红花黄色素对TREM2沉默的APP_PS1小鼠学习记忆能力的影响.pdf

第 41 卷 第 4 期2023 年 8 月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University(Natural Science)Vol.41 No.4Aug.2023收稿日期:2023-01-03 基金项目:国家自然科学基金项目(81960665)作者简介:郑艳杰(1998),女,硕士研究生,专业方向为神经药理学研究。通信作者:胡艳丽(1976),女,教授,从事神经药理学研究,e-mail:wzx330 。DOI:10.13880/ki.65-1174/n.2023.22.021文章编号:1007-7383(2023)04-0498-09红花黄色素对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠学习记忆能力的影响郑艳杰1,张梦玉1,范艳慧2,叶红霞1,齐妍强1,贺颖西1,胡艳丽1(1 石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室,新疆 石河子 832002;2 石河子市人民医院,新疆 石河子 832000)摘要:目的 研究 TREM2 在红花黄色素(safflower yellow,SY)调节胶质细胞活化,改善 APP/PS1 小鼠学习记忆能力中的作用。方法 6 月龄 Wide Type 小鼠为 WT 组;同月龄 APP/PS1 小鼠(Tg)70 只,建立慢病毒(LV,lentivirus)介导的 TREM2 基因沉默的 APP/PS1 小鼠模型,分别为 Tg 组、Tg+LV 组、Tg+LV-C 组、Tg+LV+SY 30 mgkg-1组、Tg+LV-C+SY 30 mg kg-1组、Tg+LV+多奈哌齐 0.75 mg kg-1组、Tg+LV-C+多奈哌齐 0.75 mg kg-1组。给药后通过行为学实验评价痴呆小鼠的空间学习记忆和认知能力;免疫组织化学法观察小鼠脑组织 A 沉积及小胶质细胞活化标志物 Iba-1 的表达;酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定小鼠皮层组织中 IL-6、INF-、IL-4、IL-10 因子表达水平;蛋白免疫印迹技术(Western blot)检测皮层组织中 TLR4、p-NF-B p65/NF-B p65 的蛋白表达。结果 与 Tg 组小鼠相比,Tg+LV 组小鼠学习记忆能力下降,6E10、Iba-1 的阳性表达显著增加(P0.01),小鼠皮层组织中 IL-6、INF-的表达水平明显升高(P0.05 或 P0.01),TREM2 蛋白表达明显下降(P0.05),上调 TLR4 和 p-NF-B p65/NF-B p65 蛋白的表达;SY 30 mg kg-1 给药后可提高小鼠学习记忆能力,6E10、Iba-1 的阳性表达显著下降(P0.01),小鼠皮层组织中 IL-6、INF-的表达水平明显下降(P0.05 或 P0.01),IL-4 的表达水平显著升高(P0.01),上调 TREM2 蛋白表达,下调 TLR4 和 p-NF-B p65/NF-B p65 蛋白的表达。结论 TREM2 沉默加剧了 A 在大脑中的病理积累,减少炎症因子释放,SY 可以减少 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠脑组织中 A 沉积及小胶质细胞活化,通过抑制 TLR4 介导的 NF-B 信号通路,减少炎症介质释放,最终改善 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠学习记忆能力。关键词:红花黄色素;阿尔茨海默病;TREM2;神经炎症;小胶质细胞中图分类号:R965.1文献标志码:AEffects of Safflower yellow pigment on learning and memory in TREM2-silenced APP/PS1 miceZHENG Yanjie1,ZHANG Mengyu1,FAN Yanhui2,YE Hongxia1,QI Yanqiang1,HE Yingxi1,HU Yanli1(1 School of Pharmacy,Shihezi University/Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resource and Utilization,Ministry of Education,Shihezi,Xinjiang 