2009CB941500-植物重要器官形成的遗传和表观遗传调控机理研究 (2).doc

项目名称： 植物重要器官形成的遗传和表观遗传调控机理研究 首席科学家： 曹晓风 中国科学院遗传与发育生物学研究所 起止年限： 2009.1至2013.8 依托部门： 教育部 中国科学院 一、研究内容 作为植物发育生物学中的最重要领域，植物器官形成的研究已成为植物科学中的重要前沿和新的增长点。本项目瞄准这一科学前沿，以保证我国粮食安全的重大需求为导向，采用分子遗传学、表观遗传学、细胞生物学、生物化学和系统生物学等多学科综合研究手段，解析高等植物重要器官形成和大小决定的遗传与表观遗传调控机制和网络，重点阐明器官形成过程中形态建成关键因子的作用机理和信号网络。针对要解决的科学问题，我们将从植物器官特征决定的遗传和表观遗传调控网络、植物重要器官形态建成的调控机制和模型以及重要植物器官大小控制的分子基础三个方面系统研究器官形态建成的分子机制，为实现对植物生长发育调控的遗传改良提供理论依据。其中，这三个课题之间具有内在的联系，花器官决定是花器官发育的前提，而两者均对器官和种子的大小有一定的影响。 1、植物器官特征决定的遗传和表观遗传调控网络 植物器官特征决定受一些关键基因控制，这些基因受到转录、转录后和翻译后等多种水平精细调节。花器官决定是植物从营养生长向生殖发育转变的重要发育过程，并产生花器官。长期以来调控植物开花的分子机制一直是植物发育生物学研究的热点。植物开花时间不仅影响作物的穗数和粒数，还影响生长周期和环境适应性等，是决定作物产量和品质的重要因素之一。赤霉素和自主途径因子是植物自身发育进程调控开花的关键因素，但是对赤霉素如何启动植物开花的了解却非常有限，而表观遗传调控因子在哪些通路、通过哪些靶位点调控开花关键基因还不清楚。赤霉素和自主途径因子如何接受环境信号通过植物自身发育进程来协调开花调控的目前还知之甚少。本项目将从花器官决定入手，综合利用遗传学、细胞生物学、生物化学、蛋白组学以及表观遗传学等手段，通过鉴定参与赤霉素和自主途径的遗传和表观遗传调控因子、解析这些遗传因子之间在各自的途径和与其它途径间相互作用的分子机制、研究表观遗传调控因子通过哪些靶位点调控各种遗传因子，解析各种激素和环境因素如何参与调控植物器官特征决定的遗传和表观遗传调控网络。我们将开展以下三个方面的研究： 1) 赤霉素调控植物开花的分子机制研究。揭示短日照条件下早花突变体的作用机理，初步建立赤霉素促进开花的遗传途径。 赤霉素在植物开花调控中起着重要的作用，拟南芥赤霉素生物合成途径缺失突变体ga1，在短日照条件下不能开花，在拟南芥ga1-3突变体的背景下，敲除赤霉素信号传导重要元件DELLA蛋白，如：ga1-3 gai-t6 rga-t2 三缺失突变体在短日照条件下可以正常开花，表明赤霉素可以通过依赖于DELLA蛋白的GA信号传导途径参与拟南芥短日照开花的调控。化学抑制剂Paclobutrazol（PAC）处理植物能够阻遏赤霉素合成。spy是在含PAC培养基上筛选出的拟南芥突变体。rga spy gal-3三突变体表型分析表明SPY能够增强DELLA蛋白的作用。spy编码的SPINDY蛋白与动物的O连的N-乙酰葡萄糖胺转移酶（O-GlcNAc）高度同源，同野生型相比，敲除SPINDY，植物开花的关键调控因子，如：CO，SOC1和FT等基因转录水平都提高。表明赤霉素还可以通过依赖于SPINDY蛋白途径参与拟南芥短日照开花的调控。赤霉素是通过哪些重要因子和途径启动植物开花的？赤霉素与自主通路因子是如何接受环境信号，并通过植物自身发育进程来协调开花调控的？SPINDY是否是整合赤霉素和光信号（光周期和节律）网路调控植物由营养生长到生殖发育转化的关键节点也有待进一步深入探讨。本项目将重点鉴定SPINDY参与的开花调控的遗传途径中的新成员，并通过这些新成员的互作蛋白研究它们对植物花器官决定的作用机制以及赤霉素与植物环境信号互作调控花器官分化的机理。具体内容包括： (1) 利用pSPY:SPY-GFP的拟南芥转基因材料，通过EMS化学诱变和遗传筛选，获得Paclobutrazol抗性并抑制ga1-t表型的早花pef 突变体和抑制spy3表型的晚花ros突变体。比较ga1-t ros，ga1-t和ga1-t pef突变体间开花时间及开花相关基因的表达差异，进而推测ROS和PEF在调控开花机制中的可能功能。 (2) ROS和PEF基因克隆，分析基因表达模式和抗体制备。分析ROS和PEF对SPINDY或者DELLA蛋白功能的影响。 (3) 通过酵母杂交和免疫共沉淀分析可能与DELLA蛋白质相互作用的蛋白DIP（或基因），深入探讨DIF在植物开花调控中的功能，重点分析这些新成分在控制植物开花中的功能，揭示赤霉素调控植物开花的分子机制。 2) 蛋白质复合体对开花关键基因表达调控的分子机制研究。鉴定蛋白质复合体组分，重点阐述蛋白质复合体对开花关键基因表达调控的分子机制。 前期研究已经表明SPINDY基因可以调控CO基因的表达。进一步的CHIP实验分析表明CO位点染色质区域被修饰，而且这种修饰与SPINDY蛋白相关。酵母双杂交的研究结果也表明SPINDY蛋白可与GI蛋白质相互作用，那么是否SPINDY蛋白通过影响开花关键基因的染色质区域修饰相关的蛋白质复合体形成或组成，进而调控植物由营养生长到生殖发育关键基因的转录？拟南芥PICKLE（PKL）基因可能编码一种CHD3染色质重塑因子，该基因突变具有晚花表型，而PKL如何通过蛋白质互作、或者通过染色质水平调控重要开花基因的启动子来影响其中某个位点的组蛋白的修饰，需要进一步的实验证据。在这里我们将重点鉴定SPINDY和PICKLE的互作蛋白及蛋白复合体，并研究它们是否通过影响蛋白修饰或者染色质重塑在染色质层面调控开花的分子机理。具体内容包括： (1) 通过GI-TAP和SPY-TAP转基因材料，利用生物化学和蛋白质组学分析手段，鉴定SPINDY蛋白质复合体新组分。 (2) 分析T-DNA插入突变体表型，明确SPINDY蛋白对蛋白质复合体形成以及蛋白质复合体形成对关键开花基因染色质修饰的影响，揭示这些新组分对关键开花基因表观遗传调控的分子机制。 (3) 通过蛋白质免疫共沉淀和酵母双杂交分析，分析PICKLE的互作蛋白及蛋白复合体；并将pkl与hac1突变体进行比较，利用ChIP方法分析PKL结合于开花调控因子启动子区域的染色质状态，探讨PKL与HAC1、FLC和LFY在功能上的关系。 3) 蛋白质翻译后修饰调控植物开花过程的表观遗传信号网络研究。解析多种组蛋白翻译后修饰调控植物开花的遗传和表观遗传机理，阐明自主通路感应自身发育进程的信号促进植物开花的机理。 蛋白质翻译后需要进一步修饰方能行使其生物学功能（包括蛋白质的甲基化、乙酰化、糖基化、磷酸化以及泛素化等），这些修饰影响着几乎所有的生命过程，研究表明开花发育不仅受遗传调控，在表观遗传学水平上也受到更为精细的调控。其中，拟南芥中蛋白精氨酸甲基转移酶(AtPRMT5、AtPRMT10和AtPRMT4a/b等)和组蛋白乙酰转移酶AtHAC1都参与了FLC介导的开花调控过程，但是精氨酸甲基化如何在不同组织、不同发育阶段以及在不同条件下的特异底物仍然是个未知数，这些甲基化信号是如何被读取和传导的？甲基化和乙酰化修饰之间的相互作用关系是什么？AtPRMT10蛋白是以二聚体形式存在，能自身甲基化，该蛋白质自身翻译后修饰是如何被调节的？它们又是通过哪些靶基因调控拟南芥开花过程的？对上述问题的回答将解析多种组蛋白翻译后修饰调控植物开花的遗传和表观遗传机理，阐明自主通路感应自身发育进程的信号促进植物开花的机理。本项目将重点鉴定AtPRMT5、AtPRMT10和AtPRMT 4a/b的互作蛋白及蛋白复合体，了解它们是通过修饰哪些因子、通过何种分子机理调控拟南芥开花的。具体内容包括： (1) 在基因组水平上，利用Solexa大规模测序技术，比较野生型Col和atprmt5突变体基因的表达模式，重点分析mRNA可变剪切的变化及其对开花的调控机理。 (2) 构建atprmt5、atprmt10和atprmt4a/4b突变体之间的双、三突变体和与athac1等自主通路突变体之间的多突变体，研究这些基因与拟南芥开花自主通路突变体的遗传关系。 (3) 通过蛋白质免疫共沉淀和酵母双杂交分析，鉴定AtPRMT5、AtPRMT10和AtPRMT 4a/b的互作蛋白及蛋白复合体，在体内外验证这些互作蛋白参与调控拟南芥开花的遗传网络。利用定点突变技术，鉴定参与AtPRMT10蛋白二聚体形成和自身甲基化位点，利用遗传学手段研究AtPRMT10自身翻译后修饰调控开花的机理。 (4) 利用亲和层析，寻找能够特异识别对称性和非对称性双甲基化的精氨酸残基的蛋白，阐明这些甲基化信号是如何被读取和传导以调节拟南芥开花的。 (5) 结合蛋白双向电泳和精氨酸甲基化特异性抗体等分析手段，比较野生型Col和atprmt5、atprmt10和atprmt4a/4b单突变体及其双、三突变体蛋白质甲基化谱式的改变，通过质谱分析出蛋白，进一步在体内、外验证该蛋白是哪种AtPRMT的特异性底物，并通过遗传学、细胞生物学和分子生物学等手段，研究这些蛋白调控拟南芥开花的分子机理。 (6) 利用反向遗传学手段，分离鉴定参与开花调控的新的表观调控因子，揭示这些因子调控植物开花过程的信号网络。 2、植物重要器官形态建成的调控机制和模型 高等植物的器官发生和形态建成是一个连续、不间断的生物学过程，随着发育进程的展开，逐步在细胞、组织和器官等不同的发育层面上完成。花是植物体最重要和复杂的器官，在花器官原基起始以后的发育过程中，经过一系列细胞分裂、功能分化和细胞生长，通过腹背、两侧、近远三维轴向的建立，使花器官的不同区域被特化，形成完全发育的萼片、花瓣、雄蕊和心皮。在拟南芥中四种花器官（特别是雄配子体的发育）的出现不仅被各种器官特征转录因子所精确控制，而且受到miRNA和组蛋白修饰在转录后和染色质水平上的调控。以水稻为代表的单子叶器官形态建成与拟南芥有很大差异，而水稻中内稃、外稃和浆片等拟南芥不具有的器官是如何产生的、细胞程序化死亡如何参与调控雄性生殖器官发育等问题一直是植物进化发育生物学中的重要科学问题。 本课题重点研究植物器官形态建成的遗传和表观遗传调控网络，解析水稻内稃、外稃和浆片等禾本科特有器官（相对于拟南芥）产生的遗传和表观遗传机制，阐明调控网络，探索雄配子发育的分子基础特别是糖、激素和程序化细胞死亡等信号等对雄配子形成的作用机制。 1) 解析单子叶植物花器官形态建成的遗传和表观机制，提出发育模型。 虽然人们在拟南芥器官形态形成研究方面取得了很大进展，但基于拟南芥和金鱼草等双子叶植物研究所得出的模型并不完全适用于单子叶植物，因为单、双子叶植物早在1.2～1.8亿年前就分别进化，单子叶植物花器官形态特征明显不同于双子叶植物。水稻是典型的单子叶禾本科植物，水稻花序由小穗组成，小穗由小花和两个颖片组成，小花从外到内依次由外稃、内稃、2个浆片、6个雄蕊和1个雌蕊组成，具有与双子叶植物相似的雄蕊和雌蕊生殖器官，但没有明显的花萼和花瓣结构，取代它们的是外稃、内稃和浆片。水稻的外稃和内稃共同包裹着水稻种子，其发育的形态，不仅直接影响着水稻产量，还与水稻的品质相关。目前对外稃和内稃的发育进化和调控机理的相关研究还非常有限。因此，对其进行深入研究不仅具有理论价值，还具有应用前景。 从理论上，现有双子叶植物花发育的ABC模型在单子叶水稻上存在一定差异。首先，进化树分析表明水稻中存在4个拟南芥AP1亚群的成员，目前尚没有充足的实验数据确定水稻中是否真正存在和双子叶植物中类似的A类基因；其次，由于基因复制事件的发生为水稻中MADS-box基因功能的分化提供了更多的可能。除了遗传学研究以外，水稻花器官在转录后调控机制方面的研究也开始起步，我们发现DCL4同源基因突变后导致叶片、外稃等侧生器官腹背轴极性的丧失，最明显的表型是外稃发育不全或者外稃异化为稻芒等异常的器官，具有雄性不育的表型。 虽然近几年来水稻花器官方面的研究取得了较大的进展。但还有不少问题仍有待回答。水稻花器官与双子叶模式植物最大的差异在外部器官。首先，浆片已经被认为是花瓣的同源物，内外稃是否为花萼的同源物？内稃与外稃是同一种器官还是不同的器官？水稻的颖片是一朵退化的花还是一朵花的有机组成部分？拟南芥与水稻的花发育“ABC”模型有一定的相似之处，在这个模型中，所涉及的都是转录因子，缺乏下游的受调控基因。而不同花器官的形态建成都涉及到细胞的分裂分化。因此，如何解释这些转录因子发生突变影响到细胞分裂分化的命运也即揭示完整的调控网络，需要更系统、深入的利用分子遗传学、生物化学、细胞生物学、表观遗传组学等手段来阐明各个转录因子之间相互作用的关系以及它们的下游靶基因。本课题根据我们的工作基础，将重点开展控制水稻花器官的重要调控因子对植物花器官形成的遗传和表观遗传机制，阐明其调控网络和模型。