海南不同成熟期诺丽果的蛋白鉴定及功能分析.pdf

热带作物学报 2023,44(7):13481364 Chinese Journal of Tropical Crops 收稿日期 2022-09-16；修回日期 2022-11-18 基金项目 海南省院士创新平台科研专项-海南省科技厅“海南黎药资源化学成分与药理活性研究”（No.YSPTZX202030）。作者简介 邱 静（2000），女，本科生，研究方向：植物蛋白质组学。*通信作者（Corresponding author）：赵振东（ZHAO Zhendong），E-mail：；何文英（HE Wenying），E-mail：。海南不同成熟期诺丽果的蛋白鉴定及功能分析 邱 静1，宋 媛1，王 妮1，王佳人1，陈 静1，陈光英1，赵振东2*，何文英1*1.热带药用资源化学教育部重点实验室，海南海口 571127；2.海南大学分析测试中心，海南海口 570228 摘 要：诺丽果（noni）是海南的一种特色水果，具有多种药效价值，但关于其植物蛋白的研究却很少。本研究采用基于 BPP+酚提取法的双向电泳技术，通过优化实验条件，对花蕾期、半成熟及成熟期等 3 个时期产自海南的诺丽果实进行蛋白质的提取分离，获得其植物蛋白指纹图谱；利用 Image Master 5.0 软件分析凝胶图像筛选出高表达蛋白；再利用 MALDI-TOF-MS 技术对这些蛋白酶解产物进行质谱鉴定；通过生物信息学手段对 3 种诺丽果实的高表达蛋白初步进行蛋白功能分析。结果表明：花蕾期、半成熟及成熟诺丽果实分别有 44、49 和 40 个高表达蛋白，通过质谱鉴定，确定了其中分别有 33、22 和 39 个蛋白，从属不同植物功能的蛋白种类；不同成熟期的高表达蛋白差异较大，涉及叶绿体连接酶、半胱氨酸蛋白酶、蛋白激酶、泛素连接酶、生长素反应因子等多种蛋白质。该研究为进一步开发利用诺丽果的植物蛋白提供科学合理的理论指导。关键词：诺丽果；不同成熟期；蛋白；功能分析 中图分类号：S759.83 文献标识码：A Identification and Functional characterization of Protein in Hainan Noni(Morinda citrifolia L.)Fruit at Different Ripening Stages QIU Jing1,SONG Yuan1,WANG Ni1,WANG Jiaren1,CHEN Jing1,CHEN Guangying1,ZHAO Zhendong2*,HE Wenying1*1.Key Laboratory of Tropical Medicinal Resource Chemistry of Ministry of Education,Haikou,Hainan 571127,China;2.Analytical and Testing Center,Hainan University,Haikou,Hainan 570228,China Abstract:Noni fruit is a characteristic fruit of Hainan with a variety of medicinal effects,but there are few studies on its plant proteins.In the present study,two-dimensional gel electrophoresis(2-DE gel)technology based on the BPP+phenol extraction method was used to extract and separate the proteins of noni fruits at different ripening stages including bud stage,half ripe stage,and mature stage by optimizing the experimental conditions to obtain the fingerprint of plant proteins.The gel images were analyzed by Image Master 5.0 software and some proteins with high expression were screened out.The enzymatic hydrolysates of the proteins were further identified by using MALDI-TOF-MS technology.The functional analysis of the highly expressed