832002,China;2 Shihezi Peoples Hospital,Shihezi,Xinjiang 832000,China)Abstract:Objective To investigate the effects of TREM2 on the regulation of glial cell activation by safflower yellow(SY)and the im-provement of learning and memory ability in APP/PS1 mice.Methods 6-month-old Wide Type mice were WT group.A mouse model of TREM2 gene silencing mediated by lentivirus(LV)was established with 70 APP/PS1 mice(10 mice in each group).They were Tg group,Tg+LV group,Tg+LV-C group,Tg+LV-C+SY 30 mg kg-1 group,Tg+LV+SY 30 mgkg-1 group,Tg+LV+Donepezil 0.75 mgkg-1 group and Tg+LV-C+Donepezil 0.75 mgkg-1group.The spatial learning,memory and cognitive ability of dementia mice were evaluated by behavioral experiments after administration.A deposition and the expression of microglia activation marker Iba-1 in mouse brain tissue were observed by immunohistochemistry.The expression levels of IL-6,INF-,IL-4 and IL-10 in mouse cortex 第 4 期郑艳杰,等:红花黄色素对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠学习记忆能力的影响499 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The protein expression of TLR4,p-NF-B p65/NF-B p65 in cortical tissue was detected by Western blot.Results Compared with Tg group,the learning and memory ability of mice in TREM2 si-lence group was decreased,the positive expressions of 6E10 and Iba-1 were significantly increased(P0.01),and the expression levels of IL-6 and INF-in the cortex were significantly increased(P0.05 or P0.01).Up-regulated expression of TLR4 and p-NF-B p65/NF-B p65 protein;SY 30 mg kg-1 could improve the learning and memory ability of mice,the positive expressions of 6E10 and Iba-1 were decreased significantly(P0.01),and the expression levels of IL-6 and INF-in the cortex of mice were decreased significantly(P0.05 or P0.01).The expression level of IL-4 was significantly increased(P0.01),and the expression of TLR4 and P-NF-B p65/NF-B p65 protein was down-regulated.Conclusion TREM2 silencing increases the pathological accumulation