海洋寡糖酶法制备研究进展.pdf

杨子祥，李金梦，宋琨燕，等.海洋寡糖酶法制备研究进展 J.食品工业科技，2023，44（18）：458467.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100075YANG Zixiang,LI Jinmeng,SONG Kunyan,et al.Research Progress on Preparation of Marine Oligosaccharides by EnzymaticMethodJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(18):458467.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100075 专题综述 海洋寡糖酶法制备研究进展海洋寡糖酶法制备研究进展杨子祥，李金梦，宋琨燕，葛风茹，鄢烽，黄冰冰，张梦岩，巫小丹，刘玉环，郑洪立*（南昌大学食品学院，江西南昌 330047）摘要：海洋寡糖是海洋多糖降解得到的含两个至十个单糖残基的糖类化合物。相较于海洋多糖，海洋寡糖具有水溶性高、生物活性强、易于机体吸收等优点。海洋寡糖有抗肿瘤、抗氧化、降低胆固醇、免疫调节等生理活性，可以广泛应用于食品、医药等领域。本文综述了海洋多糖、海洋多糖酶法制备海洋寡糖和酶的催化机制，介绍了褐藻胶、壳聚糖和黄原胶三种主要的海洋多糖，以及褐藻胶裂解酶的-消除作用机制、壳聚糖酶的置换机制和黄原胶降解酶的降解作用机制。对海洋多糖酶法制备海洋寡糖的不足开展了讨论和未来的发展趋势进行了展望，以期为海洋寡糖制备及应用提供理论依据。关键词：海洋多糖，海洋寡糖，酶法，催化机制，生理活性本文网刊:中图分类号：TS254.4 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）18045810DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022100075ResearchProgressonPreparationofMarineOligosaccharidesbyEnzymaticMethodYANGZixiang，LIJinmeng，SONGKunyan，GEFengru，YANFeng，HUANGBingbing，ZHANGMengyan，WUXiaodan，LIUYuhuan，ZHENGHongli*（College of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China）Abstract：Marine oligosaccharides,which are prepared by degradation of marine polysaccharides,are carbohydrate com-pounds composed of two to ten monosaccharide residues.Compared with marine polysaccharides,marine oligosac-charides have several advantages,such as higher water solubility,stronger biological activity,and easier absorption by thebody.Marine oligosaccharides have a series of physiological activities,such as anti-tumor,antioxidation,lowering cho-lesterol,and immunomodulation.They can be widely used in food,medicine,and other fields.This paper summaries marinepolysaccharides,preparation of marine oligosaccharides from marine polysaccharides by enzymatic methods,and thecatalytic mechanism of the enzymes.Furthermore,three major