2009CB941700-环境和遗传因素导致男性不育与出生缺陷的分子机制 (2).doc

项目名称： 环境和遗传因素导致男性不育与出生缺陷的分子机制 首席科学家： 孙斐 中国科学技术大学 起止年限： 2009.1至2013.8 依托部门： 中国科学院 一、研究内容 拟解决的关键科学问题 精子异常是男性不育和父源性出生缺陷发生的主要原因。阐明环境EDCs、遗传因子改变致精子异常的分子机制和机体对EDCs易感性差异的分子基础，揭示男性不育和出生缺陷的复杂病因及其发病机制是本项研究的关键科学问题。其中包括： 1. 代表性EDCs通过何种分子机制影响下丘脑-垂体-睾丸轴以及精子发生、成熟过程的不同环节，从而引起精子异常的各类表型？ 2. 遗传因子如染色体重组交换和联会改变引起精子发生停滞或染色体异常的分子机制和调控机理是什么？ 3. 环境-基因交互作用导致男性不育的作用模式和机制是什么？ 4. 精子异常导致常见出生缺陷如染色体病和先天性心脏病发生的机制是什么？ 主要研究内容 1．环境因素导致精子异常的分子机制 1.1代表性EDCs的代谢特征及其与精子异常的关系 通过体内和体外研究代表性EDCs的代谢特征，阐明EDCs内暴露与精子异常的关联，寻找接触性生物标志物。从我国目前环境污染的现状出发，并结合项目组多年的研究基础，遵循“有所为、有所不为”的原则，拟选择邻苯二甲酸酯类、烷基酚类/双酚系化合物、农药杀虫剂类、多环芳烃类、多溴联苯醚类、全氟代烃类和重金属类共七类为目标EDCs。首先通过体外代谢特征和内分泌干扰活性分析并结合动物染毒模型，初步筛选出关键的EDCs因子；然后围绕这些关键EDCs，收集男性不育（精子异常）和职业暴露人群和正常男性对照病例，采集流行病学信息和精液、血液、尿液生物样本，分析EDCs内暴露水平和男性生殖内分泌功能，评价EDCs及其代谢与男性不育（精子异常）的相关性。 运用动物染毒模型结合基因芯片技术筛选与EDCs有关的代谢酶基因，利用酶反应学、细胞生物学和质谱分析技术，鉴定代表性EDCs的关键代谢酶、代谢特征，初步确定候选代谢产物。利用受体报告基因系统，甄别候选代谢产物的雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、甲状腺激素/抗甲状腺激素活性，初步明确代表性EDCs代谢产物的内分泌干扰活性。运用动物模型研究代表性EDCs候选代谢产物与精子异常的关系，初步确认相关EDCs特征性代谢产物；应用高效液相 色谱等方法，分析病例和对照人群生物样本中EDCs的代谢产物水平及与男性精子异常的相关性，筛选出代表性EDCs的接触性生物标志物。运用代谢组学的研究思路，应用UPLC-Q-TOF等方法针对精子异常不同表型和对照的生物样本进行代谢产物谱分析，结合主成分分析等数据分析平台进行分析，进一步验证和确定上述生物标志物。 1.2 代表性EDCs致精子发生异常的分子靶标 通过系统研究代表性EDCs对下丘脑-垂体-睾丸轴以及精子发生、成熟过程不同环节的影响，初步阐明代表性EDCs对雄性生殖损害的靶点和分子途径。 采用针对不同发育阶段小鼠下丘脑-垂体-睾丸轴定点染毒的方法，观察染毒位点下游靶细胞的变化，分析相应激素的分泌和相关基因的表达，确定EDCs损伤下丘脑-垂体-睾丸轴的作用位点。重点关注代表性EDCs通过下丘脑-垂体-睾丸轴影响精子发生的微环境激素调控作用及方式，特别是支持细胞、间质细胞对精子细胞的影响及它们的相互作用。运用基因组学、蛋白组学、miRNA基因芯片技术构建正常小鼠和染毒小鼠精子发生不同阶段睾丸基因、蛋白质和miRNA表达谱，通过比对获得差异表达基因、蛋白质和miRNA，作为EDCs导致精子发生障碍的侯选作用靶分子，对部分差异基因、蛋白质和miRNA进行功能研究，阐明EDCs的作用机制。