of A in the brain and reduces the release of inflammatory cytokines.SY can reduce the deposition of A and the activation of microglia cells in the brain tissue of APP/PS1 mice with TREM2 silencing,and reduce the release of inflammatory mediators by inhibiting TLR4-mediated NF-B signaling pathway.Ultimately improved learning and memory in APP/PS1 mice with TREM2 silence.Key words:safflower yellow pigment;Alzheimers disease;TREM2;Neuroinflammation;microglia阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)是一种进行性神经退行性疾病,主要的病理特征为细胞外由-淀粉样蛋白(-amyloid peptide,A)沉积所形成的老年斑(Semile plaque,SP)和细胞内由微管相关蛋白 Tau(Microtubule-associated protein,Tau)过度磷 酸 化 所 形 成 的 神 经 纤 维 缠 结(Neurofibrillary tangles,NFTs)1。近年来研究发现,小胶质细胞活化诱导的慢性神经炎症反应是 AD 的主要病因之一2。髓样细胞 2 触发受体(Triggering receptor ex-pressed on myeloid cells 2,TREM2)是小胶质细胞活化过程中的关键蛋白之一,其可抑制小胶质细胞释放促炎因子如白介素-1(IL-1)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等,并且上调白介素-10(IL-10)、白介素-4(IL-4)等抑炎因子的表达,从而减轻神经炎症对脑细胞的损伤作用3。红花黄色素为红花主要活性成分,课题组前期研究显示,在多种 AD 动物模型中,红花黄色素具有较好改善痴呆动物学习、记忆的作用4-5。本研究通过建立 TREM2 基因沉默的 APP/PS1 小鼠模型,深入研究 TREM2 对小胶质细胞活化和炎症因子释放的调控机制,进一步阐明 TREM2 在 SY 改善 APP/PS1小鼠脑组织病理进程中的作用及相关机制。1 材料与方法1.1实验动物及材料1.1.1实验动物选用 6 月龄 WT 小鼠 10 只;同月龄 APP/PS1小鼠(Tg)70 只。所用小鼠购买于南京君科生物科技 有 限 公 司。实 验 动 物 使 用 许 可 证 号:20180006018886。所有动物操作均严格遵守实验动物的人道关怀和使用的指导方针。1.1.2实验药物LV-TREM2-RNAi、LVCON313(上海吉凯基因化学技术有限公司,批号:0019856);红花黄色素(云 南 通 海 杨 氏 天 然 产 物 公 司,批 号:YSCMY20200710);盐酸多奈哌齐片(Donepezil,DP卫材中国药业有限公司,批号:1601044)。1.1.3实验主要试剂白介素 6(IL-6)、干扰素(IFN-)、白介素 10(IL-10)ELISA 试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,批号:m1002293V、m1002277V、m1037873V);白介素 4(IL-4)ELISA 试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司,批号:12717122411);6E10(Biolegend,批号:803004);Iba-1 抗体(Affinity,批号:DF6442);TLR4 抗体(Santa Cruz Biotechnology,批号:J3119);NF-B p65 抗体、p-NF-B p65 抗体(Affinity,批号:AF5006、AF2006)。1.1.4仪器DMS-2 型 Morris 水迷宫、DTT-2 型小鼠跳台仪、SBA-2 型小鼠避暗仪(中国医学院科学院药物研究所);Thermo 3001 酶标仪(德国 ZEISS 公司);电泳仪,电转仪(美国 BIO-RAD 公司);LSM510 正置显微镜(Zeiss 公司);EC3510 型 UVP 化学发光成像系统(美国 UVP 公司)。