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67 食用菌学报 2023.30（4）：2023.04.收稿日期：2023-02-27原稿；2023-03-22修改稿基金项目：广东省农业厅种业振兴项目（2022-WPY-00-004）；广东省科技特派员扶贫专项（20210722）作者简介：王振娟（1995），女，在读硕士，研究方向为食用菌生物活性物质研究与利用。*本文通信作者 E-mail:6777008黑牛肝菌黑色素抗氧化活性和稳定性及染发效果王振娟，刘思婕，王 杰*（华南农业大学食品学院，广东 广州 510640）摘 要：采用碱溶酸沉法提取黑牛肝菌（Phlebopus portentosus）发酵液得粗提物，经有机溶剂（氯仿、异戊醇、无水乙醇）反萃取及超纯水洗涤，采用高效液相色谱、紫外全波长扫描及傅里叶红外光谱法对纯化物进行鉴定，并对其抗氧化活性及对金属离子、氧化剂、还原剂和温度的稳定性进行分析，最后探究其染发效果。结果表明：纯化物提取率为0.44 gL-1，高效液相色谱测定该纯化物纯度较高，经紫外全波长扫描其最大吸收波长为209 nm，傅里叶红外光谱解析显示该纯化物为黑色素。在实验范围内，1 mgmL-1黑牛肝菌黑色素对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除率分别为（75.902.85）%、（72.341.33）%和（85.451.22）%，其总还原力为1.04。FeCl2、KCl、CaCl2溶液可显著影响黑牛肝菌黑色素的稳定性（P0.05）；在 H2O2和 Na2SO3存在时该黑色素稳定性降低；在实验设定温度范围内，该黑色素在60 时热稳定性较好。该黑色素可将白发染成棕红色，且染色稳定性良好。研究结果为黑牛肝菌黑色素进一步开发利用提供参考。关键词：高效液相色谱；紫外全波长扫描；傅里叶红外光谱；抗氧化；稳定性；染发Antioxidant Activity,Stability and Application of Melanin Obtained from Phlebopus portentosusWANG Zhenjuan,LIU Sijie,WANG Jie*(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510640,Guangdong,China)Abstract:Fermentation broth of Phlebopus portentosus was initially extracted by the alkaline dissolution and acid precipitation method to yield a crude extract.Then the crude extract was further purified by stripping with organic solvents(chloroform,isoamyl alcohol,anhydrous ethanol)and washing with ultrapure water.The purified product was characterized by high-performance liquid chromatography,UV full wavelength scanning,and Fourier transform infrared spectroscopy.The antioxidant activity and stability against metal ions,oxidants,reducers,and temperature of the purified product were analyzed,and its hair dyeing effect was explored.The results showed that the extraction rate of the purified product was 0.44 gL-1.Its purity was high as determined by HPLC,and the maximum absorption wavelength was 209 nm by UV full wavelength scanning.Fourier