具体内容包括： (1) 以水稻osmads1, osmads13、oseg1和osrep1等外稃、内稃、颖片和心皮发育异常的突变体为材料深入研究关键转录因子如MADS-box参与水稻等花器官形态建成的遗传控制机理； (2) 利用花器官发育异常的突变体构建一些重要双突变体，如fon4#osmads1，fon4#osmads3，osmads3#osmads13，osmads3#osmads21等，深入研究这些基因的功能和相互关系，将水稻花器官发育的关键基因和拟南芥“ABC”模型进行比较，提出单子叶植物水稻花器官的发育模型； (3) 以osdcl4为研究对象，深入研究小分子RNA参与外稃发育的表观遗传机制； (4) 利用大规模小分子RNA测序技术，通过比较野生型和osdcl4不同组织的小分子RNA的组成，鉴定osdcl4调控的小分子RNA及其作用的靶位点，研究这些因子在水稻外稃、内稃发育中的作用； (5) 通过和双子叶植物的比较研究，从进化发育生物学角度解析单子叶植物花器官形成的分子机制，提出相关模型。 2) 解析植物雄蕊发育遗传和表观遗传机制。 雄蕊发育主要来自L2层的孢原细胞(ACS)进行几次平周分裂, 形成初生壁细胞(PPC)和初生造孢细胞(PSC)。初生造孢细胞进行几次有丝分裂发育为小孢子母细胞(PMC)，初生壁细胞则进行两次平周分裂形成内皮层、中层和绒毡层。MSP1（MULTIPLE SPOROCYTE1）是水稻中克隆到的第一个控制着早期造孢细胞发育的基因，它编码一个与拟南芥中EMS1/EXS功能相似的富含亮氨酸的受体蛋白激酶。msp1 突变体可产生过多的雌雄孢子母细胞，花药壁细胞混乱，绒毡层缺失。最终小孢子母细胞的发育停留在减数分裂Ⅰ,而大孢子母细胞的发育不受影响，造成完全雄性不育。此外拟南芥TAPETAL DETERMINANT1 (TPD1)基因编码一个小分泌蛋白，也具有相似的功能。TPD1和EMS1可以直接结合，水稻中TPD1的同源蛋白OsTDL1A可以和MSP1直接结合。最近，两个高度相似的拟南芥富含亮氨酸的受体蛋白激酶，SERK1 和SERK2被证明是绒毡层形成所必需，且其作用途径与EMS1/EXS和MSP1相似。他们可能分别在双子叶植物和单子叶植物中在促进从前体细胞到绒毡层的分化过程中行使重要的功能。 在花药绒毡层发育中起作用的关键基因还有DYSFUNCTIONAL TAPETUM1 (DYT1)、Tapetum Degeneration Retardation（TDR)、Undeveloped Tapetum1 (Udt1)、MS1、ABORTED MICROSPORES (AMS)、AtMYB103等。DYT1、TDR、AMS和UDT1基因可以编码bHLH类型转录因子，这些基因主要在绒毡层表达，对于绒毡层细胞分化以及花粉发育十分重要，基因突变后可导致完全雄性不育。花粉发育过程中，绒毡层早期包围着花粉囊，到花粉发育晚期，绒毡层经过一种细胞程序化死亡(Programmed cell death, PCD)过程开始降解，为小孢子发育提供营养。研究证明了TDR可以正调控控制绒毡层细胞PCD，该基因突变后，tdr的绒毡层和中层不能及时降解，PCD大大延迟，小孢子释放后迅速降解，由此导致完全的雄性不育。然后DYT1、TDR、Udt1、MS1、AMS、AtMYB103等这些基因在花药发育过程中的调控网络尚不清楚。 减数分裂是由一系列基因在时空上按照极为精确的顺序,最终完成从二倍性体细胞到单倍性性细胞的转变过程。在这中间任何一个基因发生突变都有可能影响正常配子的形成,最终在不同程度上影响减数分裂产物的染色体数目、倍性及育性。目前拟南芥和水稻中克隆到的参与孢子母细胞减数分裂过程的基因主要有AtPRD1、AtSPO11-1、Atmus81、RAD51C、MER3、DMC1、PAIR2、PAIR1、MEIOSIS ARRESTED AT LEPTOTENE1 (MEL1)、OsRAD21-3、OsRad21-4等。表观遗传控制方面，mel1突变体在减数分裂早期染色体的浓缩和大小发生异常，花粉母细胞的染色体中心粒位置的组蛋白H3K9甲基化发生异常改变，不能形成雄性生殖细胞；同时雌性生殖细胞也不能正常形成，说明在水稻中存在生殖细胞特异性的表观遗传控制机制。目前的研究仅仅是对水稻减数分裂过程分子生物学研究的开端，这一复杂的过程还有待于人们的进一步研究。 植物正常授粉还需要花药适时开裂和合适的花丝长度，花粉才能在成熟后适时释放出来进行授粉,所以花药开裂是花药发育后期的一个重要特征。花药开裂涉及到花药壁各层细胞的变化以及细胞内的许多生理生化反应，Sander等认为拟南芥花药的开裂从中层以及绒毡层的降解开始；然后，药室内壁细胞膨大、药室内壁以及连接层细胞上发生纤维状带的沉积；后期位于药室间的隔膜层降解产生了一个双药室的花药；最后，连接两个药室的裂缝细胞降解，使花药开裂。