同时，采用生物信息学技术对所获得差异表达基因及其编码蛋白进行整合分析，发现EDCs导致精子发生障碍的新的作用通路，试图找到关键性的分子标记物。然后，运用RNA干扰和基因敲除技术，建立标志性分子的缺陷小鼠动物模型和细胞模型，验证上述标志性分子对精子发生的影响。 2．遗传因素导致精子异常的调控机理 2.1 减数分裂重组交换异常致精子发生异常的分子机制 MLH1是重组交换过程中的关键蛋白，研究MLH1在精子发生中的确切作用和分子机制，以阐明重组交换异常导致不育和非整倍体形成的分子机理，为不育的个性化诊断提供新的依据。 分别获取人类正常、无精、有染色体分离错误的严重寡精症患者的睾丸活检组织，运用免疫荧光细胞遗传学等方法对MLH1的数目、位置及调控(如位点干涉)、重组交换相关的重要事件(如同源染色体配对、联会)和减数分裂停滞、染色体分离错误之间的关系进行关联度的研究。并同时探讨影响MLH1分布的因素如年龄、甲基化、miRNA、染色体端粒(长度和端粒酶活性)等。运用免疫荧光细胞遗传学研究已知的重组交换相关蛋白(如RAD51/DMC1等)的时空表达模式和与MLH1共定位情况。运用酵母双杂交或免疫共沉淀筛选出与MLH1结合的未知蛋白。然后综合运用活细胞实时摄影、荧光共振能量转移技术、免疫共沉淀或酵母双杂交等研究MLH1与这些已知/未知的重组交换蛋白之间的相互作用，确定这些蛋白相互作用的改变对精子生成的影响及其分子机制。在此基础上找出关键的染色体重组交换相关的蛋白，然后运用基因敲除、RNA干扰或转基因小鼠动物模型来验证这些基因的功能和对精子发生的影响及作用的分子机制。 运用基因芯片分析具有染色体分离错误的睾丸基因表达方案，与正常睾丸基因表达方案比较，找出差异表达显著的基因，结合生物信息学方法对差异表达显著的基因进行染色体定位，然后对这些基因再用实时定量RT-PCR来确认。运用基因敲除、RNA干扰或转基因小鼠动物模型来验证这些基因的功能，并根据这些基因的功能进一步分析重组交换异常导致染色体分离错误、非整倍体形成的分子机制。 利用RNAi、凝胶迁移或电泳迁移率检测技术、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀和已建立的小鼠动物模型研究类固醇激素调节重组交换、染色体分离关键基因表达、转录的分子机理，以探讨影响重组交换、精子发生的因素和机制。 2.2 减数分裂联会缺陷致精子发生异常的分子机制 同源染色体之间的联会缺陷可引起减数分裂进程阻滞，配子发生障碍，导致无精症的发生，但联会缺陷引发无精症确切的机制尚不清楚。 分别获取正常及不育的人类睾丸组织，运用免疫荧光细胞遗传学方法，鉴定不育患者减数分裂前期的不同时期，减数分裂停滞的时期；定位不联会区域发生在哪些常染色体上；确定不联会区域出现的频率，其与性染色体在减数分裂时期的关联，基因沉默相关蛋白γH2AX等、RNAi途径相关蛋白如MIWI等在不联会区域和性染色体上的表达情况，鉴定性染色体和不联会区域是否发生了基因沉默及miRNA在联会异常中的功能和作用机制。 运用流式细胞仪和免疫荧光技术筛选出减数分裂前期各亚期细胞，通过基因芯片分析全面了解这些时期细胞差异表达的基因，结合生物信息学方法对差异表达显著的基因进行染色体定位，确定性染色体和含不联会区域的常染色体上分别有哪些基因发生改变；对这些基因再用实时定量RT-PCR来确认，并根据这些基因的功能进一步分析联会缺陷导致减数分裂停滞的机制。运用miRNA基因芯片技术构建正常及不育的人类睾丸组织miRNA表达谱，通过比对获得差异表达miRNA，来研究其对联会异常相关基因的调控和对精子发生的影响。 3．环境-基因交互作用与男性不育 结合上述代表性EDCs所致效应的分子机制以及遗传机制的研究结果，采用非参数回归分析的方法研究个体易感性与EDCs交互作用致男性不育的模式和强度，有机整合各类标志物，建立EDCs危险度评价模式，为高危人群筛检提供依据。