2010CB529900-靶向基因治疗的应用基础研究 (2).Doc

项目名称： 靶向基因治疗的应用基础研究 首席科学家： 魏于全 四川大学 起止年限： 2010年1月-2014年8月 依托部门： 教育部 四川省科技厅 一、研究内容 本项目将围绕基因治疗目前面临的困难，在前期研究工作的基础上，从新型靶向病毒载体、新型高效的靶向非病毒载体、靶向选择表达调控、定点整合和原位修复、靶向基因沉默等基因治疗的关键科学问题入手，试图解决基因治疗的瓶颈问题——靶向性。并将这些可能取得的技术突破用于肿瘤、艾滋病、遗传病、心血管疾病等严重危害人类健康的重大疾病的治疗研究中。为推动我国基因治疗基础研究和临床实践的发展，巩固我国基因治疗研究在国际上的地位，也为我国基因治疗药物产业的发展提供关键技术支撑。 主要研究内容包括： 1． 病毒载体的靶向性研究 构建器官组织靶向的病毒载体或溶瘤病毒，提高病毒载体对靶细胞的亲和性，使得病毒载体能够在靶器官或肿瘤组织局部富集，从而大大提高目的基因的表达水平；尽量降低病毒载体的免疫原性，减少免疫系统对病毒的清除，从而降低病毒的用量，提高安全性。 2． 非病毒载体的靶向性研究 制备各种新型可降解、安全性好的脂质体材料或多聚物载体材料，将各种靶向的配体或抗体连接于材料的表面，赋予其主动靶向性；用这些靶向材料负载目的基因，研究其体外包裹效果和体内靶向效率，研究其药代动力学性质及安全性、有效性。 3. 定点整合、原位修复技术及机理研究 提高噬菌体ФC31/BT1整合酶介导的整合位点特异性和整合效率，阐明rep蛋白介导的位点特异性整合影响因素，研究单链DNA寡核苷酸（SSO）介导的基因原位修复的机理和AAV ITR/REP介导外源基因定点整合到19号染色体AAVS1的机理和应用，研究人源基因载体在靶向基因治疗中的应用。 4．选择性表达调控研究 利用基因组学和蛋白质组学已有成果，筛选各种可受理化因素调控的转录因子和调控元件，研究其中有功能、可调控的结构域；构建靶向调控表达的各种病毒系统或原核表达系统，研究其靶向效率、表达调控的效果和安全性、有效性，最大程度地降低目的基因对正常组织器官的影响。 5．RNA干扰、microRNA等靶向基因沉默技术及在基因治疗中的应用研究 利用RNA干扰或microRNA等新型基因沉默技术探讨靶向基因治疗的新途径，特别是针对具有潜在治疗价值的新靶点、新基因的研究。 6．靶向基因治疗技术在重大疾病的应用研究 所有靶向性的研究，所有新技术的探索，最终的目的只有一个，就是为了治疗人类的重大疾病，保障人类的健康。利用以上技术的发展和突破对遗传病、艾滋病、肿瘤、心血管疾病等严重威胁人类健康的重大疾病进行治疗，探讨靶向基因治疗的应用，也同时验证我们所发展的靶向基因治疗的新技术、新方法和新策略能否最终解决或部分解决基因治疗的安全性、有效性问题。 二、预期目标 总体目标： 在“973”计划项目的资助下，通过努力在靶向基因治疗的基础理论和几大关键技术方面取得突破和创新，包括增强导入系统、定点整合、原位修复、表达调控、基因沉默等基因治疗关键环节的靶向性和效率；完善具有我国自主知识产权的靶向基因治疗系统和技术平台；为推动我国基因治疗进入临床应用提供可靠的理论依据和关键技术支撑，提供多项具有潜在应用前景的靶向基因治疗候选新药或治疗方案。进一步提升我国在基因治疗领域的国际地位。 五年预期目标: 在病毒载体的研究方面，要在新型高效、低毒、靶向导入的病毒载体研究上有关键技术的突破；提供2-3个可供基因治疗临床应用的靶向性、低免疫原性腺病毒载体；提供2-3个可供基因治疗临床应用的、在肿瘤细胞内选择性复制的腺病毒载体；2个以上可用于基因治疗临床应用的、具有不同亲嗜性和组织表达特异性的AAV载体。 在非病毒载体的研究方面，制备出新型稳定的靶向脂质体载体、新型可降解靶向的聚合物胶束载体等，解决制备工艺的稳定性，并建立相应的质控标准。同时研究载体-基因药物复合物在体内的靶向分布，潜在的毒性以及治疗效果。最终提供3-5种安全有效的可供基因治疗临床应用的非病毒载体。 在定点整合和原位纠错研究方面，有理论创新和突破，初步揭示整合酶与顺式元件的结构和功能的关系，研发出3-5个新的定点整合载体体系。筛选并建立集高效性、安全性于一体的位点特异载体系统。对寡核苷酸分子定点修复的机理取得更深入的认识和突破，进一步提高修复效率，为其临床应用提供理论依据。