目前在其它物种中已经分离到几个与花药开裂有关的基因。例如拟南芥的ms35 、nondehiscent1、delayed dehiscence1（dde1）/opr3表现为裂缝层stomium）细胞的降解延迟，使得花药未适时开裂,此外还有COI1、DAD1等都影响了花药的开裂。 除了运用遗传学方法寻找控制雄蕊发育基因的研究之外，近年人们还利用基因芯片技术在基因组层面上开展雄蕊发育过程中基因表达谱变化的分析，为认识雄蕊发育的基因调控网络开辟了一条新的途径。 总之植物雄蕊发育的过程是一个复杂的过程，虽然在近年来发现了一些参与控制这一过程的基因，但还有许多遗传和表观遗传机制有待于发现和理解,特别是表观遗传记忆如何通过配子体传递给下一代，重编程过程是在何种调控水平上进行的？哪些基因控制这些过程等都是需要回答的重要生物学问题。 本课题根据我们的工作基础，将重点开展控制拟南芥和水稻雄蕊形成的重要调控因子研究，阐述雄蕊形态建成以及小孢子发生的遗传和表观遗传机制，阐明其调控网络和模型。具体内容包括： (1) 以拟南芥dmg1、dmg2和dmg3等雄蕊有丝分裂异常突变体为材料深入研究雄配子体发育过程中的关键调控因子及其相互作用蛋白，并揭示其遗传调控网络。利用PCD in male gametogenesis (pig)类突变体系统鉴定雄配子PCD的PIG基因，研究其功能。 (2) 利用正向和反向遗传学手段分离控制拟南芥和水稻雄性生殖细胞分化和花粉发育关键转录因子AMS、TDR、UDT1、PMD等在减数分裂、细胞程序性死亡等重要生物学过程的控制机理；其中AMS、TDR和UDT1为bHLH类型转录因子，PMD为Myb类型转录因子，利用基因组学等手段深入研究这些转录因子的调控靶基因，阐明其调控网络。 3) 基因组水平解析植物花器官和雄蕊发育的调控网络和模型。 已有的植物器官形态建成的基因调控网络和模型的研究，主要根据遗传学等手段阐明基因之间的相互关系和调控网络，然而这些手段存在通量较低，只能在单个或者几个基因或者因子水平上开展研究，随着最新Solexa等测序技术的发展对于基因调控网络研究提供新的手段，因此，本项目将： (1) 用基因芯片和CHIP-sequencing等技术在基因组水平上研究控制植物花器官形态建成的关键转录因子的靶标基因，揭示其遗传调控网络。这些关键转录因子包括：OsMADS3、OsMADS6、OsMADS7、OsMADS58等抗体为中心的染色质免疫共沉淀全基因组芯片分析。 (2) 用基因芯片和CHIP-sequencing等技术在基因组水平上研究控制植物雄蕊形态建成的关键转录因子的靶标基因，揭示其遗传调控网络。这些关键转录因子包括：TDR、PMD、AMS等抗体为中心的染色质免疫共沉淀全基因组测序和芯片分析，阐明其调控网络。 3、重要植物器官大小控制的分子基础 植物器官大小控制的分子基础是植物发育生物学中最为重要的课题之一，对植物器官大小控制机理深入研究已经成为植物科学领域中重要的前沿和新的增长点。本课题正是面对这一国际前沿领域，利用现代分子遗传学和生物化学、分子细胞生物学等为主要手段，利用模式植物丰富的突变体和完善的基因组学平台，围绕植物器官大小控制的分子机制这一关键的科学问题展开，旨在解析植物器官大小控制中的细胞学基础、器官多少与大小之间的相互关系及分子基础、对器官大小以及多少的分子调控机制和网络以及对内、外源发育信号响应的遗传和表观遗传学基础。 针对关键的科学问题，本项目将从细胞学变化和基因调控的层面入手，我们将开展以下三个方面的研究； 1） 解析植物种子器官大小控制的分子机制。揭示内源生长信号、环境信号等调节细胞分裂和细胞生长从而调控种子发育和大小的作用机制。 在植物种子器官大小的发育和控制的研究中，已经发现了一些重要的基因具有显著的作用，例如AP2、ARF2和ANT；但是这些基因控制种子器官大小的同时还会影响植物的育性。分离鉴定正常育性的大种子突变体不仅可以帮助理解种子大小控制的分子机理，而且具有重要应用价值。在这里我们拟在模式植物拟南芥中首次分离鉴定了正常育性的大种子突变体da1的基础上，重点分离鉴定da1的增强子和da1的抑制子，并通过鉴定与DA1相互作用的蛋白及其功能，鉴定DA1调控的基因网络和DA1途径中的新成员，阐明DA1在控制种子和器官大小方面的分子机理。