再以模式动物为基础，验证环境-基因交互作用，并深入阐述其作用机理。 3.1男性不育基因组高通量遗传多态性筛检 选择精子发生、EDCs代谢、DNA损伤修复、细胞凋亡、生殖激素调控相关基因，同时选择内容一和内容二发现的EDCs导致精子异常的可能靶基因或信号通路，综合运用“以序列为基础”和“连锁不平衡图谱法为基础”的SNPs选择策略，对100个左右的基因1500个位点进行高通量的基因多态性研究，寻找EDCs导致男性不育个体差异的易感基因，并揭示其分子机制。 3.2男性不育人群表观遗传靶点的鉴别 在男性不育基因组高通量遗传多态性筛检的基础上，结合动物模型的表观遗传研究，选择阳性关联的基因，研究其组蛋白乙酰化水平和精子基因组CpG岛甲基化模式与男性不育症的关系，揭示男性不育人群的表观遗传基础及其在个体对于EDCs易感性差异中所起的作用。 3.3环境-基因交互作用致男性不育的分子机理研究 首先结合男性不育遗传和表观遗传易感性标志物，采用非参数回归分析的方法考察其与EDCs交互作用致男性不育的模式和强度，在此基础上有机整合各类标志物和可用于筛检的分子靶标，利用生物统计学和生物信息学方法，初步建立EDCs危险度评价模式，作为筛检高危人群的依据。然后以模式动物为基础，采取析因设计方法，针对产生交互作用的环境和遗传/表观遗传因素进行分组，验证该环境-基因交互作用，并深入探讨具体的作用机理和作用靶标。 4．精子异常与常见出生缺陷 染色体病和先天性心脏病是最常见的出生缺陷，两者发病率的总和占据了总出生缺陷近1/4。本课题以Y染色体数目或结构异常为染色体病的代表，以心脏圆锥动脉干畸形为先天性心脏病的代表，探讨常见出生缺陷发病的父源性原因。 4.1父源性出生缺陷相关致病基因的筛选 应用比较基因组杂交和生物芯片相结合的新型array CGH技术，辅助以基因组扫描、差异甲基化杂交和基因测序等方法，分析大样本常见染色体疾病和先天性心脏病患儿父亲的精子、血液和患儿血液白细胞中的DNA序列。特别关注异常序列或异常修饰位点在父子DNA间是否相同。对于父子间相同的异常DNA信息，进行生物信息学和生物统计学分析，最终确定这些异常的位点是否为常见染色体病或先天性心脏病的致病候选基因或致病基因。 4.2致病基因在出生缺陷发生中的作用及机理 将筛选出的染色体病或先天性心脏病致病候选基因单个或联合在神经干细胞和心肌干细胞中上调、下调或敲除，观察它们对干细胞分化和细胞功能的影响。然后应用基因打靶和转基因技术，在精子或受精卵水平对上述发现的疾病候选基因分别或组合上调、下调或敲除，观察胚胎发育过程的变化及出生缺陷的发生情况。特别关注本课题组及他人在前期研究中发现的8个先天性心脏病可能的候选致病基因的功能，它们是转化生长因子β2(TGFβ2)、维甲酸核内受体(RXRα)、 Vangl2、细胞缝隙连接蛋白43(Cx43)、Pax3、内皮素-1(ET-1)及其转化酶和HIRA。 二、预期目标 总体目标： 通过本项目的完成，建立国际一流的研究男性生殖健康的现代技术平台，在初步阐明代表性EDCs与遗传因子交互作用引起精子异常，从而导致男性不育和出生缺陷的分子机制的基础上，提出以机体对EDCs的应答为基础、以早期生殖损害为核心、以生物标志物为目标的“导向预防”新理论，为建立男性不育个性化诊断和筛查出生缺陷人群的新方法提供理论依据。同时造就出一支具有国际影响力、学科交叉性强、能够独立从事科学研究的创新人才队伍。 5年预期目标： 具体考核指标如下： 1. 阐明代表性EDCs致精子异常，在分子、细胞、器官和系统多层面上的作用靶标和分子机制，发现与精子异常相关的接触、效应和易感生物标志物。 2. 揭示遗传因子如减数分裂重组交换和联会改变导致男性不育和出生缺陷的分子机制，并找出其影响因素。 3. 