河北省邢台市及周边地区猪流行性腹泻病毒流行情况调查及S1基因序列分析.pdf

省种植的最适覆土厚度为 5 cm。参考文献:1 刘艳玲,刘朋虎,李晶,等.不同栽培原料对灵芝生长及其子实体营养品质的影响J.福建农业学报,2022,37(05):609-616.2 刘凤山,林辉,林兴生,等.巨菌草对生态脆弱区治理与修复的研究进展J.贵州农业科学,2017,45(07):111-113.3 林兴生,林占熺,林冬梅,等.菌草作为生物质燃料的初步研究J.福建林学院学报,2013,33(01):82-86.4 陈冬梅,陈耀,张龙,等.川中丘陵地区不同生长高度巨菌草的营养成分比较分析J.动物营养学报,2021,33(09):5313-5323.5 白茹梦.巨菌草日光温室种植技术研究D.呼和浩特:内蒙古农业大学,2021.6 林兴生.菌草产业发展的几个关键技术研究D.福州:福建农林大学,2013.7 罗富成,余长林,袁德文.象草无性繁殖技术J.中国草地,1996(06):72.8 袁福锦,周自玮,许艳芬,等.栽种对象草生产性能的作用J.草业科学,2008(02):73-76.9 李亚杰,林占熺,安妮,等.荒漠地区巨菌草栽培技术J.林业科技通讯,2021(03):61-63.10 何鸿源,李清,毛华明,等.黑麦、青稞的生产性能及营养价值综合评价J.黑龙江畜牧兽医,2018(15):156-159.11 刘彦华.巨菌草丰产栽培技术研究D.呼和浩特:内蒙古农业大学,2021.12 陈碧成,林洁荣,罗宗志,等.巨菌草不同生长时间的常规营养成分及氨基酸含量测定J.贵州农业科学,2016,44(01):101-103.13 张进国,雷荷仙,黎纪凤,等.3 个牧草品种在铜仁市不同海拔区的生长表现J.贵州农业科学,2014,42(04):86-89.14李有涵,谢昭良,解新明.5 个象草品种的构件生物量特征及分配动态J.草业学报,2011,20(05):11-18.15 许能祥,董臣飞,张文洁,等.C4牧草饲用成分在植株中的分布规律及其适宜刈割高度J.中国草地学报,2021,43(01):34-42.16陈小凤,李杨瑞,叶燕萍.3 种禾本科牧草饲用品质的季节动态分析J.西南农业学报,2011,24(03):1173-1177.17 陈艳,王之盛,张晓明,等.常用粗饲料营养成分和饲用价值分析J.草业学报,2015,24(05):117-125.18 王明涛,方江平,普穷,等.菌草绿洲 1 号繁殖特征及营养成分初探 J.高原农业,2020,4(04):375-379.收稿日期:2023-02-10河北省邢台市及周边地区猪流行性腹泻病毒流行情况调查及 S1 基因序列分析高明艳1,要甜甜2,葛生虎2(1.青海农牧科技职业技术学院,青海 西宁 733006;2.河北铭诸生物科技有限公司,河北 邢台 054000)摘要:为初步调查河北省邢台市及周边地区猪流行性腹泻(PED)分子流行病学情况,试验于2022 年 1 月12 月从河北省邢台市及周边县(市、区)采集疑似感染 PED 猪肠道病料或新鲜粪便共 206 份,采用荧光定量 PCR 技术检测样品猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性率;同时采用 RT-PCR法扩增部分 PEDV 阳性病料 S1 基因序列,根据 S1 基因序列特征分析毒株基因型和变异情况。结果显示:共 47 份样品为 PEDV 核酸阳性,平均阳性率为 22.82%,其中腹泻仔猪、育肥猪和母猪样品PEDV 检出率分别为 27.05%、15.15%和 20.83%;采用 RT-PCR 法共扩增 6 份 PEDV 阳性样品 S1基因部分序列,进一步序列分析发现 5 个毒株属于 PEDV 变异株,1 个毒株属于 PEDV 经典株。研究结果表明,河北省邢台市及周边地区 PED 流行情况较严重,且同时流行 PEDV 经典株和变异株,但 PEDV 变异株为优势基因型。