transform infrared spectroscopy analysis showed that the purified product was melanin.Within the experimental ragne,the scavenging rates of 1 mgmL-1 P.portentosus melanin on DPPH,hydroxyl radical,and superoxide anion radical were(75.902.85)%,(72.341.33)%,and(85.451.22)%,respectively,and its total reducing power was 1.04.FeCl2,KCl,and CaCl2 solutions significantly affected the stability of the P.portentosus melanin(P0.05).The stability of the P.portentosus melanin decreased in the presence of H2O2 and Na2SO3.Within the experimental temperature range,the P.portentosus melanin showed good thermal stability at 60.The P.portentosus melanin dyed white hair into a brownish red color with 68 第 30 卷食 用 菌 学 报good dyeing stability.These results provided a reference for further development and utilization of melanin from P.portentosus.Key words:High performance liquid chromatography;UV full wavelength scanning;Fourier transform infrared spectroscopy;antioxidant;stability;hair dyeing黑牛肝菌（Phlebopus portentosus）又名铜色牛肝菌，含多种活性成分，如色素、多糖、多肽等，具有清除自由基、提高机体免疫力、降血脂等功效1。黑色素是由多羟基酚或吲哚类物质氧化聚合形成的复杂非均质高分子化合物，通常情况下呈黑色、褐色、棕色，难溶于酸和有机溶剂且不易被消化2。近年来，真菌黑色素作为重要的天然活性物质广受关注。据报道，真菌黑色素具有抗氧化3、抗辐射4、调节免疫力5等多种生物活性，可广泛应用于食品、染料、日用品等领域。随着人们对染发需求的提高，天然来源的黑色素在染发中的应用备受消费者青睐。黑牛肝菌液体发酵生产黑色素具有生产周期短、产量高、成本低等优点，其黑色素应用前景广阔。鲜见黑牛肝菌菌丝发酵制备黑色素及其理化特征与应用的相关报道，笔者拟以前期筛选的黑牛肝菌菌株为材料，提取纯化该菌株液体发酵所产胞内外黑色素，研究其抗氧化活性，考察金属离子、氧化剂、还原剂、温度对其稳定性的影响，并初步探究其染发效果，以期为黑牛肝菌黑色素的开发利用提供参考。1 材料与方法 1.1 供试材料黑牛肝菌（P.portentosus）菌株由华南农业大学食品学院食药用真菌生物工程实验室分离并保存。1.2 主要试剂和仪器1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海源叶生物科技有限公司）；铁氰化钾、硫酸亚铁、过氧化氢（分析纯，上海麦克林生物科技有限公司）；维生素C（分析纯，上海罗恩试剂公司）；乙腈（色谱级，天津北辰方正试剂厂）；其他试剂均为分析纯。R-1001VN真空旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；FD-450101真空冷冻干燥机（杭州富睿捷科技有限公司）；420S高速冷冻离心机（美国赛默飞仪器有限公司）；T6紫外可见分光光度计（让奇上海仪器科技有限公司）；PHS-3CPH手持pH计（邢台润联科技开发有限公司）；THZ-300恒温培养摇床（上海一恒科学仪器有限公司）；2998高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Vertex 70傅里叶变换红外光谱仪（德国布鲁克有限公司）。