1.2方法1.2.1动物分组、造模及给药6 月龄 Wide Type 小鼠 10 只,即 WT 组;同月龄Tg 小鼠 70 只随机分为 7 组,即 Tg 组、TREM2 基因沉默即转染沉默 TREM2 基因的慢病毒(Tg+LV)组、阴性对照即未转染沉默 TREM2 基因的空白载体病毒(Tg+LV-C)组、Tg+LV+SY 30 mgkg-1组、Tg+LV-C+SY 30 mg kg-1组、Tg+LV+DP 0.75 mgkg-1组、Tg+LV-C+DP 0.75 mg kg-1组。建立慢病毒介导的 TREM2 基因沉默的 APP/500 石河子大学学报(自然科学版)第 41 卷PS1 小鼠模型:小鼠术前 12 h 禁食。用 1%水合氯醛(3.5 mL kg-1)将小鼠麻醉,将其固定在脑立体定位仪上,根据小鼠脑立体定位图谱,坐标为:前囟后0.5 mm,中线旁 1 mm,膜下 2.5 mm,其中 WT 组和Tg 组 注 射 生 理 盐 水,Tg+LV 组、Tg+LV+SY 30 mg kg-1组及 Tg+LV+DP 0.75 mgkg-1组用微量注射器吸取 2.5 L 转染沉默 TREM2 基因的慢病毒,Tg+LV-C 组、Tg+LV-C+SY 30 mg kg-1组及 Tg+LV-C+DP 0.75 mg kg-1组用微量注射器吸取 2.5 L 未转染沉默 TREM2 基因的空白载体病毒缓慢注入小鼠右侧侧脑室,注射时间 5 min,留针 5 min,缝合切口。术后给予青霉素钠腹腔注射,并观察小鼠的生命体征。造模 7 d 后,WT 组、Tg 组、Tg+LV 组及 Tg+LV-C 组 灌 胃 生 理 盐 水,治 疗 组 分 别 灌 胃 SY 30 mg kg-1,DP 0.75 mg kg-1,每日一次,连续给药 3 个月。1.2.2水迷宫实验进行实验前往水中加入奶粉,使其呈乳白色不透明状,水温保持(202)。Morris 水迷宫实验共 6 d。前五天为定位航行实验,水池分为 4 个象限区,平台设于固定象限中心,小鼠每天从相对和相邻象限入水,记录小鼠找到平台的时间。第六天进行空间探索实验,移去平台,小鼠从选定象限入水,记录小鼠在 120 s 内穿越平台的次数。1.2.3避暗实验实验进行 2 d。第一天学习训练阶段,将小鼠背对洞口放入明室内适应 3 min 后取出,通电后,将小鼠背对着洞放入明室,小鼠多有趋暗避明的习性,会主动由明室通往暗室,进入暗室受到电击后会迅速逃回明室,从而产生记忆。第二天测试阶段,将小鼠背对洞口放入明室,记录 5 min 内小鼠从明室进入暗室的潜伏期以及进入暗室的次数。1.2.4跳台实验实验连续进行 2 d。第一天学习训练阶段,将小鼠放入实验箱适应环境 3 min 之后进行通电,小鼠受到电击后,其正常逃避反应是跳上橡皮台避免电击。第二天测试阶段,通电后,按照前一天操作将小鼠放于绝缘台上,记录 3 min 内小鼠第一次跳下平台的时间及跳下平台次数即错误次数。1.2.5免疫组化脑组织石蜡切片进行脱蜡、水化、抗原修复、用3%的 H2O2孵育,分别滴加一抗 6E10(1 500),Iba-1(1 100),4 孵育过夜,二抗孵育 30 min、DAB 显色、返蓝、酒精梯度脱水、中性树脂封片,显微镜下拍摄脑组织的皮层区及海马区,使用 Image J 软件分析统计各显微照片阳性区域。1.2.6ELISA 试剂盒检测炎症因子含量行为学实验结束后,快速断头取脑,取小鼠皮层组织,按组织(mg):PBS(L)比例为 1 9加入 PBS制成匀浆,4 ,5000g 离心 10 min,取匀浆上清冻存待测。依据 IL-6、INF-、IL-4、IL-10 ELISA 试剂盒说明书方法检测炎症因子含量。1.2.7Western Blot 检 测 皮 层 组 织 TREM2、TLR4、p-NF-B p65、NF-B p65 蛋白表达行为学实验结束后,冰上分离皮层,冻存于-80 备用,精确称取相对质量的皮层组织,按照 RIPA裂解液(L):组织(mg):PMSF 蛋白酶抑制剂(L)比例为 100 10 1,匀浆提取总蛋白,蛋白测定仪Q5000 测定蛋白浓度,加入电泳液和 4上样缓冲液,配制成 5 gL-1的蛋白样品。混匀后煮沸 5 min,冷却后分装于-20 备用。根据目的蛋白分子量大小,蛋白变性后进行电泳分离蛋白,转膜,室温封闭,孵育对应一抗(TREM2、TLR4、p-NF-B p65、NF-B p65),抗体稀释浓度均为 1 1 000,4 过夜,第二天,TBST 洗涤后,小鼠/兔二抗(1 10 000)室温孵育 1 h,显影拍照,UVP 对条带进行信号收集。