关键词:猪流行性腹泻病毒;分子流行病学;邢台市;S1 基因中图分类号:S852.65+9.6 文献标志码:A 文章编号:1005-1341(2023)04-0006-03 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea vi-rus,PEDV)属于 冠状病毒属重要成员,为有囊膜、单股正链 RNA 病毒。不同发育阶段猪群对PEDV 均易感,但该病原感染仔猪可导致严重的临床症状,如呕吐、脱水、水样腹泻和体重下降等,严重时导致死亡1。猪流行性腹泻(porcine epidemic di-arrhea,PED)由 PEDV 感染所引起,该病首次报道于英国(1971 年),我国于 1984 年首次报道该病。2004 年以前,PEDV 对猪群致病性较低,该病原的流行未引起养猪行业的关注。2010 年国内暴发 PEDV6云南畜牧兽医(2023 年第 4 期)变异株,该病原感染可导致仔猪出现高病死率,且广泛流行于世界各国,给养猪业带来了不可估量的损失2。PEDV 基因组包含多个开放阅读框(open read-ing frames,ORFs),可编码 4 种结构蛋白和 3 种非结构蛋白。S 蛋白属于 PEDV 主要的膜蛋白,由 S1 和S2 蛋白组成,在病毒感染过程中,S1 蛋白可介导病毒蛋白与宿主细胞膜发生膜融合,从而促进病毒入侵1。此外,S1 基因在病毒进化过程中遗传变异程度较其他基因高,且基于 S1 基因序列核苷酸或氨基酸多样性将 PEDV 流行株分为 2 个基因型(经典株和变异株)3。为调查河北省邢台市及周边地区 PEDV 流行情况及主要流行基因型,本试验从该地区疑似暴发PED 猪场采集病料样品 206 份,采用荧光定量 PCR法检测样品中是否存在 PEDV 核酸;采用 RT-PCR法扩增部分 PEDV 阳性样品 S1 基因部分序列并测序,分析毒株 S1 基因序列遗传多样性,旨在为该病的防控提供科学依据。1 材料与方法1.1 样品采集2022 年 1 月12 月从河北省邢台市及周边县(市)的 63 个疑似暴发 PED 猪场采集 206 份病料样品(肛门拭子、新鲜粪便样品或肠组织样品)。无菌采集样品后置于 10 mL 离心管内,标记样品相关信息后,低温送至河北铭诸生物科技有限公司待检。1.2 样品处理及 PEDV 核酸检测在超净工作台处理样品,主要步骤:用灭菌镊子和手术刀取少量组织或粪便样品放入灭菌 2 mL 离心管内,加入少量钢珠,加入适量 PBS 溶液;于匀浆机内高速匀浆 3 次(15 s/次),每次间隔 30 s;于低温离心机内离心(10 000 r/min)5 min,取上清;取200 L 上清用商业化病毒 DNA/RNA 基因组提取试剂盒提取病毒基因组,试剂盒购自武汉科前生物股份有限公司,基因组提取步骤参照试剂盒说明书进行。使用猪流行性腹泻病毒荧光定量 RT-PCR试剂盒(湖南冠牧生物科技有限公司产品)检测采集临床样品基因组中是否存在 PEDV 核酸,检测步骤和结果判定均参照试剂盒说明书进行。1.3 PEDV 阳性样品 S1 基因序列 RT-PCR 扩增及分析根据 Tan 等1文献合成扩增 PEDV S1 基因序列的引物(引物由上海生工生物工程有限公司合成)。取 6 份 PEDV 阳性且 Ct 值较低的样品,采用RT-PCR 法扩增 PEDV S1 基因序列。其中检测体系包括 2PCR 预混液 25.0 L、上游和下游引物各0.5 L、cDNA 模 板 3.0 L 及 无 RNA 酶 水21.0 L。反应条件为 94 5 min;94 30 s、58 30 s、72 90 s,共设置 35 个循环;72 7 min。反应结束后,取少量 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳,确定扩增产物为阳性后将剩余产物送至公司测序。