分裂症患病危险度及治疗效果的综合评估体系。结合课题1，对精神分裂症的生物信息学、临床分子标记和个体化治疗有效性进行发掘和深入研究。 承担单位：上海交通大学、东南大学 课题负责人：贺林 学术骨干：杜亚松、贺光、张向荣、高凌寒、李兴旺、柏峰 经费比例：22.8% 课题3、以神经发育相关基因为中心的调控网络失衡导致精神分裂症的机制研究 预期目标： 总体目标是建立以精神分裂症（孤独症）神经发育相关基因及其各种剪接体为中心的调控网络，系统地解释其在精神分裂症、孤独症的发生和进展中共有或特有的分子机制，为临床药物的发现提供靶点。具体目标：1）、确定5-10个可能对神经发育中某些重要分子和信号通路起特定调节作用的候选基因，为下游功能研究提供目标。发现新的候选非编码RNA，找到在人脑各主要发育阶段中，各目标基因选择性剪接的表达谱。2)、初步确定与目标基因作用的相关蛋白，对其在神经发育中的可能功能进行预测。进一步确定目标基因在神经发育中细胞水平的功能，建立相关基因、RNA、蛋白质的调控网络，形成目标基因与精神分裂症关系的分子细胞水平的模型。3)、在组织和器官水平上对目标基因在中枢神经系统发育过程中的功能进一步验证。4)、完成1-2个重要基因的转基因小鼠模型的构建，在此课题期间完成发现的2-3个目标基因的功能和表达调控的研究。5)、结合课题4利用更多的动物模型，提出精神分裂症、孤独症的共有的和/或特有的病理模型。6）、发表论文10-12篇, 申请发明专利1-2项。 研究内容： 1、 对精神分裂症（孤独症）相关基因及其网络进行分析、整合，确定进行下游功能研究的目标基因。运用RT-PCR，Realtime PCR等手段在成人脑和胚胎脑中研究目标基因产物及其相关基因的RNA各种选择性剪接形式，功能突变及小RNA对其RNA水平和稳定性的调控，利用体外培养的细胞系和原代培养神经元对目标基因及其各类选择性剪接表达产物进行亚细胞定位、功能验证。 2、 通过酵母双杂、酵母三杂、免疫共沉淀、质谱等，筛选与目标基因产物有相互作用的蛋白或RNA。运用细胞转染、免疫共沉淀、Western blot、免疫荧光染色、激酶活性测定等方法，研究目标基因产物如何影响其它蛋白的功能和信号转导。 3、 在体外培养神经瘤细胞和原代神经元中通过电转相应的质粒，提升或者降低相关基因的表达水平，用荧光标记和显微技术长时间观察活细胞生长、迁移情况，以及细胞骨架的变化。在体实验利用鸡胚显微注射和电转技术，过表达或下调目标基因，研究其对神经元生长迁移、轴突导向、树突修剪、突触形成和细胞与细胞之间相互作用的机制，以获得目标基因调控神经发育的最直接证据。 4、 利用电生理技术观察目标基因对于突触可塑性的影响。对于其中验证为阳性的基因，通过全基因组表达谱芯片的分析研究，深入了解相关基因在神经发育过程所起作用的信号通路和调控网络。 5、 利用子宫内胚胎电转技术，在胚胎不同时期，在特定的脑区通过电转相关基因的过表达或者RNA knocking down干扰质粒，观察出生后不同时间点电转阳性神经元细胞增殖/分化、细胞迁移、轴突的生长和投射、树突发育以及突触发育和成熟的变化，在体内进一步确认目标基因的作用。 6、 确定精神分裂症相关的关键基因后，将根据其基因功能和致病机理，选择2-3个基因构建相关的敲除、点突变敲入或过表达等转基因小鼠，建立精神分裂症的动物模型。利用电镜和膜片钳技术确定这些小鼠中与递质分泌密切相关的突触发育与可塑性变化的形态与功能特征。 7、 利用原位杂交和免疫组化技术，确定相关基因在野生型小鼠脑内不同发育期的表达模式，并根据表达模式的时间和空间变化预测相关基因在神经发育过程的作用。观察转基因小鼠与精神分裂症相关的行为学实验的变化。利用免疫组化技术了解转基因小鼠在脑内细胞和组织形态结构上的变化以及相关蛋白表达水平的改变，以阐明目标基因对大脑皮层模式形成和神经网络的影响。 8、 结合以上几个方向和其它课题的研究成果，揭示候选基因功能、神经调控网络与精神分裂症（孤独症）的关系，提出精神分裂症及孤独症的共有的和/或特有的病理模型。 承担单位：中国科学院生物物理研究所、中国医学科学院基础医学研究所 课题负责人：许琪 学术骨干：叶海虹、刘江红、赵秀丽、朱笠 经费比例：17.6% 课题4、精神分裂症动物模型的神经发育及行为学基础研究 预期目标： 总体目标是利用DISC1可诱导转基因、饥荒鼠和MK-801等典型精神分裂症动物模型，系统地研究突触功能、神经细胞形态、神经回路、神经新生及动物行为异常等与疾病发生的联系。具体目标：1）、通过特有的定时开关DISC1转基因鼠模型，了解这一主要精神分裂症相关基因导致的神经细胞形态及疾病相关行为学改变，同时发现神经电生理特性及海马神经回路特性改变与精神分裂症的关系, 发现抗精神分裂症药物可能的作用靶点和信号途径。