marine polysaccharides(alginate,chitosan,and xanthan)andthe catalytic mechanism of the three enzymes(-elimination mechanism of alginate lyase,replacement mechanism ofchitosanase,and degradation mechanism of xanthan enzyme)are introduced.It is expected to provide a theoretical referencefor preparation and application of marine oligosaccharides,deficiencies and potential for future research of preparation ofmarine oligosaccharides from marine polysaccharides by enzymatic methods are discussed.Key words：marine polysaccharides；marine oligosaccharides；enzymatic method；catalytic mechanism；physiologicalactivities 海洋占地球总面积约 71%，海洋占地球全部水资源的 97%，海洋中生物资源丰富，种类繁多。海洋多糖是海洋生物资源中最主要的组成成分之一。由于海洋高盐、高渗透压、低温、低光照、寡营养、氧胁 收稿日期：20221010 基金项目：国家自然科学基金项目（22066016，21767017）；江西省技术创新引导类项目（20212BDH81004）；江西省重点研发计划项目（20192BBH80023）；赣州市重点研发计划项目（202101124943）。作者简介：杨子祥（1997），男，硕士研究生，研究方向：食品加工，E-mail：。*通信作者：郑洪立（1981），男，博士，副研究员，研究方向：微生物与食品发酵，E-mail：。第 44 卷 第 18 期食品工业科技Vol.44 No.182023 年 9 月Science and Technology of Food IndustrySep.2023 迫的特殊环境，形成了结构新颖和功能独特的海洋多糖1。近年来，随着人们对海洋资源的研究不断深入，发现海洋多糖具有调节免疫、降血糖、抗病毒、抗肿瘤等多种生理活性，这使其越来越广泛地应用于食品、医药、化妆品等领域2。然而，由于海洋多糖分子量大、结构复杂，导致了海洋多糖溶解性能差，严重限制了其应用3。海洋寡糖，也叫海洋低聚糖，是海洋多糖经过各种方法（物理法、化学法、酶法等）降解得到的直链或支链低度聚合糖，通常由 210 个单糖单元组成。较海洋多糖，海洋寡糖具有溶解性能好、生理活性高、更具多样性等优势，是二十一世纪糖类研究的热点。由于海洋寡糖原料海洋多糖结构和组成的多样性，外加海洋寡糖有不同的制备方法，故海洋寡糖结构和生理活性更具多样性4。海洋寡糖具有抑制肿瘤、抗氧化、免疫调节等生理活性，安全无毒，溶解性能好，广泛应用于食品、农业、医药等领域5。海洋寡糖具有糖醇类似的功能性甜味，且热量较低，可用作食品甜味剂。此外，海洋寡糖难以被人体消化，可满足糖尿病患者的需要。海洋寡糖是一种新型益生元，具有改善肠道微环境的作用6。海洋寡糖因具有促进植物生长、增强植物抗逆性、防治病害等作用，被广泛应用到农业生产中。海洋寡糖可以通过刺激和激活宿主细胞的免疫功能，增强机体对肿瘤细胞生长的调控，从而实现抗肿瘤的作用7。海洋寡糖的生物活性主要与其分子结构相关，分子结构主要受海洋多糖的种类、海洋寡糖制备方法、制备海洋寡糖的酶等因素影响，而制备结构新颖、聚合度明确的海洋寡糖，对于海洋寡糖的应用具有重要意义。本文综述了海洋多糖、海洋多糖酶法制备海洋寡糖和酶的催化机制，介绍了褐藻胶、壳聚糖和黄原胶三种主要的海洋多糖及褐藻胶裂解酶、壳聚糖酶和黄原胶降解酶的作用机制，并指出其存在的问题及今后的研究重点，以期为海洋寡糖制备及其应用提供理论依据。1海洋多糖海洋多糖种类繁多（表 1），包括海藻多糖、海洋动物多糖和海洋微生物多糖等8。海藻多糖是广泛存在于海带、马尾藻、昆布等植物中的天然活性多糖，多具有高粘度或凝固能力。海洋动物多糖是指海洋动物（虾、贝类、螃蟹、鲨鱼、海参等）中的多聚糖及酸性粘多糖，主要包括壳聚糖、糖胺聚糖、硫酸软骨素等。