建立个体遗传/表观遗传背景与EDCs暴露交互作用致男性不育的危险度评价模式和强度，了解交互作用致男性不育的分子机理。 4. 明确精子异常与染色体病和先天性心脏病之间的关系,认识父源性出生缺陷的病因。 5. 发表SCI论文60-70篇，其中影响因子>5的论文8-10篇；培养硕士和博士研究生60-80名，博士后6-10名；获得2-3项具有自主知识产权的发明专利。 三、研究方案 总体研究思路： 环境因素、遗传因素及其交互作用可引起精子异常，精子异常是导致男性不育和父源性出生缺陷的主要原因。本项目抓住最常见的环境因素-EDCs和最重要的遗传因素-减数分裂重组交换这两个方面，来阐明这些因素作用的分子机制。为此，应用蛋白质组学、代谢组学、功能基因组学、表观遗传学、生物信息学等多种研究方法，分别在分子、细胞和系统层面上深入探讨：1) EDCs导致精子异常的分子靶标和机制；2) 遗传因子如重组交换及相关事件导致精子异常的分子机制；3) 环境-基因交互作用致男性不育的模式、强度及其分子机制；4) 精子异常与常见出生缺陷发生的关系。在实施策略上，先观察各种因素作用的特征，然后用各种组学技术，筛选在关键作用节点上特异表达的基因/蛋白质，并深入研究其功能及调控机制。 技术路线： 本项目将利用已经搭建好的技术平台如动物染毒模型和转基因动物模型，通过下述方法或技术分别在分子、细胞和系统几个层次来阐明主要环境和遗传因素引起精子发生异常的分子机制。 1. 基因水平： 应用基因芯片、miRNA芯片、比较基因组杂交芯片(CGH)、差异甲基化杂交芯片(DMH)和SNPs等筛选差异的基因及其多态性、甲基化水平；运用原位杂交、Northern blot、real-time PCR、CHIP、EMSA等技术检测基因在所研究细胞和组织中的转录表达、定位及调控。 2. 蛋白质水平：利用酶反应学、代谢组学技术手段鉴定EDCs的体内代谢过程和关键代谢产物；应用双向电泳及MALDI-TOF质谱鉴定、酵母双杂交和免疫共沉淀等技术研究蛋白质功能及蛋白质间的相互作用。 3. 细胞与整体水平：采用RNA干扰技术和睾丸特异的部分基因敲除/过表达技术，建立标志性分子的模式动物，研究基因/蛋白质的功能。 4. 人群研究水平：采用流行病学、分子生物学、代谢组学、生物统计学等手段，研究代表性EDCs暴露与人群精子异常及出生缺陷的关系，寻找接触、效应和易感性生物标志物。人群研究遵循伦理学原则，并获所在单位伦理委员会的批准。 5. 运用生物信息学和生物统计学方法，建立遗传和表观遗传易感性与EDCs交互作用致男性不育的危险度评价模式，为高危人群的筛检提供依据。 可行性分析： (1) 研究对象明确 环境污染物种类繁多，本研究选择污染严重、并已初步证明与男性不育相关的七类代表性EDCs进行研究，为整体研究结果的获得提供了保证。遗传重组及其相关重要事件与精子发生之间的关系业已明确，而且其异常可导致男性不育和非整倍体形成的观点也得到证实，这为深入研究遗传因素作用的分子机理打下了坚实可靠的基础。 (2) 前期研究已取得初步结果 项目组已建立了环境化学物检测、遗传基因分析、蛋白表达、基因多态性检测等高通量技术平台和生物统计、生物信息学分析方法，部分达到了国际先进水平。研究论文先后在Am J Hum Genet、J Cell Biol、Hum Mol Genet、Am J Pathol、Endocrinology、Proteomics等各专业高水平的SCI杂志上发表。 (3) 我国有丰富的人群资料和特有的现场研究资源 拥有数量众多的暴露人群，也已经积累了大量男性不育和常见出生缺陷的病例和大型环境、职业流行病学调查资料。 (4) 本项目集中了我国在生殖医学和环境医学等研究领域中的优势力量 在技术上，有多个国家级 (微尺度物质科学国家实验室、生物技术国家重点实验室)和省部级 (江苏省生殖医学重点实验室、现代毒理学教育部重点实验室、分子医学教育部重点实验室) 重点实验室的技术与条件支撑；在人才上，各课题负责人和学术带头人均有着丰富的学术背景和研究经验，其中大多数都主持或参加过生殖相关领域的主要研究计划。