2)、通过DISC1/GFP、DISC1/FosGFP双重转基因鼠，了解与精神分裂症相关的神经突触动态变化及在不同行为任务中激活的神经回路和脑区与行为学异常的关系。3)、利用DISC1、ErbB4等转基因/基因敲除及特定脑区knockdown的动物模型，重点发现基因功能障碍引起的成年期海马“神经新生”缺陷，明确成年期“神经新生”与精神分裂症发生的关系。4)、利用饥荒鼠模型，重点关注成年后脑内神经递质受体及脑代谢特征的变化，结合行为学结果说明易感环境因素对后期精神分裂症发生的交互作用。5)、利用MK-801及FosGFP转基因鼠模型，说明谷氨酸神经递质系统和脑代谢异常与精神分裂症发生的关系。6）、发表论文10-15篇, 申请发明专利2-4项。 研究内容： 1、 对DISC1-CC转基因小鼠在生后第7天进行诱导后，观察小鼠与精神分裂症相关的神经细胞形态改变以及成年后社交能力障碍、空间工作记忆障碍等与疾病相关的症状。开关DISC1蛋白功能的转基因鼠，跟踪小鼠胚胎晚期及生后一生中任何一天开关的DISC1蛋白功能, 从而研究DISC1功能在不同神经发育时间对精神分裂症相关动物行为学异常的作用机制。 2、 利用4种不同的DISC1可诱导小鼠（DISC1-CC、DISC1-N、DISC1-CN、DISC1-C）,诱导阻断内源性DISC1蛋白与不同靶蛋白的结合从而影响不同的分子功能或信号传导通路。在不同神经发育时间点诱导这些转基因小鼠，然后评价DISC1在不同发育阶段的功能障碍对成年鼠的社交特性退化、空间工作记忆降低、抑郁性行为等常见于精神分裂症患者的主要症状的影响机制。 3、 结合课题5中的“光感基因神经调控技术”，利用膜片钳分析DISC1小鼠额叶皮质及海马神经回路的神经可塑性、兴奋性和/或抑制性，以探索特定异常神经回路特征和精神分裂症小鼠行为学输出的关系。高速成像技术将被用于测试海马齿状回与CA1实时活动刺激诱发渗流的比率，以了解海马神经回路特征改变与精神分裂症的关系。 4、 通过DISC1/GFP双重转基因鼠，利用共聚焦显微镜来观察常见于精神分裂症患者的神经元的树突结构和突触密度变化，同时利用双光子显微镜调查活体小鼠在不同行为实验中突触的动态变化。 5、 通过DISC1/FosGFP双重转基因鼠，探测在不同行为任务中激活的神经回路和脑区, 从而揭示在不同神经发育阶段诱导DISC1基因功能障碍是否造成模型鼠类似于精神分裂症患者使用异常脑区或神经回路处理行为学任务。 6、 利用DISC1转基因小鼠研究现有抗精神分裂症药、多巴胺和谷氨酸受体激动剂和拮抗剂对此模型动物的行为学异常的作用机制，并希望借此发现新的治疗靶点或信号通路。 7、 利用转基因鼠及获得的DISC1特异shRNA knockdown病毒载体进行脑区定位注入实验, 以揭示DISC1基因功能障碍所导致的成年期海马神经新生缺陷与精神分裂症相关行为学的关系，明确DISC1基因及成年期“神经新生”对精神分裂症的影响机制。 8、 另外制备至少1-3个精神分裂症易感基因(如ErbB4) 转基因或基因敲除小鼠模型，并阐明该基因作用的分子机制。 9、 利用课题2中的饥荒鼠模型，测定及评价饥荒孕鼠后代，即存在出生前营养不良成年大鼠模型的社会性接触行为及空间性工作记忆等行为，并利用Micro-PET/CT显像，检测其不同脑功能区的血流灌注和糖代谢的变化，以及特征性神经受体（如DA、5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A，Glu、GABA等）的密度、结合力及摄取能力改变。 10、 利用地卓西平马来酸盐/MK-801精神分裂症大鼠模型，建立MK-801的剂量与NMDA受体占有率的关系及葡萄糖代谢变化。选择合适的同位素标记化合物（示踪剂），通过micro PET/CT分析大鼠脑组织不同区域NMDA受体分布特征。联合分析MK-801与抗精神病药物对大鼠脑组织中NMDA受体分布和葡萄糖代谢的影响，利用FosGFP转基因小鼠建立MK-801小鼠模型并进行分子生化、神经回路、电生理、行为学研究。 承担单位：上海交通大学、北京大学 课题负责人：李卫东 学术骨干：万春玲、杜晶、岳伟华、贾美香、朱慧、季珏 经费比例：22.1% 课题5、“光感基因神经调控”技术等对精神分裂症相关异常神经回路的防治研究 预期目标： 总体目标是将光感基因-神经调控技术与分子影像学实时定量分析技术等应用于精神分裂症的动物模型中，通过蓝光或黄光激活或抑制特定的神经回路，以实现修复病理神经回路功能和治疗疾病的目的。具体目标：1）、结合“光感基因