海洋微生物多糖是指海洋中的微生物代谢的多糖，分为胞外多糖、胞壁多糖和胞内多糖。我国海洋多糖资源丰富，已广泛应用于各领域，如褐藻胶作为增稠剂、分散剂、乳化剂等应用于工业生产中9。随着越来越多海洋多糖资源的发掘以及海洋生物技术的发展，如利用工程细菌发酵生产海洋多糖，将不断丰富海洋多糖资源。众多的海洋多糖为海洋寡糖的制备提供了丰富的原料资源10。生产寡糖较多的海洋多糖原料有黄原胶、壳聚糖、琼脂、卡拉胶、褐藻胶、岩藻聚糖等。我国是世界最大的褐藻胶（海藻酸钠）生产国11，壳聚糖是地球上年产量仅次于纤维素的天然高分子化合物12，黄原胶是目前世界上生产规模最大的微生物多糖13，故本文选取褐藻胶、壳聚糖和黄原胶为代表性海藻多糖、海洋动物多糖和海洋微生物多糖进行研究。表 1 海洋多糖Table 1 Marine polysaccharides多糖种类多糖名称来源参考文献海藻多糖褐藻胶海带、马尾藻等14褐藻糖胶裙带菜、昆布等15琼脂石花菜、江蓠等15卡拉胶角叉菜、鹿角菜等15海洋动物多糖壳聚糖虾、贝类、螃蟹等16硫酸软骨素鲨鱼、乌贼等5,7岩藻聚糖硫酸酯海参5,17海洋微生物多糖胞外多糖海绵共附细菌18甘露聚糖爱德华氏细菌18黄原胶假黄单胞菌19 1.1褐藻胶褐藻胶又叫褐藻酸，分子量介于 20250 kDa 之间20。褐藻胶是广泛存在于海带、巨藻、马尾藻等褐藻细胞壁和细胞质间的一种海藻多糖，在天然状态下主要以游离酸、一价盐和二价盐的形式存在。-D-甘露糖醛酸（M）和-L-古洛糖醛酸（G）以 14 糖苷键构成线性多糖即为褐藻胶20。以上线性多糖有均聚甘露糖醛酸（PM）、均聚古罗糖醛酸（PG）和杂聚物（PMG）三种排列方式21（图 1）。这两种糖醛酸的比例因褐藻种类的不同而有很大差异，这种结构的多样性可能是由于褐藻对环境或生理条件的功能适应性23。早在 1881 年，英国的化学家 Stanford 首次在褐藻中发现并成功分离出褐藻胶24。目前市售的褐藻酸钠（又叫海藻酸钠）是以海带等为原料，采用稀碱溶液提取法制备得到。褐藻酸钠具有抗氧化性、抑菌性、抗肿瘤、降胆固醇等生理活性，用作食品添加剂、医学领域的支架材料、农药化肥增效剂等2527。褐藻中褐藻胶的含量最高可达藻体干重的 40%28。褐藻胶为亲水性分子，褐藻酸与碱金属离子生成褐藻酸盐，易溶于水。褐藻胶的溶解性受 PM、PG 和 PMG的排列方式、M/G 的比例、溶液离子强度、pH 等的影响21,23。褐藻胶为酸不溶性，在 pH 低于 3 时，会转变为褐藻酸而析出23。1.2壳聚糖壳聚糖是一种广泛存在于虾、螃蟹、贝壳等海洋节肢动物的甲壳以及海洋软体动物的壳和骨骼中的海洋动物多糖，纯天然有机大分子，是甲壳素脱去乙酰基而成。壳聚糖也是目前大自然中发现的独一无二带正电荷的大分子碱性多糖29。它的基本糖单元为氨基葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖（图 2），起连接作用第 44 卷 第 18 期杨子祥，等：海洋寡糖酶法制备研究进展 459 的键为-1,4-糖苷键。壳聚糖的单体为-（14）-2-氨基-2-脱氧 b-d-葡聚糖和-（14）-2-乙酰氨基-2-脱氧-b-d-葡聚糖，分子量介于 101 000 kDa 之间；壳聚糖溶于稀酸，不溶于水和有机溶剂；壳聚糖在稀酸中的溶解性与其脱乙酰度呈正相关30。它的表面含有大量的氨基、羟基等活性基团，可以发生烷基化、酰基化、羧基化等多种化学反应，能与碳水化合物等阴离子或高分子化合物形成具有不同性能的壳聚糖衍生物。壳聚糖有免疫调节31、防治高血压32、抗肿瘤33等生理活性，可自然降解，已在食品、医疗等领域产业化应用。OHONH2OHHOOOHOOHNH2OONH2OHHOOHn图 2 壳聚糖的结构式30Fig.2 Structural formula of chitosan30 1.3黄原胶黄原胶，又称为黄胶、汉生胶。它是海洋微生物代谢的一种水溶性胞外多糖。黄原胶分子（图 3）是由 D-葡萄糖、D-甘露糖和 D-葡糖醛酸组成。以上三种成分按 2:2:1 组成相对分子量在 1000 kDa 以上的天然有机高分子化合物19。