1.3 黑牛肝菌黑色素制备、鉴定及色价检测1.3.1 黑色素制备及提取率计算将5个黑牛肝菌丝块（直径5.5 mm）接入PDB培养基中，在27、210 rmin-1条件下培养21 d。参考文献6的方法，将1 L含有菌丝的黑牛肝菌发酵液进行冷冻干燥，研磨成粉末，加入30 mL 1 molL-1 NaOH溶液，常温超声（200 W）处理20 min，60 水浴40 min，10 000 g离心10 min，收集上清液，用6 molL-1 HCl调pH至2.0，80 水浴12 h，待自然冷却，10 000 g离心10 min，用去离子水洗涤沉淀至无色，真空冷冻干燥获得1.96 g黑牛肝菌粗提物，计算粗提物提取率2。参考文献7的方法对黑牛肝菌粗提物进行纯化。将1.96 g黑牛肝菌粗提物粉末溶于10 mL 7 molL-1 HCl 溶液中，沸水浴4 h，过滤收集沉淀，用超纯水洗涤3次，用10 mL KOH（1 mmolL1）溶解沉淀，加入10 mL氯仿:异戊醇（15）混匀，10 000 g离心10 min，重复3次。用1 molL-1 HCl调沉淀pH至2.0，10 000 g离心10 min，用无水乙醇洗涤沉淀，10 000 g离心10 min，用超纯水洗涤沉淀4次，收集沉淀，冷冻干燥得0.44 g黑色素纯化物，计算纯化物提取率2。69 王振娟，等：黑牛肝菌黑色素抗氧化活性和稳定性及染发效果第 4 期1.3.2 黑色素高效液相色谱检测、紫外可见光谱扫描、傅里叶红外光谱分析参考文献 8 的方法，经预实验得到黑牛肝菌黑色素高效液相色谱检测条件：色谱柱为Shimadzu AQ-C18（250 mm4.6 mm5 m），检测波长209 nm，进样量20 L；流动相A为0.2%（体积分数）甲酸，流动相B为乙腈。梯度洗脱流速1 mLmin-1；柱温25。010 min，AB=9010；1020 min，AB=7030；2030 min，AB=5050。用1 molL-1 NaOH溶液将黑色素粉末配制成质量浓度为0.1 mgmL-1溶液，以1 molL-1 NaOH溶液为背景基线，在波长200600 nm进行紫外可见光光谱扫描。参考文献9的方法，采用溴化钾压片法扫描黑牛肝菌黑色素，按照1200分别将黑牛肝菌黑色素样品和溴化钾，研磨均匀后压片，进行傅里叶红外光谱扫描，扫描范围为4004 000 cm-1。1.3.3 黑色素色价测定准确称取0.10 g黑色素，用1 molL-1 NaOH溶液定容至100 mL，测定波长209 nm处吸光度值，计算色价。E1%1cm（max）=Af/W公式中A表示吸光度值；f表示体积倍数；W表示黑牛肝菌黑色素样品质量，单位为mg1.4 黑牛肝菌黑色素抗氧化活性测定将黑色素用1 molL-1 NaOH配制成0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mgmL-1溶液，以相同质量浓度维生素C为对照，按照文献10的方法测定黑色素对DPPH、羟自由基的清除率；按照文献11的方法测定黑色素对超氧阴离子自由基的清除率及总还原力。1.5 黑牛肝菌黑色素稳定性测定1.5.1 对金属离子的稳定性分别将质量浓度为1 gmL-1的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、FeCl2溶液及蒸馏水加入1 gmL-1黑色素溶液至其质量浓度为0.02 gmL-1，将溶液在室温条件下静置1、2、3、4 h，分别检测溶液在209 nm 处吸光度值。1.5.2 对氧化剂H2O2的稳定性将不同体积分数（0.5%、1.0%、1.5%）H2O2溶液及蒸馏水加入到1 gmL-1黑色素溶液至其质量浓度为0.02 gmL-1，将溶液在室温条件下静置0.5、1.0、1.5、2.0 h，分别检测溶液在209 nm处吸光度值。1.5.3 对还原剂Na2SO3的稳定性将不同质量浓度（0.5、1.0、1.5 gL-1）还原剂Na2SO3溶液及蒸馏水加入1 gmL-1黑色素溶液至其质量浓度为0.02 gmL-1，将溶液在室温条件下静置0.5、1.0、1.5、2.0 h，分别检测溶液209 nm处吸光度值。1.5.4 热稳定性准确称取0.01 g黑色素粉末溶于10 mL 1 molL-1 NaOH溶液中，分别置于20、40、60、80、100 条件下，每隔2 h取样，连续测12 h，10 000 g离心3 min，检测上清液在209 nm处吸光度值。