proteins of three kinds of noni fruits were preliminarily carried out by bioinformatics methods.The results indicated that there were respectively forty four,forty nine,and forty highly expressed proteins at three maturites noni fruits.Among the proteins,there were respectively thirty three,twenty two and thirty nine proteins by mass spectrum identification,which subordinated to various types of protein with dif-ferent plant functions.Moreover,significant difference existed in the highly expressed proteins of different maturity stages,which involved in a variety of proteins such as chloroplastic ligase,cysteine proteinase,protein kinase,ubiquitin ligase,and auxin response factors.It could provided a scientific and reasonable theoretical guidance for the further development and utilization of the plant protein of noni fruits.Keywords:noni(Morinda citrifolia L.)fruit;different maturites;protein;functional analysis DOI:10.3969/j.issn.1000-2561.2023.07.005 第 7 期 邱 静等：海南不同成熟期诺丽果的蛋白鉴定及功能分析 1349 诺丽（Noni）即海巴戟（Morinda citrifolia L.），又名热带海巴戟、海巴戟天、四季果等，属茜草科巴戟天属植物，是一种生长于热带及亚热带的多年生常绿阔叶灌木或小乔木，波利尼西亚土著将诺丽作为民间药物使用已有 2000 多年历史，民间多用于治疗发烧、腹泻、便秘、哮喘、恶心呕吐、蚊虫叮咬及动物咬伤引起的感染等疾病1-2。诺丽植株的多部位含有多种活性成分，近年来已从诺丽的根、茎、叶、花、果实、树皮、芯材等部位分离鉴定了300余种化合物，主要包括黄酮、多糖、香豆素、蒽醌、环烯醚萜、生物碱、木脂素、香豆素、三萜、甾醇等化学成分3。现代药理学研究表明，诺丽具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗焦虑、抗抑郁、降血脂、降血糖、肝保护、改善记忆、提高耐力、提高免疫力、减轻骨质疏松症、改善关节疼痛及活动度、对缺血性神经元损伤的保护作用、多巴胺双向调节等作用4。作为一种传统药食同源的植物，诺丽果实也是一种特色的热带水果，据报道，其中含有 275 种以上的营养成分，除含抗氧化物、东莨菪碱、多醣体、及罕见的对人体健康非常重要的17种虹甙类（环烯醚萜类）等化学成分以外，还包括人体所需的 20 种必需氨基酸、9 种人体内无法自行生成的必需氨基酸；另含有丰富维生素 B1、维生素B2、维生素 B6、维生素 B3、叶酸等 14 种维生素，含有钾、钠、锌、钙、铁、镁、磷、铜和硒等 16 种矿物质，硒含量为其他水果的 10 倍以上5-7。由于诺丽的高营养价值，早在 2010 年诺丽果浆被中华人民共和国卫生部列入了新资源食品名单，诺丽种植在我国海南省和云南省已具备一定规模3。通过追踪不同产地诺丽果关键发育期主要活性物质的动态变化，不仅为诺丽果原材料的实时采收、质量控制以及缩短诺丽产品生产成本与周期提供科学依据8，也可对不同成熟度诺丽果进行主要活性成分分析。国内最新报道了云南产诺丽果不同成熟度诺丽果中多糖、总黄酮、总酚、总蒽醌、莨菪亭、总皂苷、桃叶珊瑚苷、蛋白质含量测定的研究，结果表明成熟度与活性成分间具有一定的相关性8。国外也有较多关于诺丽果实及种子的种植、营养价值、药理活性及机制的研究9-11。通过查阅国内外文献，发现虽然有较多关于诺丽化学成分提取及其生物或药理活性的研究，但还未见有诺丽不同成熟度的蛋白提取及其指纹图谱的建立或其中功能蛋白发现分析的报道。