黄原胶一级结构含葡糖基主链和三糖单位的侧链，葡糖基主链与纤维素主链结构相同，即-1，4-糖苷键连接两分子 D-葡萄糖；1 分子 D-葡糖醛酸和 2 分子 D-甘露糖在侧链中交替排列，与主链相连的甘露糖在 C-6 处被乙酰化，丙酮酸部分替代侧链末端的甘露糖，并以缩醛形式连接在 4-和 6-位置；其二级结构为双螺旋结构，在氢键作用下，侧链反向缠绕主链而形成；其三级结构为螺旋复合体，在共价键的作用下，由二级结构基础上形成，正因这种特殊的化学结构，使黄原胶溶液具有良好的耐盐性、耐酸耐碱性、协同凝胶特性、独特的流变性等13。因此，黄原胶作为增稠剂、稳定剂等在食品工业、医药行业等大范围使用。黄原胶是目前世界上生产规模最大的微生物多糖13。2酶法制备海洋寡糖海洋寡糖的制备方法主要有化学法、物理法和生物酶法（表 2）。化学法是通过化学催化剂如草酸、过氧化氢、氢氧化钠等催化海洋多糖生成寡糖的方 OHOOHOOCOOHOHOOCOOHOHOOCOnHOOHHOaOOOHOHHOOCOHOOCOHOHOOOHHOOCOHnOObOHOHOOCHOOOOOHHOOCOHOOHOHOOCHOOOHHOOCOHOOnc图 1 褐藻胶的结构式22Fig.1 Structural formula of alginate22注：a：均聚甘露糖醛酸（PM）；b：均聚古罗糖醛酸（PG）；c：杂聚物（PMG）。HOOCCOOHOOOOOOOOOOOOOOHOHOHOHOHOHnOHHOCH2OAcCH2OHCH2OHOHCH2H3C图 3 黄原胶的结构式13Fig.3 Structural formula of xanthan gum13 460 食品工业科技2023 年 9 月法，化学法应用广泛，操作简便，是一种成熟的方法。但它存在化学催化剂污染环境、反应条件剧烈、副产物量大等缺点3436。物理法（微波辐射、紫外线照射、高温高压等）操作简便、不需要催化剂，但存在降解效率低下、海洋寡糖得率低等问题3739。生物酶法条件温和、酶专一性强、海洋寡糖得率高、不产生副产物、环境友好，是制备海洋寡糖的有效方法4042。早期生物酶法制备海洋寡糖以游离酶法为主，目前生物酶法制备海洋寡糖主要采用固定化酶法。游离酶法和固定化酶法通常均采用单一酶，而不是复合酶4046。当前酶法制备得到的海洋寡糖主要有：壳寡糖6、褐藻胶寡糖7,9,35、卡拉胶寡糖、黄原胶寡糖、琼胶寡糖等42。表 2 海洋寡糖制备方法Table 2 The preparation methods of marine oligosaccharides制备方法优点缺点参考文献物理法操作简单、试剂用量少降解率低3436化学法技术成熟、成本低腐蚀设备、污染环境3739游离酶法条件温和、绿色高效成本高、稳定性差、酶不可重复利用4043固定化酶法稳定性高、产品收率高、酶可重复使用酶活力低、只适用于小分子底物4446 2.1游离酶法制备海洋寡糖游离酶法制备海洋寡糖是以海洋多糖为原料。海洋多糖种类众多，而酶催化具有高度专一性，故制备海洋寡糖的酶种类众多；包括一类是降解特定的海洋多糖如褐藻胶裂解酶、壳聚糖酶、黄原胶降解酶、卡拉胶酶、琼胶酶等，另一类降解非特定的海洋多糖，如：淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、甘露糖酶等，以上酶主要来自微生物。酶法制备海洋寡糖始于上世纪 50 年代中后期，其目的主要是为了研究海洋寡糖的结构与构效关系以开发药物和功能性制品。经过多年的发展，利用游离酶制备海洋寡糖已经取得了显著进展；特别在新酶的发现、酶结构、性质与功能的解析、酶的改造、酶催化条件的优化等方面做了大量的研究4041,47。不同酶作用于不同的海洋多糖，其反应条件和产物不同。Falkeborg 等27利用-褐藻胶裂解酶催化 5%褐藻酸钠，反应条件：酶用量 5%、温度 35、pH7.0、酶解时间 48 h，产物为聚合度不大于 4 的寡糖。季珂等48以壳聚糖酶催化 1%壳聚糖，反应条件：酶用量 120 U/g、温度 50、pH6.0、酶解时间4 h，制备得到的寡糖聚合度不大于 4。谷金芸等49以黄原胶降解酶催化 2 mg/mL 的黄原胶，酶解条件：酶用量 1 mg/mL、温度 45、pH8.0、酶解时间 2 min，得到了黄原胶寡糖聚合度为 718。同一酶，但不同类型，催化产物也不相同。-褐藻胶裂解酶和双功能褐藻胶裂解酶 AlySY08 制备得到的寡糖聚合度不同。Li 等50利用双功能褐藻胶裂解酶 AlySY08 催化 0.3%褐藻胶，酶解条件：酶用量 21.5 U/mg、温度40、pH7.6、酶解时间 8 h，所制备的寡糖聚合度不大于 5，寡糖得率超过 80%。