建立一个以“人源基因载体”为核心、自体干细胞为靶细胞的“自体化”靶向基因治疗新体系。 在靶向选择表达调控方面，构建肿瘤、组织细胞及病毒特异的表达调控元件库，深入研究基因表达调控的机制。提供2-3个可供基因治疗临床应用的、在靶细胞内选择性表达调控的腺病毒及其它病毒载体。 发展RNA干扰、microRNA等基因沉默新型治疗系统，进一步发展和应用靶向性，并把靶向策略和新型导入系统应用到RNA干扰技术中，提高治疗效果。提供2-3种具有临床应用前景的抗肿瘤或抗传染性疾病的干扰药物。 对遗传病、艾滋病、肝炎、恶性肿瘤、心血管系统疾病等重要疾病进行基因治疗研究，并进一步验证以上研究的关键技术的应用可行性。 由基础研究突破，进而推动了我国基因治疗药物的发展，提供具有潜在应用前景的靶向基因治疗候选新药或治疗方案10余项。 培养基因治疗基础及应用研究方面的学术带头人和学术骨干15-20人，培养一大批懂得基因治疗的研究生，为基因治疗及国内健康事业的可持续发展补充后备力量。 论文：发表SCI收录的论文200篇以上，其中IF>5的应占40%以上，力争3-5篇论文发表在Nature或Science上。 专利：申请专利50-100项，其中国际专利5-10项。 三、研究方案 总体思路： 本项目采用一种新的理念——即系统工程的概念来解决基因治疗中存在的关键问题。以基因治疗的靶向性为重点，围绕五个关键科学问题，从基因的输送、定点整合或原位修复、表达调控等几个层面入手，一环紧扣一环。各课题似“部件”或“元件”，相辅相成，有机组合成一个整体，最终创建出比较理想的基因治疗系统，进行遗传病、艾滋病、肿瘤和心血管病等重大疾病的基因治疗。本项目中的每一个课题都是在具有独立知识产权的、原创性工作的基础上的进一步拓展，每一个课题的突破都将带来基因治疗研究的进步，不仅能解决或阐明目前基因治疗中迫切需要解决的理论问题及关键技术，还能为临床应用提供技术支撑和潜在的产品。 技术路线： 本项目技术途径涉及到多学科多技术的交叉应用，主要通过利用现代基因工程和分子生物学技术、新型材料技术，结合细胞生物学技术、实验动物技术来实现。包括运用基因工程和分子生物技术实现对病毒载体的改造赋予其细胞吸附和转运进入细胞的靶向性或特异复制靶向性；运用材料学技术合成新型的靶向脂质体、PEI等新型材料，并与靶向配体偶联，赋予非病毒载体靶向性；改造病毒载体和质粒等非病毒载体，用靶向调控元件替换其非靶向元件，结合双基因甚至多基因表达等，实现基因在靶向器官或组织细胞中的特异性表达或者定点整合、原位修复。再用常规的检测技术、细胞培养技术、实验动物技术观察靶向导入系统对目的基因的靶向输送情况，目的基因的靶向表达情况，体外对肿瘤细胞、致病病毒复制情况等的影响，以及体内对各种重大疾病模型动物的治疗效果和毒副作用等，考察我们的研究成果是否取得突破以及潜在的临床应用价值。 可行性分析： 如上所述，本项目以增强基因治疗的靶向性为核心，解决基因治疗中的安全性和有效性问题，实现一批关键技术的突破，探讨这些新技术、新方法在遗传病、艾滋病、肿瘤和心血管疾病等的潜在应用。目标明确，课题设置合理，技术路线先进。项目的八家承担单位都是国内从事基因治疗研究的国家重点实验室，拥有项目所需要的各种技术平台和价值上亿元的先进仪器设备。项目的研究队伍聚集了国内长期从事基因治疗研究的优秀人才，有良好的合作基础。 本项目是上一期项目的延续实施和进一步深入。通过上一期项目的实施，已发表基因治疗相关的SCI论文200多篇，包括在国际权威的Nature系列杂志上文章3篇，PNAS、Mol Pharm、MCP、Hepatology、EMBO J等影响因子9以上的文章18篇，影响因子5分以上的文章60余篇，获准专利授权20余项，为本项目奠定了很好的基础。通过上一期项目的实施为本项目凝练出了目标和重点，使得本项目的研究方向更明确，重点更清晰，对困难的认识也更充分，因而可以更好地配置力量和资源，集中力量攻克重点和难点。上一期项目还为本项目建设好了所需要的技术平台和技术路线。 因此，无论是研究基础、经验、人员、技术等软件条件，还是仪器设备等硬件条件，项目组都已经具备，能够保障项目的顺利实施和圆满完成。 创新点与特色： ① 在总体设计上目标明确，重点突出，凝练出基因治疗领域的关键科学问题，以增强基因治疗的靶向性为核心，提出我国学者自己的学术观点，设计具有自主知识产权的基因治疗载体或系统，利用适当的细胞和动物模型，评价其作用效果，并深入研究相关的作用机制，为推动我国基因治疗基础理论研究的发展和基础科研实力的提高，为基因治疗的临床应用奠定坚实的基础。 ② 整个项目的设计以基因治疗的靶向性为核心，从基因的输送和导入、定点整合或原位修复、表达调控等几个基因治疗的关键层面入手，一环紧扣一环，每个层面都围绕着靶向性这一核心，层层推进，形成一个有机的整体，体现了研究的系统性和整体性。 ③ 以遗传病、肿瘤、艾滋病、心血管疾病等重大疾病为治疗目标，所有策略、技术研究的目的都是为了在这些疾病的治疗上取得进展和突破。这些疾病是严重危害人类健康的重大疾病，也与我国的健康事业发展息息相关。体现了我们项目紧密围绕国家和社会需求，将基础研究与临床实践和应用相结合的特色。 ④ 在靶向性策略上，我们采用的技术路线都是我们首创的具有自主知识产权的方法或是目前国际上研究的热点，并且已经有了很好的研究基础。上一期工作中我们在几种靶向策略上都有创新性研究，并已取得了显著的成绩和部分突破。例如我们首创的肿瘤靶向双基因-病毒治疗，既利用了病毒的靶向复制溶瘤，又能将抗肿瘤基因的效应扩大成百上千倍，能将肿瘤细胞彻底清除，相关文章发表在Hepatology、Cancer Research、Mol Therapy等杂志，并已申请了国际专利；在寡核苷酸介导的基因原位修复研究方面，首次提出了复制叉渗漏SSO掺入修复假说，研究论文发表在PNAS杂志；首次发现了人类的核糖体基因区——人D、G组染色体短臂可以作为人类基因治疗的最佳靶位点，成功构建了人源基因载体将目的基因靶入到人核糖体基因（rDNA）区，并能安全、有效和长期稳定表达，该研究已获美国专利授权；我们还利用从抗体库筛选获得一株具有内化活性的抗HBsAg单链抗体与鱼精蛋白片段融合，建立了siRNA靶向输送系统，并在体内外实现了siRNA向HBV感染细胞的靶向特异性输送，相应结果发表在Hepatology上。本项目中我们将在这些创新成果的基础上进一步深入地开展研究，取得新突破的可能性很大。 ⑤ 本项目是多学科的交叉，以基因工程、分子生物学、病毒学、免疫学、细胞生物学、化学、材料学等多学科为基础，服务于医学的需要。研究人员来自于临床医学、基础医学、生物学、化学、材料学等不同的学科领域，组成联合攻关团队，瞄准重大疾病的治疗需求和产业化需求，集中优势力量解决目前基因治疗面临的靶向性难题。 ⑥ 本项目的承担单位都是国家重点实验室，有长期从事靶向基因治疗的研究基础和经验，有优秀的研究团队，已建设了本项目需要的很好的技术平台并拥有价值上亿元的精良的设备。 ⑦ 本项目是上一期项目的延续，不仅有很好的研究基础，还有良好的团队协作基础和管理经验。以前的合作能够创造佳绩，相信更能为以后更大的成功奠定基础。 课题设置 本项目以基因治疗的靶向性为核心出发点，根据需要解决的6个关键科学问题，设置了6个课题，即： (1) 新型靶向病毒载体研究 (2) 新型靶向非病毒载体研究 (3) 定点整合、原位修复技术及机理研究 (4) 靶向选择性基因表达调控研究 (5) 新型靶向基因沉默技术研究 (6) 重要疾病的靶向基因治疗研究 前五个课题重点解决靶向基因治疗的关键问题，课题六是前五个课题取得的创新成果和关键技术突破应用到重要疾病的基因治疗研究。各课题间密切相关，环环相扣，合起来形成基因治疗的有机整体。每个课题都设置各自的预期目标，保证了项目总体预期目标的完成。 课题1、新型靶向病毒载体研究 预期目标： 1) 提供2-4个可供基因治疗临床应用的新型靶向性、低免疫原性腺病毒载体； 2) 获得5个以上具有不同亲嗜体和组织表达特异性的AAV载体，其中1个以上可应用于临床基因治疗； 3) 建立具有独立知识产权的多功能通用的新型HSV基因治疗载体系统； 4) 发表SCI论文30-50篇 5) 申请专利 8-10项 研究内容： 病毒载体在基因治疗领域的应用最为广泛，包括各种腺病毒、腺相关病毒（AAV）、逆转录病毒、单纯疱疹病毒等。本课题主要构建靶向性、低免疫原性腺病毒载体、研制新型腺相关病毒（AAV）载体和发展新型疱疹病毒载体，同时对这些载体的有效性、安全性、毒性等进行研究。 1、通过外壳改造，提高腺病毒的感染效率与靶向性 外壳是腺病毒识别并结合细胞的重要元件，直接决定了病毒对细胞的感染能力与感染效率，并与机体对病毒的免疫反应直接相关。我们己建立一个腺病毒纤毛蛋白基因的突变体库，以便从中筛选出对肿瘤细胞（包括肿瘤干细胞）高感染且靶向腺病毒系统。