1.6 染发应用采用先染后媒法进行染发,以黑色素为活性染料的染发剂配方如表1所示。染发步骤：取 0.2 g 白发，用蒸馏水清洗表面污渍，晾干备用。将白发放入软化剂 A 中浸泡30 min，用清水洗涤并晾干。取洁净试管，加入A剂、B剂各5 mL，混合均匀后放入白发，于50 恒温水浴30 min，取出白发置于保鲜膜上，加入4 mL C剂，将头发完全浸泡5 min，用蒸馏水洗净并晾干，置于显微镜下（800）观察染色效果。染色后，将头发用洗发剂多次洗涤观察持色效果。70 第 30 卷食 用 菌 学 报表1 黑牛肝菌黑色素染发剂配方Table 1 Formula of P.portentosus melanin hair dye试剂 Reagent成分 Component用量 Consumption软化剂 A Softener A(pH10)3%过氧化氢 3%Hydrogen peroxide20.00 mL1 molL-1氢氧化钠 1 molL-1 Sodium hydroxide6.00 mL染色剂 B Dye B黑牛肝菌黑色素 P.portentosus melanin0.50 g蒸馏水 Distilled water5 mL甘油 Glycerol0.05 g羧甲基纤维素 Carboxymethyl cellulose0.05 g媒染剂 C Mordant CFeCl20.40 g蒸馏水 Distilled water20.00 mL1.7 数据分析数据用平均值 标准差表示，设3次重复；用 SPSS进行单因素方差分析，以P0.05判定为差异具有统计学意义；采用GraphPad Prism 8.0.1绘图。2 结果与分析2.1 黑牛肝菌黑色素提取结果与色价分析结果黑牛肝菌菌丝培养溶液呈黑色；黑色素粗提物提取率为1.96 gL-1，色价为573.8；黑色素纯化物提取率为0.44 gL-1，色价为988，色价增加且质地均匀细腻（图1）。注：A为黑牛肝菌菌丝发酵液；B为黑色素粗提物；C为黑色素纯化物。Notes:A.P.portentosus mycelium fermentation broth;B.crude melanin extract;C.purified melanin product.图1 黑牛肝菌菌丝发酵液及提取黑色素Fig.1 Fermentation broth of P.portentosus mycelia and melanin extraction 2.2 黑牛肝菌黑色素分析结果2.2.1 高效液相色谱分析结果在保留时间为16.51 min时，得到单一主峰，无明显杂峰（图2）。2.2.2 紫外可见光谱分析结果黑色素在紫外区域内，在波长209 nm处具有最大吸收峰，紫外区域吸收波动较大；在可见光区没有明显吸收峰（图3），是典型的黑色素的吸收图像。2.2.3 傅里叶红外光谱分析结果黑色素中含有酚羟基、羧基、氨基、羰基等黑色素典型官能团（图4）。黑色素在3 391.2 cm-1处具有宽而强的吸收峰，在3 3003 500 cm-1具有较宽的吸收峰，对应于O-H和N-H的伸缩振动12。在1 610.02 cm-1处有宽而强的吸收峰，对应于 C=O、C=C 和羧酸根阴离子的伸缩振动，这是黑色素典型的特征吸收峰之一。黑色素在 1 370.98 cm-1左右的吸收峰，对应酚羟基的伸缩振动，在 71 王振娟，等：黑牛肝菌黑色素抗氧化活性和稳定性及染发效果第 4 期1 040.7 cm-1处的吸收峰由芳香环骨架振动引起，而在600800 cm-1处出现吸收峰，表明苯环被取代形成共轭体系5。图2 黑牛肝菌黑色素高效液相色谱检测结果Fig.2 HPLC of P.portentosus melanin图3 黑牛肝菌黑色素紫外可见光谱图Fig.3 Ultraviolet-visible spectrum of P.portentosus melanin图4 黑牛肝菌黑色素红外光谱图Fig.4 Infrared spectrum of P.portentosus melanin 72 第 30 卷食 用 菌 学 报2.3 黑牛肝菌黑色素抗氧化活性 在实验质量浓度范围内，DPPH自由基的清除率随黑色素质量浓度增加呈上升趋势，黑色素清除DPPH的IC50为0.42 mgmL-1，1.0 mgmL-1黑色素溶液的DPPH自由基清除率达到75.90%（图5A）。