游离酶法虽然降解效率高、可制得低分子量的海洋寡糖，但存在酶无法重复利用、易失活以及在均相催化中与底物/产物难以分离等缺点，导致其生产成本提高，使游离酶法制备海洋寡糖在工业生产中严重受到限制4043。2.2固定化酶法制备海洋寡糖固定化酶技术是指使用物理或化学方法将游离酶限定在一定空间内或完全束缚在某种特定的载体上，但仍能保持酶活性的一种生物技术51。与游离酶相比，固定化酶对不良环境耐受性更强，同时具有重复利用性、储存稳定性和操作稳定性等优点46,52。酶的固定化方法多种多样，主要有吸附法、包埋法、交联法和共价结合法（表 3）。吸附法是指将酶分子吸附在纤维素、二氧化硅、活性炭、氧化铝等载体表面从而实现固定化的方法；吸附法成本低、操作简便，但固定化效率低53。包埋法是指将酶分子包裹在载体材料中从而实现固定化的方法，常以海藻酸钠、琼脂等为载体材料54。酶通过戊二醛、京尼平等试剂交联载体，从而达到固定化的方法称为交联法，交联法常与吸附法联用，提高酶的固定化效率及稳定性，但在交联过程中反应剧烈，使得酶的活性降低，需要不断探索更加温和的固定化工艺来减少酶活损失55。共价结合法是指酶分子中的非必需侧链基团（氨基、羧基和巯基等）与载体中的功能基团（环氧基、羟基、羧基等）通过共价键结合，使酶分子固定在载体上的方法56。与游离酶相比，通过与其他载体材料结合，提高了固定化酶的稳定性，且易与底物/产物分离，实现了酶的重复利用，极大地降低了生产成本，因此，固定化酶技术在工业生产中应用前景广阔，从而引发了国内外学者对多糖降解酶固定化的探讨。Jiang 等57用四氧化三铁纳米磁性材料为载体，固定化了褐藻胶裂解酶 AlgL17，此固定化酶重复使用 5 次后，仍能保 表 3 固定化酶制备方法Table 3 The preparation methods of immobilized enzyme固定化方法优点缺点常用载体材料参考文献包埋法条件温和、成本低、固定化速率高稳定性差、催化效率低海藻酸钠、明胶、琼脂53吸附法操作简便、成本低、酶活回收率高稳定性差、重复利用低纤维素、二氧化硅60交联法制备简单、稳定性高、载体可回收或无需载体反应剧烈、固定化程度弱壳聚糖、磁性Fe3O4纳米颗粒55共价结合法稳定性好、重复性好、载体可再生反应剧烈、酶易失活、载体要求高沸石、尼龙、环氧树脂61第 44 卷 第 18 期杨子祥，等：海洋寡糖酶法制备研究进展 461 持最大酶活的 70%；利用其催化 5 mg/mL 的褐藻胶，得到了聚合度不大于 4 的褐藻寡糖。研究人员以戊二醛-琼脂糖固定化了壳聚糖酶，固定化酶重复使用25 次后，仍能保持最大酶活的 40%；利用该固定化酶催化 20 mg/mL 的壳聚糖，得到的寡糖聚合度不大于 2058。我国科学家已成功实现了纳米 SiO2材料固定化几丁质酶，固定化酶的活力是未固定化酶的70%；该固定化酶可用于催化真菌多糖几丁质产生几丁寡糖59。但固定化往往存在降低酶活力，固定化酶只适用于小分子底物等问题；这些问题极大地限制了固定化酶的应用。固定化酶法展现出很好的应用前景。反应器是固定化酶法制备海洋寡糖的重要载体。反应器可以为固定化酶法制备海洋寡糖提供其所需的最佳催化条件。反应器的设计需要考虑温度、pH、搅拌等参数的控制，还需要考虑物质和能量传递、能耗等因素62。目前反应器的运行模式主要有批式、分批补料及连续式。反应器主要有搅拌罐式反应器、膜式反应器、固定床式反应器和流动床式反应器63。反应器已经成为固定化酶法制备海洋寡糖效率的关键设备，已受到越来越多的关注。3多糖降解酶及其催化机制目前，酶法制备海洋寡糖的关键是高效多糖降解酶的发掘。近年来，研究者们已经从海洋软体动物、海洋细菌和真菌、土壤细菌和真菌等微生物中分离纯化出多种多糖降解酶，用于海洋寡糖的制备64。同时利用色谱法、结晶法、X 射线衍射法、生物信息学方法等，结合突变技术、共结晶技术、基因工程技术等23,2728，解析了多糖降解酶结构和功能，初步揭示其催化机制。由于不同海洋多糖其结构和组成存在较大差异，需要采用不同多糖降解酶；此外，由于多糖降解酶来源、酶的组成、酶的分子量、酶的结构等相差很大，故不同多糖降解酶的催化机制差异显著。在多糖降解酶的活性中心、酶的分子修饰、海洋多糖降解模式与产物生成特点之间规律等方面缺乏深入研究，多糖降解酶的催化机制目前尚未完全阐明，需要进一步研究。本文综述了三种多糖降解酶来源、分类及其催化机制。3.1褐藻胶裂解酶及其催化机制褐藻胶裂解酶是特异性降解褐藻胶的一类酶的总称，其种类繁多、分布广泛。