同时我们正建立一个Hexon基因的突变体库, 以便筛选到逃脱抗体拦截的腺病毒载体系统。两者结合实现腺病毒静脉给药途径。对筛选到的效果良好的病毒深入进行靶向性、有效性和安全性的研究。 2、携带EGF-Bax和EGF-Fc融合基因的溶瘤腺病毒载体研究 EGFR在多种肿瘤组织高表达，与正常组织细胞相比，其表达水平要高2到3个数量级，靶向到高表达EGFR的肿瘤细胞一直是肿瘤基因治疗的热点。以EGF作为导向，构建EGF与肿瘤杀伤基因或抗体的融合蛋白，通过EGF“弹头”将杀伤肿瘤细胞的基因带到肿瘤细胞局部从而达到杀死肿瘤细胞的目的。另一方面，表达的EGF融合蛋白可以达到封闭EGFR的作用，进而干扰肿瘤细胞的增殖。我们将EGF-Bax、EGF-Fc和EGF-GFP融合基因插入溶瘤腺病毒基因组，组装携带EGF-Bax和EGF-Fc融合基因的溶瘤腺病毒，感染293细胞，对病毒进行扩增和纯化。用纯化的病毒感染肿瘤细胞，检测目的基因的表达情况。利用GFP报告基因，对表达蛋白的靶向性进行分析。细胞学和动物实验，评价所构建的靶向病毒载体的抗肿瘤生物活性。对效果良好的靶向病毒再进行急性毒性和长期毒性安全性评价，并研究其体内分布和代谢情况等以确保病毒使用的安全性。 3、新型AAV载体的研究 1) 具有不同亲嗜性的AAV病毒的改造和转导特性研究，主要通过应用不同血清型的AAV病毒外壳基因，及对AAV外壳蛋白进行定向改造（包括不同血清型外壳基因的杂合和基因工程改造），构建新的具有靶向性的或对某些细胞具有特异亲嗜性的AAV载体。 2) 对AAV载体颗粒表面进行化学修饰和“包裹”，达到反复给药，有效避免免疫清除的目的。 3) 研究不同给药途径和方法及AAV载体的体内生物分布和代谢特性，阐明局部或全身应用病毒载体后病毒颗粒在血管内与血液成分及血管内皮细胞的相互作用，在肝、肾、肺、脑等重要器官内病毒颗粒的分布与存在时间，经过血管向肿瘤内的释放和在肿瘤内的聚集情况等，获得有普遍价值的科学数据。 4、新型靶向性单纯疱疹病毒（HSV）载体的研究 拟改进溶瘤单纯疱疹病毒HSV的靶向性，以前期已证实具有良好抗肿瘤作用的溶瘤HSV为研究材料，从细胞转导、转录和翻译等多个层面上进行溶瘤HSV的靶向性操作，发展新型三重靶向溶瘤HSV (triple targeting Oncolytic HSV, ttoHSV)，具有细胞转导靶向（通过叶酸受体实现，由聚乙二醇介导）、转录调控（通过肿瘤特异性的hTERT基因启动子实现）和翻译修饰（通过eIF-4E特异识别的5’UTR实现）三重靶向功能，并建立相应的多功能通用型的HSV基因治疗载体系统。在此基础上对病毒进行急性毒性和长期毒性安全性评价，研究其体内分布及代谢特征等，评价该病毒的安全性和临床应用的可行性。 经费比例：14.6% 承担单位：中国人民解放军第二军医大学 中国科学院上海生命科学研究院 课题负责人：于益芝 学术骨干：顾锦法、李华光、苏长青、孙卫民、王春梅、徐红梅、杨冬琴、张意、刘新垣 课题2、靶向新型非病毒载体研究 预期目标： 1) 阐明影响非病毒基因治疗载体在细胞内表达的影响因素，并提出解决的办法； 2) 通过各种方法筛选、设计获得多个有自主知识产权新型基因载体材料，使非病毒载体材料在体内能有良好的靶向性及更高的基因或siRNA的转染效率； 3) 提供至少2种可供基因治疗临床应用的靶向非病毒载体； 4) 发表SCI论文 30-50篇； 5) 申请专利 8-10项，其中国际专利2-3项。 研究内容： 非病毒载体主要包括脂质体、阳离子聚合物胶束（PEI、PAGA、PEG-PLL、壳聚糖等）等，由于它们具有安全性好、稳定性佳、无免疫原性、导入基因容量大、易实现靶向性、易放大生产且工艺稳定、生产成本低等优点，越来越受到青睐和重视。但非病毒载体目前存在的最大问题是转染效率低，靶向性差。因此当前对非病毒类载体的研究主要是克服基因转染的各种生物学屏障，以增加转染效率；进行靶向性改造，以增强组织和细胞的特异性；发展可生物降解的非病毒载体，降低载体的毒性；提高非病毒类载体与核酸药物所形成的复合物的生物稳定性等，为临床的基因治疗提供一种安全、高效的载体技术平台。 1、 新型靶向脂质体载体的研究 我们前期的研究发现用bFGF突变体修饰的脂质体可与质粒DNA进行自组装形成靶向脂质体/DNA复合物，具有良好的肿瘤新生血管靶向性。