在实验质量浓度范围内，随着质量浓度增加，黑色素对羟自由基的清除率呈上升趋势，当质量浓度为1.0 mgmL-1时清除率可达72.34%；但与相同质量浓度的维生素C相比，黑色素对羟自由基的清除率较低（图5B）。在实验质量浓度范围内，黑色素对超氧自由基清除率随着质量浓度增加呈上升趋势。当黑色素质量浓度从0增加到0.1 mgmL-1时，超氧自由基清除率从0迅速上升至65.3%；当质量浓度为1.0 mgmL-1时，黑色素对超氧自由基清除率达到85.45%，IC50为0.02 mgmL-1，黑色素具有较强的超氧自由基清除能力（图5C）。在实验质量浓度范围内，总还原力随黑色素质量浓度增加呈上升趋势。当质量浓度为1.0 mgmL-1时，黑色素的总还原力为1.04，但低于相同质量浓度维生素C的总还原力（图5D）。注：AD分别表示DPPH、羟基、超氧自由基清除能力及总还原力；数据为平均值标准差（n=3）；不同小写字母表示同一处理组不同质量浓度差异显著（P0.05）；*表示与维生素C相比差异显著（P0.05）。Notes:AD indicate DPPH,hydroxyl radical,superoxide radical scavenging capacity,and total reducing power,respectively;values are means SD(n=3);different lowercase letters indicate a significant difference between different mass concentrations of the same treatment group(P0.05);*indicates a significant difference compared with vitamin C(P0.05).图5 黑牛肝菌黑色素抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of P.portentosus melanin 2.4 黑牛肝菌黑色素稳定性2.4.1 不同金属离子对黑色素稳定性的影响与对照组相比，在相同时间点时，FeCl2、KCl、CaCl2和Nacl溶液处理组吸光度值显著增加（P 73 王振娟，等：黑牛肝菌黑色素抗氧化活性和稳定性及染发效果第 4 期0.05），且FeCl2与KCl溶液处理组对吸光度值的影响最显著；在1 h时，FeCl2与KCl溶液处理组吸光度值分别上升3.2倍与2.3倍（图6）。化合物的稳定性可以通过吸光度值的变化体现；黑色素吸光度值下降，其稳定性降低。注：数据为平均值标准差（n=3）；不同小写字母表示在同一时间不同处理差异显著（P0.05）。Notes:values are means SD(n=3);different lowercase letters indicate a significant difference between different treatments at the same time point(P0.05).图6 不同种类金属离子对黑牛肝菌黑色素稳定性的影响Fig.6 Effect of different kinds of metal ions on stability of P.portentosus melanin 2.4.2 不同质量浓度氧化剂H2O2对黑色素稳定性的影响与对照组相比，在相同时间点时，1.0%和1.5%H2O2处理组溶液吸光度值均显著降低（P0.05）；0.5%H2O2处理组在0.5、1.0、2.0 h时吸光度值显著降低（P 0.05），1.5 h时差异不显著（图7）。注：同图6。Note:footnotes as in Fig.6.图7 不同质量浓度氧化剂H2O2对黑牛肝菌黑色素稳定性的影响Fig.7 Effect of H2O2 concentration on stability of P.portentosus melanin 2.4.3 不同质量浓度还原剂Na2SO3对黑色素稳定性的影响与对照组相比，0.5 gL-1 Na2SO3处理组在0.5、1.0 h时的吸光度值显著降低（P0.05）；在1.5、2.0 h时吸光度值差异不显著；1.0、1.5 gL-1 Na2SO3处理组的黑色素溶液吸光度值均低于对照（P0.05），对黑色素稳定性影响较大（图8）。74 第 30 卷食 用 菌 学 报注：同图6。