作为一种有较高营养价值及药理活性的药食同源植物，研究其所含植物蛋白名称、发现与其药物活性相关的关键蛋白，对深度了解诺丽果实、指导育种、进一步开发诺丽果实均具有非常重要的理论和实际意义。本研究利用蛋白质组学的双向电泳技术12，获得海南不同成熟期的诺丽果蛋白图谱，并利用生物质谱及生物信息学技术，鉴定分析诺丽果关键发育期主要蛋白质的动态变化，为进一步深入研究和开发诺丽果提供科学合理的指导。1 材料与方法 1.1 材料 花蕾期、半成熟及成熟诺丽果果实样品，均采 集 于 海 南 海 口 东 山 镇 诺 丽 果 种 植 园（200245.97N，1101138.39E），经海南师范大学生命科学院的陈玉凯副教授鉴定确为花蕾期、半成熟及成熟诺丽果果实（图 1）。将采集回来的花蕾期、半成熟及成熟诺丽果样品用超纯水清洗干净，用锡箔纸包裹住放入保鲜袋中，于80 的冰箱中保存备用。图 1 诺丽果样品 Fig.1 Noni fruit sample 蛋白提取仪器及试剂：台式恒温振荡器（精宏）；QL-866 涡旋混合器；SIGMA3-18K 低温超速离心机（德国 SIGMA）；超纯水系统（上海和泰）；EYELA 摇床（东京理化）；蛋白质等电聚1350 热带作物学报 第 44 卷 焦仪（Ettan IPGphor3）,固相 pH 梯胶条（pH 310）；Image scanner III 扫描仪（美国通用公司GE Healthcare）；Image Master 5.0 凝胶图像分析软件；MultiTemp IV 恒温循环器；UV-2700 紫外分光光度计（日本岛津）；KQ2200E 型超声波清洗仪（曙峰企业）；GM-0.33A 型隔膜真空泵（津腾）；Voyager-DE PRO ABI4700 时间飞行质谱仪（美国 ABI 公司）。所有试剂均为国产分析纯试剂，所有实验用水为超纯水。1.2 方法 1.2.1 BPP+酚抽提法提取蛋白 （1）取出样品，切成小块，置于预冷的干净研钵中，加入少许 PVPP 粉末和少许二氧化硅粉末，在液氮环境中研磨到粉末状；称取 3 g 研磨好的样品粉末，加入至 10 mL 离心管中，再加入 10 mL BPP 提取缓冲液，充分涡旋震荡 10 min；再加入 10 mLTris饱和酚，涡旋 10 min；在 SIGMA3-18K 低温超速离心机中离心 15 min（4，转速：16000g）；移取上层清液转移至干净离心管中，加入 5 mL BPP 提取缓冲液，涡旋震荡 10 min 后离心 15 min；再移取 3 mL 上层清液转移至干净离心管中，加入 15 mL 预冷过饱和硫酸铵甲醇溶液（AM 沉淀剂），置于20 冰箱中沉淀 12 h 以上；从冰箱中取出离心管，用 AM 沉淀剂配平后离心 15 min弃上清液；每管再加入 2 mL 预冷甲醇，去上清液，涡旋均匀，重复 2 次；再分别加入 2 mL 预冷丙酮，重复 2 次转移及离心步骤；去除上清液，分别加入适量 DTT，混合均匀，按 10 mg/mL 加入适量裂解液，于 20 恒温溶解 2 h 以上；待蛋白完全溶解到裂解液后，离心，取上清液，测定蛋白浓度。（2）标准曲线法测定蛋白质含量。称取 1 mg牛血清蛋白充分溶解于 1 mL 超纯水中，配制成1 mg/mL 的标准牛血清蛋白储备液。分别准确量取 1 mg/mL 的标准牛血清蛋白储备液若干体积，用超纯水配制成 0、2、4、6、8、10 g/mL 的牛血清蛋白标准溶液。利用紫外分光光度计，测定在 595 nm 处的吸光度值，根据朗伯-比尔定律，以牛血清蛋白标准溶液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作标准曲线。1.2.2 蛋白质含量测定 采用 Bradford 法测定样品的蛋白浓度13，使用紫外分光光度计，在595 nm 的波长下测定花蕾期、半成熟及成熟诺丽果蛋白提取液的紫外吸光度值，根据标准曲线方程，计算样品中蛋白质的含量。1.2.3 单向电泳实验 根据吴秀丽等14的方法进行单向电泳实验，确定双向电泳的最佳上样浓度。1.2.4 双向电泳实验 移取含有1.3 mg蛋白质的提取液，用蛋白裂解液稀释至样品体积为 455 L，加 5 L IPG Buffer 于离心管中，轻轻震荡使其混合均匀，转移至 IPG 胶条（pH 310）上，20 恒温水化 18 h 以上；保持室温 20 左右，设置聚焦极限电流为每根胶条 50 A，电压参数如表 1所示，进行一向等电聚焦；再将胶条放置在摇床上平衡 15 min；在制备好的聚丙烯酰胺凝胶上进行二向垂直电泳操作，设置参数为：每张胶片 5 W进行预电泳 1 h，每张胶片 7 W 至电泳结束；再进行凝胶染色和脱色、凝胶扫描和用 Image Master 软件分析凝胶图谱14，筛选出高表达的蛋白并进行编号。