宏基因二代测序技术在肺部阴影发热病例诊断中的应用价值.pdf

宏基因二代测序技术在肺部阴影发热病例诊断中的应用价值朱艳 陈众众 刘家昌 【摘要】目的 探讨支气管肺泡灌洗液()病原宏基因二代测序()技术在肺部阴影发热病例诊断中的价值 方法回顾性分析我科收治的 例病例均收集 同时行病原 及传统检测(微生物培养 涂片镜检)比较两种方法诊断效能并分析 结果的影响因素 结果 以最终诊断为准 与传统检测比较:病原阳性率 、灵敏度 、阴性预测值 、诊断符合率 、混合感染检出率 组明显优于传统组()且 检出病原种类、数量及时间有明显优势经二元 分析基础疾病数量、发热可能是 阳性结果的影响因素检测公司及抗生素使用时间影响较小 结论 与传统检测相比 的病原 检测高效快速有助于肺部阴影发热病例诊断和鉴别诊断【关键词】肺部感染支气管肺泡灌洗液宏基因二代测序 ()【】()().().:().【】:./.基金项目:淮南市科技项目.淮科规()号作者单位:安徽 淮南安徽理工大学第一附属医院(淮南市第一人民医院)呼吸与危重症医学科 肺部阴影发热病例临床常见病因多样 在病因尚未明确的情况下即开始抗感染药物诊断性治疗导致非感染性疾病延误诊断及耐药菌增加下呼吸道感染是世界各地高发病率及死亡率主要病因重症、混合及慢性感染诊治是目前棘手问题传统病原检测阳性率不尽人意肺部影像类似感染性疾病的非感染病例误诊误治普遍存在 支气管肺泡灌洗液()较好的应用于肺部疾病的诊断 宏基因二代测序技术()是将标本的 或 鸟枪法测序对样本进行测序前预处理、核酸提取富集、病原核酸序列与庞大微生物数据库进行比对实现对病毒、真菌、细菌、寄生虫等的全面检测 本文探讨 的病原 检测技术对肺部阴影诊断价值资料与方法一、临床资料临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期 研究对象主要收集我院呼吸与危重症医学科 年 月至 年 月收治的肺部有阴影或伴有发热拟诊肺部感染的患者 例所有患者均行传统病原检测及 的病原 检测 其中男性()例女性()例年龄 岁 平 均 年 龄()岁 发 热()例不发热()例 入组标准()胸部 提示肺部阴影伴或不伴发热的患者拟诊肺部感染性疾病经至少 小时规范经验性抗感染治疗体温等症状无改善胸部 复查肺部病灶无吸收或进展怀疑特殊病原体感染或免疫抑制宿主合并肺部感染常规病原检查未能明确病原诊断的患者 经我科至少 名高级职称医师会诊建议行 检查的患者()有支气管镜检查指征患者及家属同意行支气管镜检查及 检测 本项研究通过安徽理工大学第一附属医院(淮南市第一人民医院)伦理委员会审批(伦理号:伦审)且均知情同意 排除标准()不能耐受或不同意行支气管镜检查及 检查()资料不完整的患者()经过系列检查诊断不明确二、方法 支气管肺泡灌洗液留取及送检电子支气管镜进行检查 标本收集:()部位:以患者近期的胸部 为依据如提示双肺弥漫性病变支气管肺泡灌洗部位即选择右肺中叶或左肺舌叶如为局部病变即选择病灶明显或新进展肺段、亚段将支气管镜前端嵌顿在目标支气管树分叉处连续多次注入 生理盐水以 左右负压吸引()灌洗量:每次 总量 灌洗中更换灌洗液标本收集瓶第一瓶灌洗液 送传统病原检测第二瓶 送 检查()标本送检:分钟内送本院微生物实验室行传统病原检测包括涂片染色、微生物培养第二瓶标本于 分钟内由相关检测公司专员保存及时外送 检测盛标本的容器由检测公司提供专用标本瓶放入配备的一次性密封袋及时密封、保存外送 常规病原标本检查及其他相关检查入院患者常规行痰微生物培养及涂片染色检测、血培养(发热患者采集)检查送检严格按照呼吸系统疾病生物样本采集保存储藏管理技术标准和规范除此之外每位患者均行炎性指标、生化指标、影像检查必要时行血清免疫学、聚合酶链反应()或支气管肺组织病理等其他相关检测 传统病原检测仪器和方法美国 公司细菌鉴定仪 血平板、麦糠凯平板、沙保罗平板、念珠菌显色及巧克力琼脂培养基涂片采用革兰氏染色、抗酸染色必要时某些特殊染色 