具体内容包括： (1) 通过EMS诱变，筛选获得da1的增强子和抑制子；分离da1增强子或抑制子基因，建立da1、增强子或抑制子突变体之间的遗传及基因间关系； (2) 获得并鉴定DA1相互作用蛋白（DA1 interacting protein， DIP）并对其进行功能分析；希望可以鉴定出DA1的直接下游靶目标，从而进一步理解DA1作用的分子基础； (3) 鉴定出da1-1突变体中差异表达的基因，研究这些基因在调控种子和器官大小方面的功能，并建立DA1调控的基因网络； (4) 比较不同生态型间种子和器官的大小，测序不同生态型间DA1基因的自然变异，建立DA1基因的自然变异与种子和器官大小之间的关系，更好地理解DA1在控制种子和器官大小的功能； (5) 通过基因芯片技术结合分子遗传学和生化方法，探索植物激素油菜素内酯对种子性状、大小以及饱满程度的影响，并通过对突变体种子大小的突变以及恢复突变，鉴定受激素调控的参与调控种子发育的关键基因。 2） 解析地上器官叶和花大小控制的遗传基础。 已经有证据表明有些器官大小相关的突变体（例如，35S::ARGOS, 和bb）的种子大小正常，说明存在种子或器官特异的对大小进行调控的途径；而bpe突变体主要影响花的大小，ppd突变体主要影响叶子和角果，说明不同器官间也存在特有的调控途径。虽然arf2 突变体和异位表达ANT植株有减低的育性，但arf2 突变体和异位表达ANT植株的种子和器官（例如叶子）增大，说明一些大小调控途径是种子和器官共有的。 在前期鉴定ARGOS的基础上，我们针对器官大小调节的共同途径这一科学问题，拟利用遗传学、生物化学和反向遗传学的方法，进一步鉴定参与控制拟南芥地上器官叶和花大小的功能基因信号控制，解析激素和其它环境调控植物器官发育及大小的分子机制和信号途径。具体内容包括： （1） 控制器官大小途径中组分的鉴定和研究。以器官的大小和细胞数目作为指标，筛选ARGOS的抑制子，鉴定ARGOS下游的信号分子和其它影响器官大小的功能基因，并研究其功能，解析叶和花器官大小控制的分子基础。 （2） 解析控制地上器官大小的信号途径。研究器官大小控制中的重要功能基因和生长信号和环境信号的关系，揭示激素信号和其它环境信号生长素控制叶、花大小的细胞学机制分子。 （3） 探索器官大小控制中的关键基因的应用潜力。将对鉴定到的在拟南芥器官大小控制中起重要作用的基因，将通过转基因的方法评估其在作物改良方面的应用潜力。 3） 研究植物重要器官大小、粗细和多少控制的分子基础，探索植物器官在大小、形状和数量之间补偿机理。 从突变体入手，我们拟重点研究模式植物拟南芥和水稻在营养生长过程中叶片器官的大小、形状以及茎器官分枝的多少的控制机理，分离调控叶片大小、形状和分枝数目的基因，探索它们之间补偿关系的细胞生物学和分子生物学基础。具体研究内容包括： (1) 分离鉴定控制叶片大小或/和形状的拟南芥基因CUR2和CUR4的功能，鉴定与CUR2和CUR4相互作用的蛋白，阐明这些突变体的叶片大小和形状控制的分子机理； (2) 分离鉴定控制茎分枝增多的基因MCB1和茎粗发育控制基因DWT1的功能，阐明基因工作的分子基础； (3) 对本研究中克隆的一些重要的器官大小控制基因，研究和评价其在粮食和经济作物改良中的应用潜力，为作物的改良提供基因资源。 二、预期目标 1、总体目标 将利用拟南芥和水稻突变体材料和实验操作体系，综合遗传学、生物化学、细胞生物学、全基因组学和生物信息学等现代生物学研究手段和工具，研究高等植物重要器官发生、形态建成、器官大小的遗传与表观遗传调控机理，揭示植物生长发育与环境互作的信号调控网络，为产量性状的分子设计提供理论依据和基础。通过本项目的实施，预计将在以下几个方面取得突破： (1) 阐明高等植物重要器官发生、形态建成和大小决定的遗传和表观遗传调控机制和网络，取得一批重大原始创新性科学成果。 (2) 阐明植物开花、重要花器官形态建成和大小控制过程中关键因子的作用机理和信号网络，发掘一批控制植物器官数目和大小的重要功能基因，为产量性状的分子设计提供依据。 (3) 通过项目的实施，培育和造就一批在国际上具有影响力、在国内具有引领作用的优秀中青年研究人才，进一步提升我国在植物发育生物学的研究水平，使我们在该领域的研究进入国际领先行列。 