Note:footnotes as in Fig.6.图8 不同质量浓度还原剂Na2SO3对黑牛肝菌黑色素稳定性的影响Fig.8 Effect of Na2SO3 concentration on stability of P.portentosus melanin2.4.4 温度对黑色素稳定性的影响在实验温度范围内，20、40、60 处理组之间的吸光度值均无显著性变化。在前2 h，80、100 处理组的黑色素溶液吸光度值与其他温度处理组之间无显著性差异，但2 h之后显著下降（P0.05）（图9）。注：数据为平均值标准差（n=3）；不同小写字母表示在同一时间不同处理差异显著（P0.05）。Notes:values are means SD(n=3);different lowercase letters indicate a significant difference between different treatments at the same time point(P0.05).图9 不同温度对黑牛肝菌黑色素稳定性的影响Fig.9 Effect of temperature on stability of P.portentosus melanin2.5 黑牛肝菌黑色素的染发应用评价白发经黑牛肝菌黑色素处理后呈棕红色（图10）。在显微镜（800）下观察发现，染发后头发表面被黑色素覆盖，毛鳞片被黑色素填满（图10）。碱性环境将头发表层毛鳞片打开，黑牛肝菌黑色素进入头发毛皮质层，最终呈现染发后的颜色。头发染色后经12次洗涤，色泽依旧呈棕红色，持色效果稳定（图11）。75 王振娟，等：黑牛肝菌黑色素抗氧化活性和稳定性及染发效果第 4 期注：A为白发；B为染发；C为白发（800）；D为染发（800）。Notes:A.white hair;B.dyed hair;C.white hair under 800;D.dyed hair under 800.图10 黑牛肝菌黑色素染发效果图Fig.10 Hair dyeing effect of P.portentosus melanin 注：A为未洗涤；B为洗涤4次效果；C为洗涤8次效果；D为洗涤12次效果。Notes:A.without washing;B.washing for four times;C.washing for eight times;D.washing for twelve times.图11 黑牛肝菌黑色素染发后经多次洗涤效果Fig.11 Effect of multiple washing after P.portentosus melanin dyeing 3 讨论黑色素具有不易溶于水、酸及有机溶剂的性质，故常用碱溶酸沉法、有机相反萃取及超纯水洗涤法提取和纯化黑色素。笔者采用此方法提取纯化黑牛肝菌黑色素，经高效液相色谱检测显示单一主峰，表明该方法适合黑牛肝菌黑色素提取纯化。紫外全波长扫描确定黑色素最大特征吸收峰位置为209 nm，与毛木耳（Auricularia cornea）黑色素（210 nm）13及粗毛纤孔菌（Inonotus hispidus）黑色素（212 nm）14最大特征吸收峰相近，但与银耳（Tremella fuciformis）菌糠黑色素（318 nm）3和远东疣柄牛肝菌（Leccinum extremiorientale）黑色素（410 nm）15的最大特征吸收峰位置不同，这是因为黑牛肝菌黑色素结构中存在发色团（-C=O、-COOH等）及助色团（-OH、-NH2等），使得其吸收光的方向红移或蓝移，导致结构不同的黑色素其最大特征吸收峰位置不同。此外，色价是天然色素的主要质量指标之一，能从一定程度上反映色素含量的高低和产品着色能力的强弱，同时色价越高，色素颜色越深。笔者获得的黑牛肝菌黑色素的色价为988，显著高于梯棱羊肚菌（Morchella importuna）（480.24）16、灵芝（Ganoderma lucidum）（762.46）9等黑色素色价。傅里叶红外光谱分 76 第 30 卷食 用 菌 学 报析结果显示，黑牛肝菌黑色素在1 610.02 cm-1处有宽而强的吸收峰，表明有C=O、C=C和羧酸根阴离子存在，这是黑色素典型的特征吸收峰之一。此外，该黑色素结构中含有酚羟基、羧基、氨基、羰基等官能团，这与刘城移等17研究黑木耳（A.heimuer）黑色素结果相近，且与文献3,18中黑色素的红外光谱表征基本一致。