肝素修饰的新型阳离子脂质体既能靶向肿瘤血管又能靶向肿瘤细胞。甘草次酸等修饰的新型脂质体能够靶向到肝脏细胞。PHA修饰的脂质体能够靶向到淋巴细胞等。这些经过修饰的新型脂质体载体都有良好的靶向性和较低的毒性。下一步我们将重点研究些这新型靶向脂质体载体负载不同的治疗基因后在体内的靶向分布、对各种疾病的治疗效果、安全性及潜在毒性等。 2．小分子量PEI为基础的多种非病毒载体的研究 聚乙烯亚胺（PEI）是合成型非病毒载体的金标准，但是大分子量PEI难以在体内代谢，我们将利用小分子量的PEI作为骨架，进行环糊精、PEG等各种修饰，研制EGFR、VEGFR等受体为靶向性的基因导入系统，研究其在体内外的基因导入效率。 3．影响基因转染效率的相关蛋白的筛查 同样的载体在不同的细胞中有不同的转导效率，表明细胞中有些影响转染效率的因素，寻找这些影响因素对于设计非病毒载体极为重要。我们将利用同样的靶向性非病毒载体，研究同种肿瘤来源，但转染效率不同的细胞系的转导途径的差异，确定细胞中影响转染效率的因素，为进一步优化非病毒载体，提高转导效率提供依据。 4. 组装式小分子药物/基因药物协同释药的非病毒载体体系研究 研究将以环糊精与低分子量的聚乙烯亚胺嵌段共聚物为母体材料，制成基因药物载体，在载体上偶联5-氟尿嘧啶等药物（作为模型药物），并针对肿瘤细胞用干扰素-α等基因进行联合给药，构建一种小分子药物/基因药物协同给药的治疗模式，有效地提高肿瘤药物的在肿瘤组织中的靶向性和生物利用度。 5. 以iPS细胞为目标的遗传病基因靶向治疗新技术的应用基础研究 iPS细胞在再生医学研究和疾病治疗中的作用引起全世界的高度关注。然而，iPS细胞要在遗传病的治疗中发挥作用，还必须解决基因修复问题。本研究还将探讨各种载体在介导基因转移诱导iPS细胞形成的效率，以及介导基因转移诱导基因修复的效率。 经费比例：14.3% 承担单位：上海交通大学 课题负责人：黄倩 学术骨干：李宗海、郭圣荣、马晴雯、任兆瑞、段友容 课题3、定点整合、原位修复技术及机理研究 预期目标： 1) 初步阐明影响定点整合的分子机理以及整合酶蛋白对细胞的机理，初步揭示整合酶与顺式元件的结构和功能的关系，并且基于这些研究研发出3-5个新的定点整合载体体系； 2) 筛选并建立集高效性、安全性于一体的位点特异载体系统，并在细胞和动物模型上验证，为遗传病基因治疗临床研究提供依据； 3) 对寡核苷酸分子（SSO）定点修复的机理取得更深入的认识和突破，进一步提高修复效率，为其临床应用提供理论依据； 4) 建立一个以“人源基因载体”为核心、自体干细胞为靶细胞的“自体化”靶向基因治疗新体系； 5) 发表SCI论文：30-50篇； 6) 申请专利：8-10项 研究内容： 基因治疗被认为是遗传病最有希望的方法，如何靶向性地将治疗基因导入染色体的安全位置并高效表达是亟待解决的关键问题。而基于定点整合酶的定点基因整合技术和基于寡核苷酸介导的基因原位修复方法则为上述问题的解决开辟了一条新途径。人工合成寡核苷酸介导基因定点修复存在着修复效率相对较低，且修复机制尚未阐明的问题。针对定点整合整合酶介导的整合位点特异性和效率有待于进一步提高，位点特异性整合机制有待于阐明以及寡核苷酸介导基因定点修复存在着修复效率相对较低，技术上也存在的一些问题，本课题拟开展如下内容的研究： 1、噬菌体ФC31/BT1整合酶,rep蛋白介导的位点特异性整合影响因素研究 采用蛋白质相互作用， CHIP等研究方法，解析影响整和相关蛋白活性和特异性的分子机理，影响转基因表达和细胞功能的可能机制。在此基础上探讨提高整合和转基因表达的方法。对噬菌体ФC31/BT1整合酶,rep蛋白分子进化，结构性分析，鉴别出对蛋白质的结构完整性和生物学功能至关重要的结构域。通过蛋白结构模型，发现DNA识别结合相关domain, 并构建突变库，在分子细胞水平相关改建与验证，探讨研发新型整合蛋白体系。基于对整合体系的蛋白酶和顺式元件的解析研究，建立基于上述蛋白和顺式元件的载体系统，探讨其生物学特性以及可能的应用范围和方法。同时研究使用多个整合蛋白与顺式元件的复杂多定点整合体系的可行性与实验方法。 依据已经初步分离鉴定的定点整合酶功能域以及已知的反转录病毒整合活性功能域，研发使用上述两个功能域的杂合蛋白，研发具有定点整合特点的反转录整合酶，开发高效定点整合反转录病毒载体体系。对上述载体在细胞水平研究其效率与应用范围。