这些正体现了本研究领域强-强联合和多学科协作的优势。 创新点： 1. 在学术思路上，以精子异常为核心，以环境-基因交互作用为主线，以代表性EDCs代谢特征分析和遗传重组分析为切入点，研究精子异常致男性不育和父源性出生缺陷两类结局的病因及其分子机制，具有明显的创新性。 2. 在研究内容上，应用细胞和分子生物学的高通量技术平台和高新技术，结合中国环境污染特点和我国汉族人群的遗传特征，系统研究男性不育和出生缺陷发生的分子机制，凸显中国特点。而基础与临床相结合、人群与模式动物相结合，使本项目的研究既有深度又有系统性，能够产生具有创新性的、有自主知识产权的研究成果。 3. 在研究方案上，从代表性EDCs到生物标志物，从单一遗传基因/蛋白到作用网络，紧密结合人群和动物模型的研究，改变过去从单一暴露出发或从单一基因/蛋白出发的研究方式，同时重视研究机体遗传易感性的差异。 4. 在技术路线上，结合国内外研究现状和自身研究基础，建立和应用敏感、高效的高通量技术平台，发现遗传、表观遗传变异与EDCs交互作用致男性生殖损害的生物学剂量和效应标志物，提高危险度评价的精度，具有效率高，针对性强等优点。 课题设置： 根据本项目的预期目标“揭示环境和遗传因素导致男性不育与出生缺陷的分子机制”，确定解析代表性EDCs、遗传因子改变及其交互作用引起精子异常的分子机制，精子异常与出生缺陷的关系为4个研究重点。为了有效组织研究力量、围绕主攻目标，将总任务分解为4个各有侧重又紧密关联的课题，分别是： 课题一：环境因素导致精子异常的分子机制 研究目标：以代表性EDCs致精子异常的病因学研究为主线，阐明EDCs的代谢特征、导致精子异常的作用靶标和分子机制，发现和发展与精子异常相关的接触和效应性生物标志物。 研究内容： 1、代表性EDCs的代谢特征及其与精子异常的关系 主要研究代表性EDCs的关键代谢酶及其代谢特征， 阐明EDCs代谢与精子异常之间的相关性，寻找并验证接触性生物标志物。 2、代表性EDCs致精子发生异常的分子靶标 主要研究代表性EDCs对下丘脑-垂体-睾丸轴系统以及精子发生、成熟过程不同环节中的基因、蛋白质和miRNA的影响，初步阐明代表性EDCs对雄性生殖损害的靶点及其分子途径。 承担单位：南京医科大学、中国农业大学 课题负责人：王守林 教授 经费比例：25% 课题二：遗传因素导致精子异常的调控机理 研究目标：阐明重要遗传因子如减数分裂同源染色体重组交换、联会等改变在精子发生异常中的作用及其分子机理，并分析引起这些遗传因子改变的因素。 研究内容： 1、减数分裂重组交换异常引起精子发生异常的分子机制 主要研究重组交换相关蛋白的分布与精子发生停滞、染色体分离异常之间的联系，相关蛋白间相互作用引起精子异常的分子机制及关键基因/蛋白作用的分子机理。并探讨激素调控重组交换关键基因表达、转录的分子机理。 2、减数分裂联会缺陷引起精子发生异常的分子机制 主要研究减数分裂前期同源染色体联会异常与精子发生停滞之间的关联，联会缺陷影响减数分裂基因表达的模式及其分子机制，miRNA调控联会异常的分子机理。 承担单位：中国科学技术大学、中国农业大学 课题负责人：孙斐 教授 经费比例：25% 课题三：环境-基因交互作用与男性不育 研究目标：揭示遗传和表观遗传易感性与EDCs暴露交互作用致男性不育的机理，初步构建EDCs致男性不育的危险度评价模式。 研究内容： 1、男性不育基因组高通量遗传多态性筛检 通过运用“以序列为基础”和“连锁不平衡图谱法为基础”的SNPs选择策略，对靶基因的位点进行高通量的基因多态性研究，寻找EDCs导致男性不育个体差异的易感基因，并揭示其分子机制。 