1.2.8统计学方法用 SPSS 26.0 统计软件分析数据。各组间比较用单因素方差分析(Oneway ANOVA),结果表示为均值标准差(XS),P0.05 认为有统计学意义。2 结果2.1Morris 水迷宫 定位航行实验结果表明,与 WT 组小鼠相比,Tg组小鼠从训练第二天起潜伏期明显延长(P0.05或 P0.01),提示 Tg 组小鼠出现空间学习障碍;与Tg 组小鼠相比,Tg+LV 组小鼠潜伏期有延长的趋势;与 Tg+LV 组小鼠相比,SY 及 DP 组小鼠潜伏期有缩短的趋势;与 Tg+LV-C 组小鼠相比,SY 组小鼠潜伏期明显缩短(P0.05 或 P0.01),DP 组小鼠潜伏期显著缩短(P0.01)。空间探索实验结果显示,Tg 组小鼠穿越平台次数及目标象限停留时间显著少于 WT 组(P0.01);与 Tg 组小鼠相比,Tg+LV组小鼠穿越平台次数有减少的趋势,目标象限停留时间有减少的趋势;与 Tg+LV 组小鼠相比,SY 及DP 组小鼠穿越平台次数及目标象限停留时间明显增加(P0.05 或 P0.01);与 Tg+LV-C 组小鼠相比,SY 及 DP 组小鼠穿越平台次数及目标象限停留时间显著增加(P0.01)(表 1,表 2)。第 4 期郑艳杰,等:红花黄色素对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠学习记忆能力的影响501 表 1红花黄色素对 TREM2 基因沉默的 APP/PS1 小鼠逃避潜伏期的影响(xs,n=710)组别第一天/s第二天/s第三天/s第四天/s第五天/sWT118.703.9492.1133.8372.6948.3748.7842.8334.0020.92Tg118.314.77115.9411.49114.8915.33 114.8310.25 105.8321.13 Tg+LV120.000.00119.142.27119.332.00118.893.33116.009.63Tg+LV+SY120.000.00112.8120.13108.8118.55101.8634.0691.5048.81Tg+LV+DP120.000.00113.0613.21115.258.83111.7914.42100.2932.23Tg+LV-C120.000.00111.1916.90111.9422.80111.7517.80105.5732.99Tg+LV-C+SY120.000.00110.9417.8398.7127.3989.8636.4768.1747.51Tg+LV-C+DP120.000.0091.1923.9486.7939.3464.6434.4250.0734.41注:与 WT 组相比,P0.05,P0.01;与 Tg 组相比,aP0.05,aaP0.01;与 Tg+LV 组相比,#P0.05,#P0.01;与 Tg+LV-C 组相比,P0.05,P0.01。表 2SY 对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠空间探索能力的影响(xs,n=710)组别穿越平台次数/次目标象限停留时间/sWT4.000.5444.702.99Tg0.330.24 14.553.18 Tg+LV0.220.1512.882.96Tg+LV+SY1.130.4829.392.33#Tg+LV+DP1.500.43#32.153.22#Tg+LV-C0.500.2718.903.53Tg+LV-C+SY3.170.3133.622.83Tg+LV-C+DP3.630.6032.932.05注:与 WT 组 相比,P 0.05,P 0.01;与 Tg 组 相比,aP 0.05,aaP 0.01;与 Tg+LV 组相比,#P 0.05,#P 0.01;与 Tg+LV-C 组相比,P0.05,P0.01。2.2避暗实验 与 WT 组小鼠比较,Tg 组小鼠的潜伏期显著缩短(P0.01),错误次数显著增加(P0.01);与 Tg组小鼠相比,Tg+LV 组小鼠潜伏期显著缩短(P 0.01),错误次数显著增加(P0.01);与 Tg+LV 组小鼠相比,SY 及 DP 组小鼠潜伏期显著延长及错误次数减少(P0.01);与 Tg+LV-C 组小鼠相比,SY及 DP 组小鼠潜伏期显著延长及错误次数减少(P0.01)(图 1)。2.3跳台实验与 WT 组小鼠比较,Tg 组小鼠潜伏期显著缩短(P0.01),错误次数显著增加(P0.01);与 Tg 组与 WT 组相比,P0.05,P0.01;与 Tg 组相比,aP0.05,aaP0.01;与 Tg+LV 组相比,#P0.05,#P0.01;与 Tg+LV-C 组相比,P0.05,P0.01。