探讨载体的转移效率、整合位点、表达水平和持续时间等，筛选出集高效性、安全性于一体的位点特异载体转移系统3-5个，并在血友病和地中海贫血动物模型的进行基因治疗，探讨动物体内的靶向性、有效性、安全性等问题，为遗传病基因治疗临床研究提供实验依据。 2、人工合成寡核苷酸介导的基因原位修复的研究 目前寡核苷酸（single-stranded oligonucleotides, SSO）介导的基因修复，最突出的问题就是修复效率低影响了其应用。要解决修复效率过低的问题，首先要明确修复的具体机制，才能采取对应的措施提高修复效率。深入研究影响修复机制的一些主要因素，包括SSO的入核效率、掺入比例、SSO半衰期、SSO和靶位点的接近性、SSO启动的修复系统、完成修复后的细胞内事件等。 在上述研究的基础上，有效引入对修复有利的因素，提高SSO的定点修复效率。包括以下几方面：改造SSO打靶分子结构，对SSO末端进行胆固醇修饰或者添加核定位信号，以提高SSO入核效率，增加其对靶位点的修复频率；对SSO分子进行甲基化修饰，使之更加稳定，不易被细胞内的酶降解或修复，延长其修复时间；对SSO分子进行磷酸化修饰，使其更容易掺入新生链中，提高掺入修复效率。在前面机制研究中，如果一些药物可以通过改变组蛋白乙酰化状态或染色质结构状态，来影响SSO与靶序列的接近性，那么在这些药物中筛选出对细胞无明显毒副作用，不影响细胞增殖的药物，选择合适的剂量和作用时间提高修复效率。通过给予细胞特定的刺激，利用特定的药物诱导，或者影响某些修复关键蛋白的表达，来激活或/和抑制特定的修复酶系统，进一步提高修复效率。 在细胞水平获得稳定和较高的修复效率的基础上，拟设计一个携带荧光报告系统的小鼠模型，在实验动物水平探讨SSO的修复效率。 3、人源基因载体在靶向基因治疗中的应用基础研究 我们在国际上首次发现了人类的核糖体基因区——人D、G组染色体短臂可以作为人类基因治疗的最佳靶位点，成功构建了人源基因载体，该载体能高效的将外源治疗性基因（人凝血因子Ⅷ、Ⅸ等）定点靶入到人核糖体基因（rDNA）区，并能安全、有效和长期稳定表达。在下一阶段，我们将重点围绕基因治疗的靶向性，对人源基因载体的靶向导入、定点整合和选择性表达调控等基因治疗的理论与关键技术方面更深入地开展研究，并在遗传性疾病方面开展应用研究。主要研究内容包括：利用核定位信号NLS提高人源基因载体的转染效率，将锌指酶应用于提高人源基因载体打靶效率，组蛋白乙酰转移酶修饰型人源基因载体的表达效率的研究，应用iPS细胞作为人源基因载体靶细胞的研究，应用骨髓基质细胞进行人源基因载体基因治疗的研究，建立一个以“人源基因载体”为核心的“自体化”靶向基因治疗新体系。 经费比例：17.9% 承担单位：中南大学、复旦大学 课题负责人：梁德生 学术骨干：陈方平、陈浩明、陈金中、戴方平、戴和平、刘东京、田聆、薛京伦课题4、靶向选择性基因表达调控研究 预期目标： 1) 提出基于树突状细胞特点的疾病靶向基因治疗新思路，建立并验证疾病靶向基因治疗的新方案，为疾病的治疗提供理论基础； 2) 构建成功射线诱导型表达载体，研究其临床应用可能性； 3) 提供2-4个可供基因治疗临床应用的新型靶向条件复制与表达腺病毒； 4) 发表SCI论文 30-50 篇 5) 申请专利 8-10项 研究内容： 运用特定的基因表达调控元件，或借助于体内体外的物理化学诱导因素，使目的基因特异地在靶细胞中表达，是实现基因治疗靶向性的另一重要途径。 1、 树突状细胞靶向性新型免疫分子基因治疗研究 可用于免疫基因治疗的靶细胞种类很多，树突状细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞等均曾用作为免疫基因治疗的靶细胞。这些细胞中，树突状细胞是应用最广泛、效果也最好的细胞。本研究将针对树突状细胞的生物学特点，选择具有自主知识产权的新型免疫分子设计新型靶向表达调控腺病毒载体，利用树突状细胞特异的CD1lc 、cⅡTA-pI和Deetin-2启动子分别介导杀伤细胞凝集素样受体L1（KLRL1）基因、肿瘤新型HSP基因和TGF-β基因的表达，用于自身免疫性疾病、肿瘤和移植免疫耐受的治疗研究及机制的探讨。本研究将为基于树突状细胞特点的疾病靶向基因治疗提出新思路，建立并验证疾病靶向基因治疗的新方案，为疾病的治疗提供理论基础。 