从 GenBank 数据库下载国内外具有代表性的PEDV 流行株 S1 基因序列,应用 DNAStar 软件分析获得序列与参考 PEDV 株 S1 基因序列同源性,确定获得样品毒株的基因型。2 结果2.1邢台市及周边地区 PEDV 分子流行病学调查结果本研究于 2022 年 1 月12 月从邢台市及周边地区共采集疑似感染 PEDV 临床样品共 206 份,采用 RT-qPCR 法检测样品 PEDV 阳性率。结果如表1 所示,206 份组织样品中有 47 份检测为 PEDV 核酸阳性,平均阳性率为 22.82%。不同发育阶段腹泻猪群 PEDV 阳性率存在差异,其中腹泻仔猪来源样品 PEDV 检出率最高(27.05%),腹泻母猪和腹泻育肥猪来源样品 PEDV 检出率分别为 20.83%和15.15%。从不同季节 PEDV 阳性率调查结果来看,冬季来源临床样品 PEDV 检出率最高,为 33.33%,春季检出率次之,为 22.58%;夏季和秋季检出率低,分别为 15.15%和 15.69%。见表 2。表 1 邢台市及周边地区不同发育阶段腹泻猪群 PEDV 分子流行病学调查结果腹泻猪群调查样品/份阳性样品/份阳性率/%腹泻仔猪1223327.05腹泻育肥猪33515.15腹泻母猪24520.83其他27414.81合计2064722.82表 2 邢台市及周边地区不同季节腹泻猪群 PEDV 分子流行病学调查结果季节调查样品/份阳性样品/份阳性率/%春季621422.58夏季33515.15秋季51815.69冬季602033.33合计2064722.822.2部分 PEDV 阳性样品 S1 基因序列 RT-PCR扩增产物凝胶电泳结果采用 RT-PCR 法扩增 6 份 PEDV 阳性样品 S1基因序列,将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图 1 所示,6 份阳性样品均成功扩增出 2 000 bp左右片段,与预期结果基本一致,且阴性对照成立,7云南畜牧兽医(2023 年第 4 期)提示成功扩增出 PEDV S1 基因序列。MN123456（bp）1002505007501 0002 000M:DL2000 DNA marker;N:阴性对照;1-6:6份 PEDV 阳性样本。图 1 PEDV S1 基因序列 RT-PCR 扩增2.3 PEDV S1 基因序列同源性与遗传进化分析6 份 PEDV 阳性样品 S1 基因核苷酸序列大小一致,为 1 944 bp,可编码 647 个氨基酸。核苷酸、氨基酸序列同源性分析结果发现,5 个 PEDV 阳性样品(HeB-XT-1、HeB-XT-2、HeB-XT-4、HeB-XT-5 和 HeB-XT-6)S1 基因核苷酸、氨基酸序列与PEDV 中国流行变异株(AJ1102 和 AH2012)同源性最高,分别为 99.0%99.6%和 98.8%99.2%,与PEDV CV777 疫 苗 株 同 源 性 相 对 较 低,分 别 为95.3%95.9%和 93.0%93.3%。1 个 PEDV 阳性样品(HeB-XT-3)S1 基因核苷酸、氨基酸序列与PEDV CV777 疫苗株同源性最高,分别为 97.9%和96.8%,与 PEDV 流行变异株(AJ1102 和 AH2012)同源性相对较低,分别为 95.8%和 95.2%。遗传进化分析结果如图 2 所示,所有 PEDV 可分为 2 个基因型,为 genotype I(经典株)和 genotype II(变异株)。HeB-XT-3 分离株与 PEDV CV777 株等经典株亲缘关系较近,同属于 genotype I,而其余5株 PEDV 与变异株(AJ1102 和 AH2012)所属分支相隔较近,同属于 genotype II。以上结果表明,获得的6 株 PEDV 中 5 株属于变异株,1 株属于疫苗株(经典株)。