图 1SY 对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠避暗实验逃避潜伏期(A)和错误次数(B)的影响(xs,n=710)小鼠相比,Tg+LV 组小鼠的潜伏期明显缩短(P 0.05),错误次数显著增加(P0.01);与 Tg+LV 组小鼠相比,SY 及 DP 组小鼠潜伏期显著延长及错误次数显著减少(P0.01);与 Tg+LV-C 组小鼠相比,SY 及 DP 组小鼠潜伏期显著延长及错误次数显著减少(P0.01)(图 2)。2.4SY 对 TREM2 基因沉默的 APP/PS1小鼠皮层和海马组织病理学的影响 通过免疫组织化学染色,A 被标记为棕褐色。与 WT 组小鼠比较,Tg 组小鼠皮层及海马组织区中A 斑块水平显著升高(P0.01);与 Tg 组小鼠比较,Tg+LV 组小鼠皮层及海马组织中 A 斑块水平显著升高(P0.01),Tg+LV-C 组小鼠皮层及海马组织中A 斑块水平无统计学差异;与 Tg+LV 组相比,给药组小鼠皮层及海马组织中 A 斑块水平显著降低(P0.01);与 Tg+LV-C 组相比,SY 组小鼠皮层及海马中A 斑块水平明显降低,DP 组小鼠皮层及海马中 A 斑块水平明显降低(P0.05 或 P0.01);Tg+LV-C+SY 组A 阳性表达水平低于 Tg+LV+SY 组,表明 SY 可能是通过调节 TREM2 表达起到一定的改善效果(图 3)。502 石河子大学学报(自然科学版)第 41 卷与 WT 组相比,P0.05,P0.01;与 Tg 组相比,aP0.05,aaP0.01;与 Tg+LV 组相比,#P0.05,#P0.01;与 Tg+LV-C 组相比,P0.05,P0.01。图 2SY 对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠跳台实验潜伏期(A)和错误次数(B)的影响(xs,n=710)与 WT 组相比,P0.05,P0.01;与 Tg 组相比,aP0.05,aaP0.01;与 Tg+LV 组相比,#P0.05,#P0.01;与 Tg+LV-C 组相比,P0.05,P0.01。图 3SY 对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠皮层和海马组织 A 斑块的影响(xs,n=34)第 4 期郑艳杰,等:红花黄色素对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠学习记忆能力的影响503 2.5SY 对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠皮层和海马组织中 Iba-1 表达的影响通过免疫组织化学染色,活化的小胶质细胞(Microglia,MG)被标记为胞体变大并带有突起的棕色阳性细胞。与 WT 组小鼠相比,Tg 组小鼠脑组织中 Iba-1 表达显著增加(P0.01),提示有大量活化的 MG;与 Tg 组小鼠相比,Tg+LV 组小鼠脑中 Iba-1表达显著增加(P0.01),说明 MG 活化程度增加,Tg+LV-C 组小鼠脑中 Iba-1 表达无统计学差异;SY及 DP 给药后显著降低了 Tg+LV 组小鼠皮层和海马各区 Iba-1 表达(P0.01);与 Tg+LV-C 组相比,SY组小鼠皮层和海马各区中 Iba-1 表达有下降的趋势,DP 组小鼠皮层和海马各区的 Iba-1 表达显著下降(P0.01);治疗组中 Tg+LV-C+SY 组 Iba-1 表达低于 Tg+LV+SY 组,表 明 SY 可 能 是 通 过 调 节TREM2 表达起到改善作用(图 4)。A:小鼠皮层及海马 DG、CA3、CA1 区 Iba-1 的代表性图像(比例尺代表 100 m);B:小鼠皮层及海马 DG、CA3、CA1 区 Iba-1 的表达与 WT 组相比,P0.05,P0.01;与 Tg 组相比,aP0.05,aaP0.01;与 Tg+LV 组相比,#P0.05,#P0.01;与 Tg+LV-C 组相比,P0.05,P0.01。