2、五年预期目标 在已有的工作基础上，在植物器官特征决定、重要器官形态建成和器官大小控制的分子机理等方面取得突破性进展，使我国在植物器官发育的理论和应用研究进入国际前沿水平，具体目标包括： (1) 揭示控制营养生长向生殖生长转变、单双子叶植物花器官进化与发育、种子叶等器官大小控制的关键遗传和表观遗传因子及其调控网络，建立相关的新的理论和模型。 (2) 分离鉴定植物器官特征决定、形态建成和大小控制的关键基因20-30个，建立相关调控网络1-2个，揭示激素等信号参与控制植物器官形成的遗传和表观遗传机制。 (3) 在国际著名学术刊物上发表有较大学术影响的论文，发表SCI论文30篇、累计影响因子达150以上。 (4) 培养学术带头人2人以上，研究生30－40人、博士后8人。 三、研究方案 实现项目五年预期目标的总体研究思路： 主要作物的产量是由单位面积有效穗、每穗粒数、千粒重三个基本要素决定的，而这三要素主要由开花时间、花器官发育和种子大小等器官形成相关的发育生物学因素决定的。因此，本项目将针对上述科学问题，从植物器官特征决定的遗传和表观遗传调控网络、植物重要器官形态建成的调控机制和模型以及重要植物器官大小控制的分子基础三个方面系统研究器官形态建成的分子机制，为实现对植物生长发育调控的遗传改良提供理论依据。其中，这三个课题之间具有内在的联系，花器官决定是花器官发育的前提，而两者均对器官和种子的大小有一定的影响， 实现项目五年预期目标的技术路线： 本项目以拟南芥和水稻为主要材料，利用遗传学、生物化学、细胞生物学和全基因组学研究手段，重点采用突变体筛选和鉴定，分离和克隆控制突变体表型的关键基因并对克隆的基因进行功能验证，利用细胞学和分子生物手段、突变体间的遗传杂交分析研究功能基因间的相互作用关系；通过蛋白质修饰和互作检测技术以及DNA与蛋白质互作全基因组分析技术研究蛋白与蛋白互作或者基因与蛋白互作，整合植物器官决定、形成和大小的遗传与表观遗传调控网络，初步阐明器官形态建成的分子机理，为实现对植物生长发育调控的遗传改良提供理论依据。 本项目实现预期目标的可行性： (1) 资源优势：水稻和拟南芥的基因组测序已完成，功能基因组和蛋白组学的平台建设已逐步完善。拥有一大批与本项目有关的拟南芥和水稻器官发育相关的突变体，已克隆了一些重要的功能基因，项目实施过程中通过相互作用蛋白或者蛋白与基因的互作的高通量筛选，又可获得大量新的有用材料，为项目的实施提供了保障。 (2) 研究优势：植物器官形成及调控机制的研究已有一定的研究基础。本项目的研究内容是建立在已有的工作基础之上，各个研究组已具备了较好的研究基础和条件，在突变体筛选、ChIP分析、生化分析、显微操作和免疫荧光定位技术等都是项目组有关成员多年来经常采用的技术。相关的工作已有多篇论文在国际权威刊物上公开发表。所取得的成果已经证明我们在该领域具有较强的国际竞争力，特别是目前研究团队内良好的学术氛围，完全可以保证本项目的顺利实施。 (3) 人才优势：项目组主要成员有多年从事植物遗传学、表观遗传学和生物化学研究经验，已在Nature、PNAS、Plant Cell、EMBO Reports和Plant Physiology等国际重要刊物上发表多篇相关的论文，这为深入开展植物重要器官形成的遗传和表观遗传分子机理的研究奠定了良好的科学和人才基础。同时本项目在已有优势人才的基础上，围绕关键科学目标进一步优化了现有队伍，建立起优势互补、联合攻关的协作团队。 本项目的创新性和特色 (1) 科学问题的前沿性：本项目以我国粮食安全重大需求为导向，瞄准国际科学前沿，凝练研究目标，集中开展重要农艺性状（产量）相关的分子基础研究，揭示控制植物重要器官形成的调控机理，发掘鉴定一系列在植物重要器官发生、形态建成、器官大小控制过程中起关键作用的遗传因子和非编码RNA，建立遗传与表观遗传相互作用调控植物重要器官发生和形态建成的理论和模型，阐明作物重要产量性状决定的分子基础。 (2) 研究方法的先进性：综合运用分子遗传学、表观遗传学、细胞生物学、生物化学和系统生物学等多学科交叉研究方法，结合最新的小分子RNA、转录因子调控靶标基因的全基因组分析技术等，从基因转录调控、转录后调控、蛋白翻译后调控三个层次对控制植物重要器官形态建成的遗传与表观遗传网络开展系统性的研究。 (3) 研究体系的独特性：项目所涉及的研究材料(拟南芥和水稻等)，既有模式植物的有利特点，使研究技术和途径易于实施、保证了研究的深度和水平，又与农业生产目标紧密结合，使研究结果产生直接的农业效益。