2、 靶向性条件复制型腺病毒的研究 我们在前期的研究工作中构建了多种特异性启动子调控的腺病毒载体，包括端粒酶hTERT启动子、AFP启动子、SurP启动子等控制腺病毒在肿瘤细胞中特异性地复制并表达抑癌基因，获得双靶向病毒，取得了良好的抗肿瘤效果。我们拟在此基础上进一步构建多重靶向病毒，包括改造表面衣壳蛋白赋予其特异的细胞亲和性，病毒复制必需基因的缺失赋予其特异的复制靶向，多重启动子调控赋予目的基因的表达靶向，在此基础上表达不同的抗肿瘤基因，如IL-24、TRAIL、MnSOD、Smac等，并采用不同的基因组合和病毒组合，获得更好的抗肿瘤效果，甚至可以将肿瘤细胞全部清除。本研究将为基因治疗提供多重靶向调控的腺病毒技术平台。 本研究还拟采用基因芯片、蛋白双向电泳等方法筛选具有自主知识产权的新型射线敏感启动子，用该启动子控制TRAIL基因在细菌中特异性地表达，体内外研究射线诱导TRAIL基因表达的活细菌的分布、受射线诱导情况和抗肿瘤活性、毒性等。 3、MicroRNA调控提高腺病毒对肿瘤细胞的靶向性与表达时间研究 microRNA是近年来的研究热点，其负向调控基因的翻译水平。研究表明，microRNA与肿瘤的发生、发展、转移、复发等过程紧密相关，例如恢复一种microRNA—let-7在乳腺癌干细胞中的表达，可显著降低其致瘤与转移能力。我们建立了一系列基于microRNA调控的重组腺病毒载体，申请了专利。例如，利用肿瘤特异性缺失的microRNA（如let-7a）调控腺病毒增殖必需基因的表达，可限制病毒在肿瘤细胞内特异增殖，而在正常组织细胞中基本不增殖，增强基因治疗的靶向性；利用肝特异性microRNA（如miR-122）调控腺病毒增殖必需基因的表达，可弱化腺病毒对肝脏细胞的强嗜性，降低腺病毒对肝脏的损害，增强基因治疗的安全性；利用免疫系统特异性microRNA (如miR-142)调控腺病毒增殖必需基因的表达，可减少病毒在免疫系统细胞（如DC细胞，巨噬细胞）内的增殖，从而延缓中和抗体的产生，延长治疗基因在体内的表达时间。此外，也用MicroRNA调控表达方法解决在AAV载体在基因治疗中针对表达的产物产生免疫反应的问题。 4、通过增加顺式作用元件，提高抗体基因的表达水平 通过腺病毒携带全长抗体基因，在肝脏中持续、高效表达具有功能活性的抗体分子，并分泌到细胞外，通过血液循环到达肿瘤病灶部位，发挥抗癌疗效。该策略省略了繁琐的抗体体外制备步骤，可显著降低抗体治疗的昂贵费用，与此同时该策略实现了静脉注射给药，延长了给药间隔时间，避免了局部给药的不适，并可对远端病灶发挥早期治疗作用。我们筛选了一系列启动子，并在启动子后加入可增强表达活性的内含子序列，microRNA靶序列，从而显著提高了抗体的表达水平，完善了全长抗体基因治疗方案。下一步我们将研究用该载体表达的不同抗体产生的抗肿瘤活性，为临床肿瘤治疗筛选有价值的基因治疗药物。 经费比例：17.5% 承担单位：中山大学 课题负责人：郑利民 学术骨干：黄必军、黄嘉凌、李莲、刘然义、张清炯 课题5、新型靶向基因沉默技术研究 预期目标： 1) 建立一种优化的单链抗体引导下的siRNA靶向输送系统，为RNAi技术在肿瘤治疗中的应用实现新的突破，也为RNAi技术应用于治疗其他类型的疾病提供一个新的思路； 2) 建立一种优化的叶酸修饰的可降解聚乙烯亚胺shRNA靶向输送系统和bFGF突变体修饰的阳离子脂质体介导的microRNA靶向输送系统,并阐明相应的抗肿瘤机理； 3) 寻找靶向治疗病毒肝炎、艾滋病、肿瘤的小RNA制剂； 4) 提供2-4个可供基因治疗临床应用的siRNA的表达载体； 5) 发表SCI论文 30-50篇 6) 申请专利 8-10项 研究内容： 1、单抗介导siRNA靶向输送系统用于肿瘤基因治疗的应用基础研究 关于siRNA靶向输送的研究还处于起步阶段，其中抗体引导的siRNA的靶向输送系统显示出良好的应用前景。我们利用从抗体库中筛选获得的一株抗HBsAg的单链抗体与鱼精蛋白片段融合后成功实现了siRNA向HBsAg阳性细胞的特异性输送，并在体内外证实由该系统靶向输送的针对HBV的siRNA能够在体内外抑制HBV的基因表达，相应的研究结果已于Hepatology杂志发表。证明了单抗介导siRNA靶向输送系统的用于体内靶向基因治疗的可行性。