图 4SY 对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠脑组织中 Iba-1 表达的影响(xs,n=34)2.6SY 对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠脑内炎症因子含量的影响与 WT 组小鼠相比,Tg 组小鼠皮层中 IL-6、IFN-的含量明显升高(P0.05 或 P0.01),IL-4、IL-10 的含量明显减少(P0.05 或 P0.01);与Tg 组小鼠相比,Tg+LV 组小鼠皮层中 IL-6、IFN-含量明显升高(P0.05 或 P0.01),IL-4、IL-10 含量有下降的趋势;与 Tg+LV 组小鼠相比,SY 和 DP组小鼠皮层中 IL-6、IFN-含量明显降低(P0.05或P0.01),IL-4 含量显著升高(P0.01),IL-10含量有升高的趋势;与 Tg+LV-C 组小鼠相比,SY 和DP 组小鼠皮层中 IL-6 含量显著下降(P0.01),IFN-含量有下降的趋势,IL-10 含量有升高的趋势,SY 组小鼠皮层中 IL-4 含量有升高的趋势,DP组小鼠皮层中 IL-4 含量显著升高(P0.01)结果见表 3。504 石河子大学学报(自然科学版)第 41 卷表 3SY 对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠皮层 IL-6、IFN-、IL-4 和 IL-10 水平的影响(xs,n=34)组别IL-6/ng L-1IFN-/ng L-1IL-4/ng L-1IL-10/ng L-1WT11.232.53101.3921.4338.961.8694.287.72 Tg29.654.50 159.1622.8816.271.69 70.2612.49 Tg+LV36.815.83aa209.4636.01a8.671.6866.8213.95 Tg+LV+SY22.533.53#172.0237.64#25.400.99#86.3910.30 Tg+LV+DP13.993.72#156.3438.07#24.295.06#86.4312.37 Tg+LV-C23.486.31159.3635.0713.831.0773.7315.89 Tg+LV-C+SY14.063.55155.3328.8020.732.4480.259.24 Tg+LV-C+DP13.764.00131.8312.88 26.903.5586.419.07注:与 WT 组相比,P0.05,P0.01;与 Tg 组相比,aP0.05,aaP0.01;与 Tg+LV 组相比,#P0.05,#P0.01;与 Tg+LV-C 组相比,P0.05,P0.01。2.7SY 对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠皮层中 TREM2、TLR4、p-NF-B、NF-B 蛋白表达的影响与 WT 组小鼠相比,Tg 组小鼠 TREM2 蛋白表达降低,TLR4 表达有升高趋势;与 Tg 组小鼠相比,Tg+LV组小鼠皮层中 TREM2 蛋白表达明显下降(P0.05),TLR4 表达有升高趋势;与 Tg+LV 组小鼠相比,SY 组及DP 组小鼠皮层中 TREM2 蛋白表达显著升高(P 0.01),TLR4 蛋白表达显著下降(P0.01);与 Tg+LV-C组相比,SY 及 DP 组小鼠 TREM2 蛋白表达显著升高(P0.01),TLR4 表达显著下降(P0.01)(图 5)。与 WT 组小鼠相比,Tg 组小鼠组 p-NF-B p65/NF-B p65 蛋白表达有升高趋势;与 Tg 组小鼠相比,Tg+LV 组小鼠皮层中 p-NF-B p65/NF-B p65蛋白表达明显升高的趋势;与 Tg+LV 组小鼠相比,SY 组小鼠皮层中 p-NF-B p65/NF-B p65 蛋白表达明显下降(P0.05),DP 组小鼠皮层中 p-NF-B p65/NF-B p65 蛋白表达水平显著下降(P0.01);与 Tg+LV-C 组相比,SY 及 DP 组小鼠 p-NF-B p65/NF-B p65 蛋白表达有下降的趋势(图 6)。与 WT 组相比,P0.05,P0.01;与 Tg 组相比,aP0.05,aaP0.01;与 Tg+LV 组相比,#P0.05,#P0.01;与 Tg+LV-C 组相比,P0.05,P0.01。图 5SY 对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠皮层 TREM2、TLR4 蛋白表达的影响 (xs,n=5)与 WT 组相比,P0.05,P0.01;与 Tg 组相比,aP0.05,aaP0.01;与 Tg+LV 组相比,#P0.05,#P0.01;与 Tg+LV-C 组相比,P0.05,P0.01。