另外，发育生物学研究很大程度上依赖于重要研究价值的突变体材料的获得，本项目的研究团队已具备了大量工作积累，获得了一批与植物器官形态建成相关的重要突变体，为进一步深入研究植物器官特征决定、形态建成、大小控制等奠定了坚实的工作基础。 课题设置 课题1、植物器官特征决定的遗传和表观遗传调控网络 设置思路：植物器官特征决定受一些关键基因控制，这些基因受到转录、转录后和翻译后等多种水平精细调节。花器官决定是植物从营养生长向生殖发育转变的重要发育过程，并产生花器官。长期以来调控植物开花的分子机制一直是植物发育生物学研究的热点。赤霉素和自主途径因子是植物自身发育进程调控开花的关键因素，但是对赤霉素如何启动植物开花的了解却非常有限，而表观遗传调控因子在哪些通路、通过哪些靶位点调控开花关键基因还不清楚。赤霉素和自主途径因子如何接受环境信号通过植物自身发育进程来协调开花调控的目前还知之甚少。 研究内容：本课题将从花器官决定入手，通过鉴定参与赤霉素和自主途径的遗传和表观遗传调控因子、解析这些遗传因子之间在各自的途径和与其它途径间相互作用的分子机制、研究表观遗传调控因子通过哪些靶位点调控各种遗传因子，解析各种激素和环境因素如何参与调控植物器官特征决定的遗传和表观遗传调控网络。我们将开展以下三个方面的研究： 1) 赤霉素调控植物开花的分子机制研究。揭示短日照条件下早花突变体的作用机理，初步建立赤霉素促进开花的遗传途径。具体内容包括： (1) 利用pSPY:SPY-GFP的拟南芥转基因材料，通过EMS化学诱变和遗传筛选，获得Paclobutrazol抗性并抑制ga1-t表型的早花pef 突变体和抑制spy3表型的晚花ros突变体。比较ga1-t ros，ga1-t和ga1-t pef突变体间开花时间及开花相关基因的表达差异，进而推测ROS和PEF在调控开花机制中的可能功能。 (2) ROS和PEF基因克隆，分析基因表达模式和抗体制备。分析ROS和PEF对SPINDY或者DELLA蛋白功能的影响。 (3) 通过酵母杂交和免疫共沉淀分析可能与ROS和PEF蛋白质相互作用的蛋白（或基因），深入探讨ROS和PEF在植物开花调控中的功能，重点分析这些新成分在控制植物开花中的功能，揭示赤霉素调控植物开花的分子机制。 2) 蛋白质复合体对开花关键基因表达调控的分子机制研究。鉴定蛋白质复合体组分，重点阐述蛋白质复合体对开花关键基因表达调控的分子机制。具体内容包括： (1) 通过GI-TAP和SPY-TAP转基因材料，利用生物化学和蛋白质组学分析手段，鉴定SPINDY蛋白质复合体新组分。 (2) 分析T-DNA插入突变体表型，明确SPINDY蛋白对蛋白质复合体形成以及蛋白质复合体形成对关键开花基因染色质修饰的影响，揭示这些新组分对关键开花基因表观遗传调控的分子机制。 (3) 通过蛋白质免疫共沉淀和酵母双杂交分析，分析PICKLE的互作蛋白及蛋白复合体；并将pkl与hac1突变体进行比较，利用ChIP方法分析PKL结合于开花调控因子启动子区域的染色质状态，探讨PKL与HAC1、FLC和LFY在功能上的关系。 3) 蛋白质翻译后修饰调控植物开花过程的表观遗传信号网络研究。解析多种组蛋白翻译后修饰调控植物开花的遗传和表观遗传机理，阐明自主通路感应自身发育进程的信号促进植物开花的机理。具体内容包括： (1) 在基因组水平上，利用Solexa大规模测序技术，比较野生型Col和atprmt5突变体基因的表达模式，重点分析mRNA可变剪切的变化及其对开花的调控机制。 (2) 构建atprmt5、atprmt10和atprmt4a/4b突变体之间的双、三突变体和与athac1等自主通路突变体之间的多突变体，研究这些基因与拟南芥开花自主通路突变体的遗传关系。 (3) 通过蛋白质免疫共沉淀和酵母双杂交分析，鉴定AtPRMT5、AtPRMT10和AtPRMT 4a/b的互作蛋白及蛋白复合体，在体内外验证这些互作蛋白参与调控拟南芥开花的遗传网络。利用定点突变技术，鉴定参与AtPRMT10蛋白二聚体形成和自身甲基化位点，利用遗传学手段研究AtPRMT10自身翻译后修饰调控开花的机理。 (4) 利用亲和层析，寻找能够特异识别对称性和非对称性双甲基化的精氨酸残基的蛋白，阐明这些甲基化信号是如何被读取和传导以调节拟南芥开花的。 (5) 结合蛋白双向电泳和精氨酸甲基化特异性抗体等分析手段，比较野生型C