清除率是评估自由基抗氧化能力的常用指标19。笔者发现当质量浓度为1 mgmL-1时，黑牛肝菌黑色素对DPPH自由基清除率达到75.90%，IC50为0.42 mgmL-1，高于同质量浓度的孢子黑色素（IC50为0.47 mgmL-1）9和毛木耳（A.cornea）黑色素（IC50为0.46 mgmL-1）20；质量浓度为1 mgmL-1黑牛肝菌黑色素对超氧阴离子自由基的清除为85.45%，IC50为0.02 mgmL-1，显著高于黑木耳（A.heimuer）黑色素（清除率50%）21及泰和乌骨鸡黑色素（IC50为1.88 mgmL-1）22（P0.05）；黑牛肝菌黑色素对羟自由基的清除率为72.34%；黑牛肝菌黑色素的总还原力也高于同等质量浓度的花椒籽黑色素的总还原力（P0.05）23。笔者获得的黑牛肝菌黑色素的结构中含有芳香环、二酮（C=O）及酚羟基。多聚物邻苯二酚和醌之间的电子离域会产生大量的半醌自由基，赋予物质显著的氧化还原性24，这可能是黑牛肝菌黑色素具有较强抗氧化特性的原因。此外，黑牛肝菌黑色素结构中不饱和键的存在可能使得其能够通过简单的单电子转移过程接受与自由基相互作用的电子，从而中和自由基24。黑色素的稳定性是影响其开发利用的关键因素，来源不同的黑色素对金属离子的稳定性具有一定差异16。黑蒜黑色素具有较好的热稳定性，其原因可能是高温环境引起的黑色素脱羧作用25。笔者获得的黑牛肝菌黑色素热稳定性较好，可能与自身结构脱羧作用有关。金属离子Fe2+、K+、Ca2+可以增加黑牛肝菌黑色素的吸光度值，而赵士豪等26发现Na+和Ca2+对根瘤菌R362黑色素的吸光度值无影响，推测黑牛肝菌黑色素分子中羰基官能团或取代基可与金属离子之间发生加成反应，形成较为稳定的络合物14，说明这些金属离子可以影响黑色素的稳定性。此外，Fe2+本身是一种强大的促氧化剂可加速脂质氧化，而笔者发现黑牛肝菌黑色素可以与Fe2+发生络合反应提高黑色素吸光度值，又可以阻止Fe2+氧化。笔者获得的黑牛肝菌黑色素稳定性易受氧化剂H2O2及还原剂 Na2SO3的影响，且质量浓度越高溶液吸光度值越低，黑色素稳定性越弱，这与对吸水链霉菌黑色素的研究结果相一致27，可能是黑色素被强氧化剂氧化及被强还原剂还原，破坏色素发色团结构，影响其色素稳定性。染发分为直接法和媒染法，其中媒染法包括同浴媒染法、先染后媒法、先媒后染法；先染后媒法染发效果优于先媒后染法、同浴媒染法，故笔者采用先染后媒法。天然黑色素染发易出现效果差、不稳定等问题。笔者提取的黑牛肝菌黑色素可将白发染成棕红色，经多次洗涤后仍具有稳定的色泽，表明该黑色素具有较好的着色效率及洗涤耐久性；这可能是因为头发角质外层中的半胱氨酸与黑色素通过强共价键相互作用，而Fe2+作为媒染剂又增强黑色素与头发之间的相互作用和色度。此外，笔者观察到染发完成后发丝毛鳞片紧闭，发丝不干燥反而更加顺滑，推测黑牛肝菌黑色素可能具有抚平毛鳞片，保护发丝的功效。笔者首次开展黑牛肝菌菌丝发酵制备黑色素及其理化特性的研究，验证黑牛肝菌黑色素作为天然色素染发剂原料的效果，可为后续开发安全高效的天然染发剂提供参考。参考文献1 TIAN R,CHAI H,QIU J Q,et al.Preparation,structural characterisation,and antioxidant activities of polysaccharides from eight boletes(Boletales)in tropical ChinaJ.Mycology,2022,13(3):195-206.2 李琦.黑木耳黑色素的提取、纯化及其活性研究D.武汉：华中农业大学,2011.3 罗星,李晓敏,薛帆正,等.银耳菌糠黑色素的理化性质及抗氧化和抑菌活性J.菌物学报,2023,42(2):539-552.77 王振娟，等：黑牛肝菌黑色素抗氧化活性和稳定性及染发效果第 4 期4 LI S L,YANG L Q,LI J L,et al.Structure,molecular modification,and anti-radiation activity of melanin from Lachnum YM156 on ultraviolet B-induced injury in miceJ.Applied Biochemistry and 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