表 1 等电聚焦参数 Tab.1 The parameters of isoelectric focusing 步骤 Procedure电压 Voltage/V花蕾期时间Time of bud stage/h 半成熟期时间 Time of half ripe stage/h 电压Voltage/V 成熟期时间Time of ripestage/h1 250 4 3 250 5 2 500 2 2 500 5 3 1000 1 1 10003 4 100080003 3 30002 5 8000 8 8 800014 6 1000 任意时间任意时间 1000任意时间 1.2.5 生物质谱鉴定及分析 挖取高表达蛋白质，分别用 150 L 超纯水、150 L 脱色液和 100 L 乙腈处理，放置在摇床上摇荡 30 min，转速设置为 150 r/min，摇荡后吸出离心管中的水，以上步骤重复 3 次，直至蛋白粒变为无色，置于室温下风干；将蛋白样品离心后加入适量胰蛋白酶，放置在 4 冰箱中 1 h 左右；再将其放置在 PCR 仪上酶解蛋白（37，13 h）；设置转速 7000g，离心 5 min（20），备用；利用 MALDI-TOF-MS进行蛋白鉴定；将所得的质谱数据通过 Mascot Distiller 软件进行分析，再利用 Matrix Science（http:/）网站进行搜库比对，确定蛋白的名称、种类及其他信息。第 7 期 邱 静等：海南不同成熟期诺丽果的蛋白鉴定及功能分析 1351 2 结果与分析 2.1 不同成熟期诺丽果蛋白提取 通过 Bradford 法测定 3 种诺丽果的蛋白浓度，在波长为 595 nm 处通过测定系列梯度浓度的标准牛血清蛋白溶液的吸光度值，建立标准曲线方程（未显示），计算得出花蕾期、半成熟及成熟诺丽果蛋白溶液的浓度分别为 6.808、11.30、5.89 mg/mL。为获得双向电泳合适的上样浓度，进行单向电泳实验，结果如图 2 所示。不同成熟期诺丽果的蛋白分子量介于 15130 kDa 之间，花蕾期的蛋白主要在 17、20、25 kDa 左右，半成熟期的蛋白主要在 17、20、33 kDa 左右，而成熟期的蛋白则主要集中在 15、20、25、33 kDa 左右。另外，从图 2 可以清晰看出样品的蛋白条带，说明不同成熟期诺丽果实蛋白质未降解，可以进行后续双向电泳实验操作。M：彩虹预染蛋白（10260 kDa）。M:Rainbow prestain protein(10-260 kDa).图 2 诺丽果蛋白单向电泳图 Fig.2 The unidirectional electrophoretograms of noni fruits 在优化实验条件下，通过双向电泳实验可以得到清晰明显、分离效果很好的蛋白凝胶图谱，再经 ImageMaster 软件分析在蛋白凝胶图谱上标记高表达的蛋白点。花蕾期、半成熟及成熟诺丽果实分别有 44、49 和 40 个高表达蛋白（图 3）。2.2 不同成熟期诺丽果蛋白质谱鉴定 将不同成熟期诺丽果中的若干高丰度蛋白质点，经过挖点、酶解和提取处理后，利用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）对其进行分析和鉴定，并设置参数以基质峰、酶自切峰进行校正，测定各蛋白肽段的质谱数据，再通过植物蛋白质数据库进行对比来确 图 3 诺丽果蛋白双向电泳图 Fig.3 The dimensional electrophoretograms of Noni fruits.定这些蛋白的名称、种类等信息，最终成功鉴定出花蕾期有 33 个蛋白点、半成熟期有 23 个蛋白点、成熟期有 39 个蛋白点，结果分别如表 2、表3 及表 4 所示。2.3 不同成熟期诺丽果蛋白功能分析 以上通过利用双向电泳实验和 MALDI-TOF-MS 生物质谱技术，对海南不同成熟期的诺丽果 1352 热带作物学报 第 44 卷 表 2 花蕾期蛋白质鉴定信息 Tab.2 The identifying information of bud stage 编号 No.