自 1984 年 Hensen 从土壤和海洋中分离出的枯草芽孢杆菌 JBH2 中发现褐藻胶裂解酶以来，50 多种褐藻胶裂解酶已经被分离出来，它们主要来源于腐烂的褐藻、海洋软体动物消化液、海洋和土壤微生物中65。褐藻胶裂解酶分子量一般不大于 1000 kDa66。Wang 等67从腐烂海带中分离得到海洋弧菌 Vibrio sp.YWA，通过硫酸铵沉淀、柱层析等组合方法从该菌发酵液中分离纯化得到特异性水解 1,4-D-聚甘露糖醛酸的褐藻胶裂解酶，其分子量约为 62.5 kDa；最适 pH 和温度分别为 7.0 和 25；EDTA 和 Zn2+增强该酶的活性，而 Ba2+抑制它的活性。褐藻胶裂解酶可以分成不同类型，按酶作用底物来划分，可以分成三类：1,4-D-聚甘露糖醛酸（Poly M）裂解酶（EC 42.2.3）；1,4-L-聚古罗糖醛酸（Poly G）裂解酶（EC 4.2.2.11）以及Poly M 和 Poly G 均可降解的双功能酶。按酶作用位点来划分，可以分成内切酶和外切酶。大部分褐藻胶裂解酶为内切酶66，其酶切位点如图 4 所示。褐藻胶裂解酶的催化机制目前认为主要是在酶-消除作用下，使褐藻胶中起连接作用的糖苷键断裂，生成寡糖。酶使两个残基之间 1,4-O-糖苷键断裂，同时在 C4 和 C5 之间产生双键，在产物的非还原性末端形成不饱和糖醛酸，得到一连串各种长度的寡糖68。Gacesa69认为褐藻胶裂解酶降解过程分三步进行：首先，底物上的羧基通过形成盐桥被中和；其次，C5 位的质子被提取，形成稳定的烯醇阴离子中间体；最后，C4 和C5 之间从羧基得到电子，并形成不饱和双键，从而使 1,4-O-糖苷键断裂，完成 消除反应。综上，尽管对部分褐藻胶裂解酶的结构和催化机制进行了研究，由于不同来源的褐藻胶裂解酶降解褐藻胶的机制和制备寡糖的结构不同，仍然有大部分的酶作用机制需要进一步去研究。3.2壳聚糖酶及其催化机制壳聚糖酶是催化壳聚糖的酶。它主要存在于真菌和细菌细胞中，此外，壳聚糖酶也存在一些植物中，分子量介于2060 kDa 之间70。1973 年，Monaghan OOOCOOCHOOOHOOHOHOOOHOCOOOOOCHOHOOOOHCOOOOOOOCHOOHOnMMGMGG图 4 褐藻胶裂解酶酶切位点66Fig.4 Cleavage site of alginate lyase66注：M：-D-甘露糖醛酸；G：-L-古洛糖醛酸。462 食品工业科技2023 年 9 月等71首次从土壤微生物中发现了壳聚糖酶，并提出：壳聚糖酶是一种特异性降解壳聚糖的新型酶，对于胶态几丁质基本不能水解，但可催化几丁质生成壳聚糖。根据壳聚糖酶的作用位点的不同，可以分为内切型壳聚糖酶和外切型壳聚糖酶72。目前所发现的壳聚糖酶大多为内切型壳聚糖酶，而对于外切型壳聚糖酶的报道相对较少。基于氨基酸序列的不同，壳聚糖酶可以分为GH3、GH5、GH7、GH8、GH46、GH75 和 GH80 七种73。其中，已经破解 GH46、GH75、G8 和 GH80壳聚糖酶的结构。GH46 壳聚糖酶主要分离自杆菌属和链霉菌属的细菌，其催化机制和蛋白质结构已被广泛研究。GH75 壳聚糖酶主要来源于真菌。壳聚糖酶 GH46、GH75 和 GH80 只能水解壳聚糖，是壳聚糖的专一性水解酶，而其他家族的壳聚糖酶往往具有其他酶活性如纤维素酶和糖基转移酶等74。根据酶底物特异性的不同，可以将壳聚糖酶分为四个不同的类型：类壳聚糖酶（切割 GlcN-GlcN 和 GlcNAC-GlcN 糖苷键）、类壳聚糖酶（水解 GlcN-GlcN 糖苷键）、类 壳 聚 糖 酶（切 割 GlcN-GlcN 和 GlcN-GlcNAC 糖苷键）以及类壳聚糖酶（裂解以上三种糖苷键）75。催化机制因不同壳聚糖酶而异，基于酶解产物还原端异头碳结构的差异，通常有保持异头构型的“retaining”机制（图 5a）和形成倒立异头构型“invert-ing”机制（图 5b）；“retaining”通过两步置换机制催化水解，有两个关键氨基酸残基参与反应，其中一个氨基酸残基作为亲核基团，另一个作为广义酸/碱；相反，“inverting”遵循一步、单一的置换机制，也有两个关键氨基酸参与反应，其中一个作为广义碱使水分子极化以产生更强的亲核基团来攻击异头碳，而另一个则作为广义酸使糖苷氧质子化以加速反应70。x 射线结构表明：在壳聚糖酶的催化过程中，Glu22 和Asp40 有着重要作用。