genotype II（变异株）genotype I（经典株）图2 基于 PEDV S1 基因核苷酸序列构建系统进化树3 讨论近年来,国内有诸多机构调查 PEDV 分子流行病学特征,齐海涛等4调查了 20172020 年华北地区 PEDV 分子流行病学特征,发现华北地区 20172020 年收集的腹泻仔猪病料样品 PEDV 核酸检出率分别为 20.21%、15.28%、10.88%和 18.80%;不同季节中均以春季和冬季来源样品检出率最高。韩英明等5调查了山东省(20162018 年)部分地区PEDV 流行病学特征,发现该地区发病猪群 PEDV核酸检出率为10.17%,其中 PEDV 单纯感染率和混合感染率分别为 7.6%和 2.9%,且不同月份中以12 月和 1112 月检出率最高。曾宪煜等6系统性调查了福建省 20122018 年猪病毒性腹泻流行情况,发现导致该省猪腹泻的主要病原为 PEDV,检出率为 72.74%(1 457/2 003),猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒检出率分别为 7.89%(158/2 003)和 2.40%(48/2 003)。本研究结果显示,2022 年河北省邢台市及周边地区 PEDV 检出率为22.82%,其中腹泻仔猪来源样品检出率为 27.05%,与齐海涛等4调查结果基本一致,但低于曾宪煜等6调查结果。以上结果提示国内不同地区 PEDV 检出率存在差异,这可能与地理差异、样品来源和调查样品数量等有关,但总体而言,PEDV 仍是导致我国猪腹泻(尤其是仔猪腹泻)的主要病原之一。根据 PEDV S1 基因核苷酸或氨基酸序列多样性,可将 PEDV 流行株分为 2 个基因型(基因 I 型和基因 II 型),目前,广泛应用的 PEDV CV777 疫苗(弱毒苗或灭活苗)来源毒株属于基因 I 型,但大量研究表明 PEDV CV777 疫苗对基因 II 型毒株防控能力有限1。本研究获得的 6 个毒株中有 5 个毒株属于基因 II 型,与国内 2010 年后流行的 PEDV 变异株 S1 基因序列同源性最高,但与 PEDV CV777 株对应序列同源性较低,说明邢台市及周边地区PEDV 流行优势株仍然是基因 II 型(变异株),这与齐海涛等4和 Tan 等1研究结果一致。值得注意的是,本研究也发现邢台地区存在 PEDV 经典株流行,说明该地区同时存在 2 种基因型毒株流行,提示猪场诊断与防治 PEDV 过程中对毒株进行基因分型是十分必要的。参考文献:1 TAN L,LI Y L,HE J Y,et al.Epidemic and genetic characterization of porcine epidemic di-arrhea virus strains circulating in the regions a-round Hunan,China,during 2017-2018J.Arch Virol,2020,165(4):877-889.2 郭思杰,刘俊琦,李玉娟,等.猪流行性腹泻及新型疫苗研究进展J.中国畜牧兽医,2020,47(09):2935-2944.3 郑亮,郭德轩,于雯,等.猪流行性腹泻病毒蛋白功能研究进展J.生命的化学,2021,41(6):1133-1138.4 齐海涛,王利,颜忠,等.20172020 年华北地区猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查J.黑龙江畜牧兽医,2022(22):91-96.5 韩英明,孙秋艳,范作良,等.20162018 年山东省部分地区猪流行性腹泻流行病学调查J.山东畜牧兽医,2020(6):52-55.6 曾宪煜,陈秋勇,王隆柏,等.20122018 年福建省猪病毒性腹泻流行情况J.福建畜牧兽医,2020,42(3):11-14.收稿日期:2023-01-138云南畜牧兽医(2023 年第 4 期)