图 6SY 对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠皮层 p-NF-B p65/NF-B p65 蛋白表达的影响 (xs,n=5)第 4 期郑艳杰,等:红花黄色素对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠学习记忆能力的影响505 3 讨论AD 是痴呆的主要类型之一,主要表现为进行性记忆和认知功能障碍6。AD 的发病机制学说包括淀粉样蛋白沉积假说、Tau 蛋白异常磷酸化假说、神经炎症假说、胆碱能损伤假说等2。研究认为,A 大量沉积引起的小胶质细胞过度活化,诱发神经炎症反应是 AD 发病的关键病理机制之一,因此抑制小胶质细胞过度激活可减轻炎症反应的发生,从而降低神经元损伤7。TREM2 在中枢神经系统中主要表达于小胶质细胞,促进小胶质细胞吞噬A,减轻炎症反应、清除凋亡细胞等生物学活性8。SY 是中药红花水溶性提取物的有效成分,具有抗炎、抗氧化和神经保护作用9。SY 对 APP/PS1 小鼠具有改善认知功能的作用,但其如何调控 TREM2 表达的相关机制还尚未明确,因此我们通过建立TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠模型,探究 TREM2 在SY 调节小胶质细胞活化程度,改善痴呆小鼠学习记忆功能中的作用。AD 模型小鼠外在表现形式为学习记忆能力的改变。实验结果显示,与 Tg 组小鼠相比,Tg+LV 组小鼠空间学习记忆能力明显下降,经 SY 治疗后小鼠空间学习记忆能力明显提高。跳台与避暗实验则侧重于被动回避条件反射,Tg+LV 组小鼠的潜伏期较 Tg 组小鼠明显缩短而且错误次数明显增多,SY给药后小鼠的潜伏期明显延长,错误次数显著减少,表明 TREM2 沉默后可以使小鼠的非空间记忆能力下降,SY 则可以升高小鼠的非空间记忆能力。结果表明,TREM2 沉默后小鼠学习记忆能力下降,SY 可以改 善 TREM2 沉 默 的 APP/PS1 小 鼠 学 习 记 忆能力。AD 发病机制复杂,涉及多个病理环节。A 的异常沉积被认为是 AD 重要发病机制之一10。当脑内的 A 生成过多,不能及时被清除,就会在神经细胞外大量聚集形成淀粉样斑块,引起神经元病变、神经元丢失等一系列病理变化11。结果显示,与Tg 组小鼠相比,Tg+LV 组小鼠脑组织中 A 阳性表达显著增多,SY 给药后可使 TREM2 沉默组小鼠脑组织中 A 沉积减少。结果表明,TREM2 的缺乏能够加剧 A 沉积,SY 对 TREM2 沉默的 APP/PS1 小鼠皮层和海马中 A 沉积具有缓解改善作用。A 是 AD 神经炎症反应的重要触发因素。当 A 大量沉积时可诱导胶质细胞过度激活,促进炎症因子大量释放,进一步诱发神经炎症的发生,对神经元产生毒性作用,继而加重 AD12。Iba-1 是小胶质细胞激活的标志物,可反映小胶质细胞的活化程度13。结果显示,与 Tg 组小鼠相比,Tg+LV 组小鼠脑组织中 Iba-1 表达显著增多,皮层组织中 IL-6、IFN-的含量显著升高,IL-4、IL-10 的含量降低。SY 给药后可使 TREM2 沉默组小鼠脑组织中Iba-1 表达显著降低,明显降低皮层组织中 IL-6、IFN-的含量,升高 IL-4、IL-10 的含量。结果表明,TREM2 缺乏时小胶质细胞会过度活化,增加了炎症因子的释放,SY 能缓解小胶质细胞的过度激活,减轻 AD 的病理损伤程度,同时也能降低神经炎症因子表达水平。AD 动物模型中发现,A 可以通过与小胶质细胞上的 TLR4 相结合从而激活 NF-B 等相关的炎症信号通路14。TLR4 是在小胶质细胞中表达的 I 型跨膜受体,可以诱导小胶质细胞激活,在介导神经炎症的信号通路中起重要作用。NF-B 作为关键的转录因子,处于 TLRs 下游信号通路的连接处,是引起促炎介质表达的关键因素15-16。TREM2 是一种主要由中枢神经系统的小胶质细胞表达的先天性免疫膜受体,TREM2 在小胶质细胞介导的吞噬功能、中枢神经炎症反应中发挥重要作用,能够提高小胶质细胞的吞噬能力,显著降低脑内促炎介质的表达,抑制神经炎症反应17。TREM2 是 TLR4 信号通路的一种负性调节因子18,可以调节 TLR4 及下游信号通路,减轻神经损伤,从而改善小鼠的认知功能。为验证 SY 是否通过调控 TLR4/NF-B 通路抑制 A 沉积、小胶质细胞活化和炎症反应。本实验测定了 TLR4、p-NF-B/NF-B 的蛋白表达,发现Tg+LV 组 TLR4、p-NF-B/NF-B 蛋白表达水平升高;经 SY 治疗后 TLR4、p-NF-B/NF-B 表达水平降低。结果表明,TREM2 缺乏时 TLR4、p-NF-B/NF-B 蛋 白 表 达 水 平 升 高,SY 可 以 通 过 调 控T