总之，尽管近几年在个别家族的壳聚糖酶催化机制方面取得了一定的研究成果，但壳聚糖酶属于多个糖苷水解酶家族，大部分家族的壳聚糖酶结构和催化机制研究甚少。3.3黄原胶降解酶及其催化机制黄原胶降解酶是指能够降解黄原胶的酶的统称。由于黄原胶独特的双螺旋结构和侧链基团产生的位阻，其不易被酶降解，需要在多种酶的协同下才能被彻底水解，因此，黄原胶降解酶是由多种酶组成的混合酶系，分子量介于 10100 kDa 之间；黄原胶降解酶由黄原胶主链修饰酶和黄原胶侧链修饰酶组成76。黄原胶主链修饰酶作用于其主链，主要有-D-葡聚糖酶和-D-葡聚糖苷酶；黄原胶侧链修饰酶是可以攻击黄原胶分子中所有侧链连接的混合酶系，包括黄原胶裂解酶、-D-甘露糖苷酶和不饱和葡糖醛酸水解酶；其中，-D-葡聚糖酶和黄原胶裂解酶属于胞外酶，-D-葡聚糖苷酶、-D-甘露糖苷酶和不饱和葡糖醛酸水解酶属于胞内酶77。黄原胶在上述五种酶的参与下才能彻底水解，Nankai 等78详细报道了由芽孢杆菌 Bacillus sp.str-ain GL 1 产生的这五种酶降解黄原胶的过程（图 6）。首先，芽孢杆菌细胞外的黄原胶裂解酶攻击黄原胶侧链分子中丙酮酸化的甘露糖基和葡糖醛酸残基之间的糖苷键，从而除去丙酮酸化的甘露糖；其次，无末端的黄原胶主链在胞外酶-D-葡聚糖酶的催化下生成四元糖，后经糖转运途径被转运到细胞内，在细胞内被-D-葡聚糖苷酶转化为三元糖（不饱和葡萄糖醛 abGlu 22Glu 22Glu 22Asp 40Asp 40ROHAsp 40OOOOOOHOHOOOOORRHHHHHHB+ROH+图 5 壳聚糖酶催化机制70Fig.5 Catalytic mechanism of chitosanase70注：a：“retaining”催化机制；b：“inverting”催化机制。第 44 卷 第 18 期杨子祥，等：海洋寡糖酶法制备研究进展 463 酸-乙酰甘露糖-葡萄糖）；再次，不饱和葡糖醛酸水解酶水解三元糖，生成葡萄糖醛酸和双糖甘露糖-葡萄糖；最后，双糖被-D-甘露糖苷酶分解成葡萄糖和甘露糖78。总之，利用黄原胶降解酶催化黄原胶制备寡糖的作用机制研究仍然十分匮乏，同时无法实现黄原胶相关降解酶的获取，且生成寡糖的含量有限，很难实现黄原胶寡糖的工业化生产。4总结与展望海洋寡糖种类繁多、来源广泛，具有抗肿瘤、抗氧化、抗凝血和抗炎等生理活性，在医药、化妆品、食品、农业等领域发挥着越来越重要的作用，有着广阔的发展前景。目前，海洋寡糖生物酶法制备具有反应条件温和、绿色环保、降解率高等优势，因此，高效优质的海洋寡糖酶法制备工艺开发是当前的主流发展方向。随着科学技术和酶工程的不断发展，很多新型酶进入人们的视野。其中，纳米酶是有催化作用的纳米材料。纳米酶很稳定、价格低廉和易于工业化放大等优点，引起了人们的广泛关注79。迄今为止，已发现具有氧化还原酶、水解酶、裂合酶和异构酶四种催化类型的纳米酶80。纳米酶的发现成为未来酶法制备海洋寡糖的发展方向。随着酶工程和基因工程的不断发展，酶法制备海洋寡糖未来发展方向有如下四个方面：不断发掘催化效率高的酶资源，包括新技术得以应用于酶的分子修饰和改造，获得高效的酶资源。通过基因工程获得更多优质的酶，并实现优质酶的产业化。从自然界中发现新的酶；完善酶促反应的技术路线，实现高浓度底物的高效降解，提高生产效率、降低生产成本；构建基于固定化酶的高效反应器，包括搅拌罐式反应器、固定床式反应器、流动床式反应器和膜式反应器，实现海洋寡糖的连续化生产。同时加强对新型固定化酶技术及载体的探讨，提高固定化酶活性，降低生产成本；阐明海洋寡糖制备过程中酶的作用和调控机制，提升酶的催化效率，强化酶的调控。随着科学技术的不断发展和研究人员的不断探索，将会促进海洋多糖资源的集约开发和海洋寡糖的商业化生产。参考文献 1 ZHAO J,YANG J F,SONG S,et al.Anticoagulant activityand structure characterization of polysaccharide from abalone(Hali-otis discus hannai Ino)gonadJ.Molecules，2016，21：697.2 JIAO G,YU G,ZHANG J,et al.Chemical structures andbioactivities of sulfated polysaccharides from marine algaeJ.Ma-rine Drugs，2011（9）：196223.3 赵小亮,王钰婷,肖宁,等.