为了进一步探讨单抗介导siRNA靶向输送系统的用于肿瘤基因治疗等，并增强siRNA的基因沉默效果，我们拟将furin识别序列和流感病毒融合肽HA序列引入单链抗体-鱼精蛋白片段融合基因，进行表达和纯化后获得优化的siRNA靶向输送蛋白；利用FITC-siRNA在体内外验证优化前后的靶向输送系统的有效性；设计、合成并构建能够抑制肿瘤生长、促进肿瘤细胞凋亡的siRNA文库，通过体外实验筛选出高效、特异的siRNA组合方式；利用针对肿瘤生长相关的关键分子的单抗如抗Her2,构建并优化的siRNA输送系统，将筛选出的siRNA组合靶向输送到肿瘤细胞，实现对肿瘤的高效杀伤。本研究将利用优化的靶向输送系统，通过进一步提高siRNA向细胞液的转位效率和不同siRNA组合策略(可在同一质粒表达载体上同时表达多个siRNA或microRNA)，将在体内实现对肿瘤的靶向、高效抑制，从而建立一种新型、高效的抗肿瘤方法，为RNAi技术应用于临床治疗肿瘤提供依据。在此基础上将进一步深入研究该靶向输送系统的毒副作用和安全性。 2、RNA干扰和microRNA 靶向基因治疗肿瘤的应用基础研究 本课题合成了一种新型的、可降解的叶酸（folate receptor，FR）靶向的基因传递载体——Folate-PCL-PEG-PCL-PEI (简称FA-PCEC-PEI)，该材料有良好的卵巢癌靶向性（超过90%的卵巢癌细胞表达叶酸受体），降解后所产生的小分子量的PEI（800-2000 Da）可自行排出体外，临床应用前景很好，国内外未见该新型材料的报导，我们已经申请了专利。本课题拟利用FA-PCEC-PEI作为基因靶向的导入载体，装载我们筛选到的具有很好的抗肿瘤活性的双基因RNA表达质粒：（1）能同时表达人的FAK基因和Claudin-3基因的RNA干扰表达质粒（shRNA-FAK+ Claudin-3）；（2）能同时表达人的VEGF-A基因和CD44基因的RNA干扰表达质粒（shRNA-VEGF-A+ CD44），这2个双基因干扰载体都具有抗卵巢癌新生血管生成和诱导卵巢癌细胞凋亡双重的抗肿瘤作用，可对卵巢癌进行的靶向治疗作用，并阐明靶向的双基因RNA干扰抗肿瘤的作用机理。 FGFR1在多种肿瘤血管内皮细胞及肿瘤细胞中高表达，本课题对bFGF进行结构改造，获得了仅能与FGFR1结合而不会刺激细胞增殖的bFGF突变体，将它与阳离子脂质体自组装后制备成bFGF突变体修饰的阳离子脂质体（简称为bFGF-Liposome），可实现对肿瘤和肿瘤血管进行靶向治疗，该新型的靶向治疗载体材料已经申请了专利。本课题设想利用该新型载体材料装载既能抗肿瘤又抗能肿瘤血管的双microRNA质粒表达载体（p-miR-let-7g+miR-15a/16或p-128b+miR-15a/16），对肺癌进行靶向治疗，为microRNA基因用于肿瘤治疗奠定基础。 3、靶向治疗肝脏疾病的基于非编码小RNA的基因治疗研究 抑制HBV的复制能力可以减轻炎症，逆转肝纤维化并降低肝癌发生率。化学合成的siRNA、内源性表达的shRNA或microRNA靶向沉默基因，为根本性治疗HBV感染提供了新的技术。RNAi可以特异性抑制靶基因功能，并表现出抗HBV、HCV和HIV的作用。本研究拟设计靶向针对肝细胞核因子4（HNF4）、HBx基因、或cccDNA的shRNA，或影响抗HBV天然免疫应答miRNA，并对这些siRNAs沉默靶基因、抑制HBV病毒复制的能力进行比较，筛选出同时具备“免疫刺激效应”和阻断病毒复制的双重功能的siRNA序列。构建相应的表达载体，利用我们的新型肝靶向甘草次酸/阳离子脂质体或抗HBsAg的单链抗体与鱼精蛋白片段融合等导入系统，进行HBV转基因鼠体内研究，包括HBV复制水平、肝组织损伤、肝脏淋巴细胞的分布和免疫学功能特性，寻找靶向治疗肝炎的基因治疗制剂。 4、应用“跨界基因沉默”技术研究新型艾滋病基因治疗药物 肠道黏膜免疫系统是艾滋病毒感染攻击的主要靶标，是艾滋病毒进入机体和复制的重要部位。90%的艾滋病人有肠道症状，很多机会感染也发生在肠道；而且血液中病毒载量仅2-5%，远低于肠道内80%的载量水平。艾滋病毒溶解性复制主要清除小肠肠膜腔中的CD4、CCR5双阳性效应T细胞，这将导致肠道黏膜免疫系统的破坏引发机会感染并造成死亡；派伊尔补丁是幼稚T细胞库，是这些效应T细胞的主要来源。如果通过RNA干扰在幼稚T细胞中构建防御屏障，阻止随后艾滋病毒的溶解性复制，则可以维持肠道黏膜免疫系统的完整，减轻症状，预防机会感染的发生。问题的关键在于要有一种靶向特异