检测公司 北京博奥、杭州杰毅两家公司均行 及 基因检测两家公司随机选送博奥 例、杰毅 例三、诊断标准及观察指标 诊断标准 按照我国 年成人社区获得性肺炎及美国 年成人医院获得性和呼吸机相关肺炎的临床实践指南 诊断依据 传统病原检测结果、病原 结果、其他系列临床实验室检查及肺组织病理结果、胸部影像动态变化资料、药物调整情况及治疗反应等综合分析 由各治疗组主治医师、至少 名高级职称医师同时确定的诊断 观察指标 组与传统检测组两组分别记录阳性病例数、阴性病例数、检出病原体类型及株数、混合感染病例数、治疗方案调整、调整后治疗效果、最终诊断、患者一般资料、炎性指标、相关实验室检查及胸部影像资料等四、统计学分析采用 统计软件对数据进行分析计量资料以均数 标准差()表示组间比较采用 检验计数资料采用()表示 组间差异比较采用非参数检验检测结果因素分析采用二元 回归分析方法 为差异有统计学意义结 果一、胸部影像特点及最终诊断 例病例肺部影像资料:主要表现为肺部斑点、片状浸润影()例磨玻璃等间质改变()例实变阴影()例结节肿块影 ()例 空洞 ()例 胸腔积液()例支气管壁增厚、囊状、柱状、串珠状表现()例局限一个肺叶段()例 个肺叶()例 个及以上肺叶()例 最终诊断肺部感染性疾病()例非感染性疾病()例 间质性肺炎 例(其中合并类风湿性关节炎 例、合并干燥综合症 例、隐源临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期性机化性肺炎 例、感染后机化性肺炎 例)肺恶性肿瘤 例弥漫性肺泡出血 例支气管扩张伴咯血 例二、两组病原体检出率比较 例中 例 检测病原体阳性 例传统检测病原体阳性两组病原体阳性率 (:)(:)经 检 验()差异有统计学意义 方法病原体检出率优于传统检测组结果(见表)表 与传统检测方法病原体检测结果交叉表()传统检测方法阴性阳性总计 检测方法 阴性 阳性总计 三、两组检测结果与临床最终诊断比较根据(表)的 检测与传统检测相比:灵敏度 、混合感染检 出 率 、阴性预测值 、诊断符合率 检测组明显优于传统检测组具有统计学意义()两组特异度 检测组逊于传统检测组阳性预测值 两组相当表 支气管肺泡灌洗液病原 测序、传统病原检测与临床最终诊断的比较()临床最终诊断 检测()阳性阴性合计传统病原检测()阳性阴性合计有感染非感染合计四、两组检测病原体分布(图)所示:组共检出病原体 株病原体 分 布:细 菌 株()病 毒 株()支 原 体 株()真 菌 株()传统检测组共检出病原体 株:细菌 株()真菌 株()组检出病原体数量及种类明显优于传统检测组()五、两种检测方法混合感染检出率比较 例感染性病例中两种检测方法检出混合感染比较:组有 例检出病原体同时检出两种及两种以上病原体(以下简称混合感染)例检出率 (/)而传统检测方法 例病原检测阳性混合感染(最多检出两种病原体)例检出率 (/)(见表)两组混合感染检出率比较 采用 秩和检验()组优于传统检测组其中两组检出病原体完全一致 例部分一致 例不一致 例 六、混合感染与患者合并基础疾病数量相关图 的病原 检测方法与传统方法检出病原体种类分布比较表临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期表 感染性病例两种检测方法检出混合感染比较()检测方法检出病原体个数未检出病原体检出 种病原体检出 种及以上病原体总计 检测方法传统检测方法合计 检出 例混合感染病例中 例患者伴有一种或一种以上慢性基础疾病有基础疾病病例占感染性病例 (/)无基础疾病仅占比(/)检测组检出单一病原体的 例合并基础疾病为 例无基础疾病为 例(表)显示:与无基础疾病相比合并基础疾病患者更容易获得混合感染表 方法检出病原体数量与患者合并基础疾病数量之间关系交叉表()病原体个数一种病原体混合感染总计基础疾病个数 无基础疾病(.)(.)一种基础疾病(.)(.)两种及以上基础疾病(.)