海洋寡糖及其衍生物活性的研究进展J.生物技术进展，2018，8（6）：477488.ZHANG X L,WANG Y T,XIAO N,et al.Progress on activities of marine oligo-saccharides and their derivativesJ.Current Biotechnology，2018，8（6）：477488.4 SHI D L,QI J H,ZHANG H,et al.Comparison of hydrother-mal depolymerization and oligosaccharide profile of fucoidan and CH2OHCH2OAcCH2OHOOHHOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO-D-葡聚糖酶-D-葡聚糖苷酶-D-葡聚糖酶黄原胶裂解酶不饱和葡糖醛酸水解酶-D-甘露糖苷酶HOOCCOOHCOOHCOOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHHOHOHOOOOOOOOOCOOHCOOHOHOHOHOHHOHOOHCH2CH2OHCH2OHCH2OHCH2OAcCH2OHCH2OHCH2OAcCH2OHCH2OAcH3COHOHnn图 6 黄原胶降解途径78Fig.6 Degradation pathway of xanthan gum78 464 食品工业科技2023 年 9 月fucosylated chondroitin sulfate from Holothuria floridanaJ.Inter-national Journal of Biological Macromolecules，2019，132：738747.5 李玲翠,王培培,吴文惠,等.海洋寡糖及在功能食品中的应用研究进展J.食品与发酵工业，2023，49（5）：313320.LI LC,WANG P P,WU W H,et al.Research progress of marineoligosaccharides and their application in functional foodsJ.Foodand Fermentation Industries，2023，49（5）：313320.6 王鲁霞,吴延立,马文平.壳寡糖的制备方法及其在食品中的应用现状J.安徽农业科学，2014，42（32）：1148511487.WANGL X,WU Y L,MA W P.The preparation method and applicationstatus of chitooligosaccharide in foodJ.Journal of Anhui Agricul-ture Science，2014，42（32）：1148511487.7 阿拉腾珠拉,胡永飞.褐藻寡糖的制备方法及生物活性研究进展J.生物工程学报，2022，38（1）：104118.ALTZL,HU YF.Advances in the preparation of alginate oligosaccharides and itsbiological functionsJ.Chinese Journal of Biotechnology，2022，38（1）：104118.8 张坤,王令充,吴皓,等.活性海洋多糖的功能及结构研究概况J.中国海洋药物，2010，29（3）：5560.ZHANG K,WANGL C,WU H,et al.General situation of research on the function andstructure of active marine polysaccharidesJ.Chinese Journal ofMarine Drugs，2010，29（3）：5560.9 刘以晴,马月云,刘宗浩,等.褐藻胶寡糖的制备、分离及表征研究进展J.食品工业科技，2022，43（9）：456468.LIU Y Q,MA Y Y,LIU Z H,et al.Review on preparation,separation andcharacterization of alginate oligosaccharideJ.Science and Tech-nology of Food Industry，2022，43（9