2、男性不育人群表观遗传靶点的鉴别 主要研究关联基因的组蛋白乙酰化水平和精子基因组CpG岛甲基化模式与男性不育症的关系，揭示男性不育人群的表观遗传基础及其在个体对于EDCs易感性差异中所起的作用。 3、环境-基因交互作用致男性不育的分子机理研究 主要是在初步建立EDCs危险度评价模式基础上，运用模式动物，针对产生交互作用的环境和遗传/表观遗传因素，来验证该交互作用，并深入探讨具体的作用机理和作用靶标。 承担单位：南京医科大学 课题负责人：周作民 教授 经费比例：25% 课题四：精子异常与常见出生缺陷 研究目标：明确精子异常与常见出生缺陷如染色体病和先天性心脏病发生之间的关系及分子机理，认识父源性出生缺陷的病因。 研究内容： 1、父源性出生缺陷相关致病基因的筛选 主要是通过获取常见染色体疾病和先天性心脏病患儿和其父亲基因的异同信息，应用基因连锁或关联分析来寻找致病基因。 2、致病基因在出生缺陷发生中的作用及机理 主要是应用基因打靶和转基因技术，在精子或受精卵水平研究致病基因在胚胎发育过程及出生缺陷发生中的作用及其分子机制。 承担单位：复旦大学 课题负责人：马端 教授 经费比例：25% 课题一研究EDCs致精子异常的分子机制和分子靶标；课题二研究遗传因子改变对精子发生的影响；课题三通过探讨不同个体对EDCs易感性差异的分子基础，揭示环境(课题一)-遗传(课题二)交互作用导致男性不育的分子机理；经验证的交互作用又可为课题一、二提供新的理论依据。在不同的调控机制下，环境因素(课题一)和遗传因素(课题二)引起的精子异常，又可导致出生缺陷的发生(课题四)，课题四研究精子异常与出生缺陷的关系及其分子机制。因此，本项目四个课题既相互独立，各有侧重，又紧密联系，浑然一体，研究的结果可为项目总体目标和五年目标-“建立男性不育个性化诊断和筛查出生缺陷人群的新方法”提供理论依据。 四、年度计划 研究内容 预期目标 第 一 年 1． 收集男性不育和出生缺陷(先天性圆锥动脉干和染色体相关严重智力障碍畸形)病例和标本，初步规划职业人群研究现场。 2． 筛选EDCs代谢酶基因；建立EDCs染毒动物模型，确定EDCs损伤下丘脑-垂体-睾丸轴和围生期性腺发育的作用位点；利用高通量筛选技术构建精子发生不同阶段的基因、蛋白质、miRNA表达谱。 3． 用免疫荧光细胞遗传学和FISH等方法对重组交换相关蛋白分布、表达进行分析；利用MSP进行重组交换相关基因甲基化分析。 4． 综合运用“以序列为基础”和“连锁不平衡图谱法为基础”的SNPs选择策略，结合已有研究结果，完成生物信息学分析，确定候选SNPs，并进行预实验。 5． 应用全基因组扫描和array CGH测定出生缺陷患儿及父母样本，筛选出相关基因；再在心肌干细胞和神经干细胞中验证。 1． 筛选出EDCs的代谢酶；初步建立EDCs动物染毒模型，确定EDCs作用位点；初步构建与精子发生相关的基因、蛋白质和miRNA表达谱，筛选相关候选靶标。 2． 明确男性不育中重组交换相关蛋白的分布差别，鉴定出差异表的甲基化水平。 3． 确定候选SNPs、阳性关联的基因。 4． 初步确定先天性圆锥动脉干和染色体相关严重智力障碍畸形相关基因。 5． 在SCI期刊发表4-6篇论文 6． 培养8-10名硕士生、4-6名博士生，博士后2-3名。 第 二 年 1． 开展1-2种关键EDCs的高暴露职业人群研究工作，通过EDCs代谢特征分析，建立人群EDCs内暴露检测方法；结合定点染毒动物模型，分析EDCs调控中枢功能、精子发生和性腺发育的作用及其通路。 2． 鉴定有染色体分离错误和染色体不联会的不育睾丸组织中差异表达的基因/蛋白，以及miRNA的调控机制，构建基因修饰小鼠模型。 3． 开展基因多态性、基因的组蛋白乙酰化水平/CpG岛甲基化和差异miRNA与男性不育之间的关联研究，寻找EDCs导致个体差异的遗传易感标志物。 