(.)总计(.)(.)注:.皮尔逊卡方.七、预测 阳性结果的影响因素利用 二 元 回 归 分 析 方 法 将 检测结果(赋值:阴性 阳性)作为因变量使用 软件的逐步回归法筛选自变量确定选入的检验水准为 入 剔除标准 出 首先将 个个案以诊断(感染和非感染)为界定进行拆分感染组和非感染组分别同时回归分析 感染组回归分析结果分为两种情况:(表)提示:()基础疾病及发热两变量在回归结果中显著性 提示基础疾病数量、发热可能是预测 阳性结果的正向影响因素()检测前抗感染药物使用天数、检测公司、血 反应蛋白、降钙素原其他变量回归分析中无统计学意义影响(值均 )非感染组以上所有变量在二元 回归分析所得 值均 无统计学意义影响在此不再展示 本研究的病例数不多尤其非感染病例可能会影响分析结果需扩大样本量进一步验证表 检测结果与多种因素二元 回归分析影响因素 的置信区间下限上限基础疾病数量.有无发热().注:分类变量有无发热以无发热为对照显著性提示 有统计学意义的影响内戈尔科 方 对数似然 讨 论肺部阴影发热病例的病因通常考虑两种可能感染性疾病或非感染性疾病伴或不伴有感染诊断的需求是高效病原检测技术明确感染性疾病病原体或者阴性结果协助非感染性疾病诊断 目前传统的病原检测技术如痰、等标本微生物培养及涂片染色显微镜、血清抗原抗体等检查病原检出率低本文阳性率仅占 与相关文献相似这远不能满足临床需要近年来 技术应用于临床感染性疾病的病原微生物检测 该技术无需培养一次性检测上千种病原微生物 本研究对 例患者的 行 病原检测并与传统病原检测方法比较结果显示两组在病原检出率、灵敏度、诊断符合率、混合感染检出率方面具有显著差异()与相关报道相符 例 的 检出株微生物明显优于传统组 株且病原体种类也优于后者前者在检出结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、病毒、厌氧菌、非典型病原体方面具有明显优势相关报道复杂、少见、新发原体检测率 检测也有明显优势且出结果时间 小时而传统病原检测检出的病原体种类有限微生物培养结果时间较长细菌 天、真菌 天、分枝杆菌 天左右 与传统检测相比 检测高效快速高灵敏度的 检测结果判读是关键 本研究 检出的阳性结果中 为假阳性分析其原因考虑呼吸道本身的寄生菌或污染菌而非致病菌 由于 对标本微生物遗传序列强大的检测能力检出病原考虑定植菌、致病菌或污染菌三种可能 检测阳性结果判读 针对不同的病原菌判断方法不一致 比如检出明确致病菌(如奴卡菌、新型隐球菌、肺结核分枝杆菌)和条临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期件致病菌(铜绿假单胞菌)、呼吸道定植菌如白色念珠菌或者其他罕见病原菌检测结果的判断方法不同 另一方面本研究特异度 阴性结果中的为假阴性结果考虑以下可能:()检测技术不成熟尤其对 病原体 本研究为 及 全基因检测理论上对 及 病原行全面检测 但从检测病毒种类看主要以 病毒为主 病毒检出有限可能与 容易被相关酶降解有关标本采集、保存、转运及 检测流程不同等各环节对病毒检出均可能造成影响()标本中病原微生物含量少()有些核酸提取困难的微生物如结核分枝杆菌等 这类标本结果阴性应谨慎判断 对阴性 检测结果的判读需分析标本检测结果为未达到特定阈值还是确实不存在病原微生物确诊 例感染性病例 检出的 例混合感染中的 例(占 )合并一种或一种以上基础疾病伴有糖尿病 例、支气管扩张 例、慢性阻塞性疾病或慢性支气管炎 例、间质性肺炎 例(其中 例合并类风湿性关节炎)、恶性肿瘤 例、系统性红斑狼疮 例、肝功能不全 例、脑出血 例、肾病综合症 例还有其他心脑血管等多种共病存在 这些患者存在免疫功能受损肺部感染重有的呈慢性迁延状态感染病原体多较复杂经验抗感染治疗效果大多不佳 本研究提示多种基础疾病共存是混合感染高发因素也是 阳性结果正向影响因素且检测前抗感染药物使用时间对 检测结果影响较小与传统方法相比 方法可能更有优势对此类患者现有传统检查不能确定的诊断有条件者可以建议尽早行 检测施行目标病原抗感染治疗缩短病程 等研究发现重症肺炎患者 检测组 天、天病死率可显著降低宏基因二代测序技术也被报道可用于“排除”检测即检测阴性有助于排除感染性疾病的诊断 以最终诊断为标准 阴性检测结果最终判断假阴性 例、真阴性 例本文 检测阴性 预 计 值 而 传 统 检 测 阴 性 预 测 值 前者明显优与后者与传统病原检测比 可协助排除感染疾病或非感染疾病合并感染的可能 非感染性疾病 例中诊断粘液性肺腺癌 例主要表现为肺炎样表现无发热抗感染病灶无吸收炎性指标基本正常鳞癌 例患者表现为阻塞性肺炎表现抗感染治疗后病灶在同一部位反复出现有明确吸烟史偶见痰血间质性肺炎主要表现双肺多发磨玻璃阴影偶伴有胸腔积液这类患者伴有皮疹、关节疼痛及其他脏器功能受损、血沉、反应蛋白增高而 往往不高抗感染治疗症状改善不佳及影像不吸收咯血病例 例表现为局部渗出样表现气管镜检查中往往可以看到局部或多处支气管粘膜或管腔出血表现我科收治的类似肺炎样表现的肺栓塞病例有发热、肺部渗出影炎性指标可以升高二聚体进行性增高询问病史有肺栓塞高危因素存在 概而言之胸部影像提示类似肺炎样表现的非感染病例如间质性肺炎、恶性肿瘤、咯血、肺栓塞病例等等部分病例可发热、炎性指标可能升高高灵敏度的 检测可有假阳性结果如本文假阳性结果 例其中 例 检测阳性抗感染治疗病灶无吸收后结合肺组织病理考虑隐源性机化肺炎予肾上腺糖皮质激素治疗定期随访病灶吸收良好 临床有肺炎样表现或伴发热的非感染病例易误诊为感染性疾病诊断需结合传统病原检测、结果、化验室检查、病理结果、影像资料变化趋势、治疗情况及治疗后反应等病史资料注意鉴别诊断谨慎排除感染性疾病确定非感染性疾病诊断综上所述 作为一种新型的病原体检测方法高效快速在检出病原体的数量、种类、诊断灵敏度、诊断符合率等方面具有明显优势 近几年较多文章报道 在感染性疾病病原诊断中已经起着相当重要的作用非感染性疾病的排除诊断中也有一定的协助作用 但 病原检测技术目前仍不完善比如病原体核酸序列诊断阈值的标准不统一、背景菌与致病菌的鉴别及耐药菌基因的检测等 病原微生物检测技术在很多方面仍需要进一步改进 如果与多种传统病原检测方法联合并充分利用临床所有资料、药物调整情况及治疗反应等综合分析有利于提高下呼吸道病原检测灵敏度及特异度、临床诊断准确率 随着 技术不断完善、质量控制及价格方面下降该技术在肺部感染性疾病的诊断、鉴别诊断应用将有更广阔的应用前景参考文献 发热伴肺部阴影鉴别诊断共识专家组.发热伴肺部阴影鉴别诊断专家共识.中华结核和呼吸杂志 ():临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期.:.():.():.:.():.中华医学会检验医学分会临床微生物学组 中华医学会微生物学与免疫学分会临床微生物学组 中国医疗保健国际交流促进会临床微生物与感染分会.宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识.中华检验医学杂志 ():./.():.中华医学会呼吸病学分会.肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识(年版).中华结核和呼吸杂志 ():.国家呼吸系统疾病临床医学研究中心生物样本库专家组.呼吸系统疾病生物样本采集保藏管理技术标准和规范.中国医药导报 ():.中华医学会 中华医学会杂志社 中华医学会全科医学分会等.成人社区获得性肺炎基层诊疗指南(实践版).中华全科医师杂志 ():.:.():.:.李殷康 黎雨 李文涛 等.宏基因组二代测序在肺部感染患者病原微生物检测中的应用价值分析.内科 ():.:.():.():.():.():.():.:.:.():.():.():.():.:.():.:.():.:.():.收稿日期:临床肺科杂志 年 月 第 卷第 期