4． 在心肌干细胞和神经干细胞中验证全基因组扫描和array CGH筛选出的基因的功能和作用机制。 1． 初步筛选出EDCs主要代谢产物；阐明EDCs扰乱下丘脑-垂体-睾丸内分泌轴和精子发生的机制和作用通路。 2． 阐明联会缺陷、重组交换异常和男性不育、非整倍体之间的关联和调控机理。 3． 发现与男性不育相关的遗传易感生物标志物。 4． 进一步确定先天性圆锥动脉干和染色体相关严重智力障碍畸形相关的基因。 5． 在SCI期刊发表10-12篇论文，其中影响因子>5的论文1-2篇。 6． 培养10-12名硕士生，8-11名博士生。 7． 申请国家发明专利一项。 第 三 年 1． 结合EDCs高暴露职业人群和动物染毒模型研究，初步筛选内暴露标志物；分析男性不育人群关键EDCs因子的内暴露水平；构建基因修饰动物模型进一步验证这些标志物的功能和作用机制。 2． 筛选重组交换相关蛋白、联会缺陷相关基因，确定蛋白相互作用的改变影响精子生成的分子机制和miRNAs、类固醇激素对这些基因表达、转录的调控机理。 3． 结合报告基因分析和转基因动物模型等体内外试验，初步揭示遗传易感标志物发挥作用的分子机制；同时采用多元Logistic回归和MDR等方法，初步阐明产生交互作用的环境和遗传/表观遗传因素。 4． 通过研究候选基因表达产物的结构和启动子活性，建立部分候选基因修饰的斑马鱼或小鼠动物模型，进一步确定这些基因的功能和作用途径。 1． 筛选出精子异常的内暴露标志物的候选物质，鉴定出EDCs作用的分子途径和机理。 2． 筛选出重组交换、联会缺陷相关基因/蛋白，明确miRNAs和类固醇激素调节这些基因表达的分子机制。 3． 验证遗传易感标志物，揭示其作用机制；初步阐明产生交互作用的环境和遗传/表观遗传因素。 4． 明确候选基因表达产物是否存在缺失、移码突变和功能变化，启动子活性是否受到影响。 5． 在SCI杂志中发表论文13-17篇，其中影响因子>5的论文2-3篇。 6． 培养硕士生9－11名，博士生10-13名，博士后1-2名。 第 四 年 1． 继续完成EDCs职业暴露人群接触生物标志物的研究；运用染毒动物模型和基因修饰动物模型深入研究 EDCs对性腺轴系统中激素、精子异常/围生期性腺发育相关基因/蛋白的影响及分子机制。 2． 筛选出关键的染色体重组交换相关蛋白，运用基因修饰小鼠模型来验证这些基因的功能，同时结合体内外实验阐明miRNAs、类固醇激素调控这些基因表达的分子机制。 3． 整合各类标志物和分子靶标，利用生物统计学和生物信息学方法，初步建立交互作用的危险度评价模式，并以动物模型和细胞模型为基础，采取析因设计方法，验证该环境-基因交互作用模式和强度。 4． 建立部分候选基因修饰的斑马鱼或小鼠动物模型，研究候选基因的发病机制。 1． 阐明职业性暴露EDCs对精液质量的影响和EDCs致精子异常的分子途径和作用机理。 2． 明确染色体重组交换蛋白在精子发生过程中的作用和调控机制。 3． 初步建立环境-基因交互作用的危险度评价模式。 4． 明确2-3种候选基因的发病机制。 5． 在SCI杂志中发表论文13-16篇，其中影响因子>5的论文2-3篇。 6． 培养硕士生10-12名，博士生11-14名，博士后1-2名；申请国家发明专利1-2项。 第 五 年 1. 根据上述研究内容的进展，进一步补充研究数据，阐明EDCs、重组交换异常、环境-基因交互作用导致精子异常进而引起男性不育的机理，以及出生缺陷相关基因的作用机制。 2. 完成论文的撰写与发表，提交研究总结报告。 1． 完成环境、遗传及其交互作用导致精子异常的分子机制的研究。 2． 发表SCI论文14-17篇，其中影响因子>5的论文2-3篇。 3． 培养硕士生10-13名，博士生12-16名，博士后1-2名。 4． 获得国家发明专利一项。 17