蛋白名称 Protein name 等电点Isoelectric point 分子量 Molecular weight/Da得分 Score 覆盖率 Fraction of coverage/%物种名称 Species name 1 硫氧还蛋白 M2，叶绿体 9.35 20 300 49 9 拟南芥 2 驱动蛋白 KIN-12D 5.13 314 865 43 0 拟南芥 3 翻译因子 GUF1 同源物，叶绿体 5.05 66 940 37 1 绿色鞭毛藻 4 染色质重塑蛋白 At4g04260 6.51 27 105 39 4 拟南芥 5 果胶乙酰酯酶 10 9.07 46 532 48 5 拟南芥 6 可能的 E3 泛素蛋白连接酶 WAVH2 9.63 78 530 43 1 拟南芥 7 谷氨酸受体 2.8 6.45 107 121 40 1 拟南芥 8 枯草杆菌蛋白酶 SBT1.5 6.74 82 532 46 1 拟南芥 9 类成束蛋白的阿拉伯半乳聚糖蛋白 15 6.22 48 043 55 3 拟南芥 10 蛋白质单秆突变体 1 6.79 45 721 45 3 水稻亚种粳稻11 G 型凝集素 S 受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 At1g61490 7.20 89 877 37 1 拟南芥 12 转录终止因子 MTERF4，叶绿体 5.70 55 196 66 3 玉蜀黍 13 Dol-P-Man：Man（6）GlcNAc（2）-PP-Dol-1,2-甘露糖基转移酶8.96 65 041 53 2 拟南芥 14 木葡聚糖半乳糖基转移酶 XLT2 8.67 59 608 53 3 拟南芥 15 Squamosa 启动子结合样蛋白 10 9.15 44 263 64 4 水稻亚种籼稻16 赖氨酸特异性脱甲基酶 JMJ703 7.81 137 295 48 0 水稻亚种粳稻17 推定的 F-box 蛋白 At2g33190 5.86 43 955 42 3 拟南芥 18 可能的抗病蛋白 RPP1 6.34 136 045 41 1 拟南芥 19 乙烯反应性转录因子 ERF027 5.12 20 757 48 6 拟南芥 20 E3 泛素蛋白连接酶 ATL15 6.04 42 199 44 3 拟南芥 21 肉桂醇脱氢酶 1 5.93 38 487 46 4 水稻亚种粳稻22 阳离子过氧化物酶 3 的蛋白过表达 4.77 39 088 60 5 拟南芥 23 根向光蛋白 2 7.49 65 813 57 2 拟南芥 24 生物素蛋白连接酶 2 6.02 37 129 49 3 拟南芥 25 咖啡酸 3-O-甲基转移酶 2 5.83 39 587 54 3 罗勒 26 转录因子 BHLH094 6.80 27 567 47 6 水稻亚种粳稻27 可能的转录因子 MYB58 7.68 37 087 56 4 水稻亚种粳稻28 硫氧还蛋白样蛋白 CXXS1 5.28 13 326 70 9 拟南芥 29 生物素蛋白连接酶 2 6.02 37 129 41 3 拟南芥 30 50S 核糖体蛋白 L16，叶绿体 11.66 15 261 47 8 天竺葵 31 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 SRK2C 5.37 38 225 42 3 拟南芥 32 富含甘氨酸的结构域蛋白 1 6.62 89 430 44 2 拟南芥 33 泛素 6.56 8 520 276 38 燕麦 表 3 半成熟期蛋白质鉴定信息 Tab.3 The identifying information of half ripe stage 编号 No.蛋白名称 Protein name 等电点 Isoelectric point 分子量 Molecular weight/Da 得分 Score 覆盖率 Fraction of coverage/%物种名称 Species name1 吲哚-3-乙醛氧化酶 6.02 14 9459 67 1 拟南芥 2 蛋白短梗 2 5.71 41 837 59 4 拟南芥 3 蛋白短梗 2 5.71 41 837 59 4 拟南芥 7 E3 泛素蛋白连接酶 BRE1 样 1 8.14 100 336 36 1 水稻亚种籼稻8 鳞片启动子结合样蛋白 10 9.15 44 263 45 2 水稻亚种 10 半胱氨酸蛋白酶 3 8.59 38 920 58 5 番茄茄 第 7 期 邱 静等：海南不同成熟期诺丽果的蛋白鉴定及功能分析 1353 续表 3 半成熟期蛋白质鉴定信息 Tab.3 The identifying information of half ripe stage(continued)编号 No.蛋白名称 Protein name 等电点 Isoelectric point 分子量 Molecular weight/Da 得分 Score 覆盖率 Fraction of coverage/%物种名称 Species name11 CASP 样蛋白 4A2 11.25 33 085 76 7 水稻亚种粳稻13-22 半胱氨酸蛋白酶 3 8.59 38 920 58 5 番茄 31 光敏色素 5.63 125 986 60 1 挪威云杉 33 蛋白质 Ycf2 9.07 273 406 62 0 松叶蕨 34 硫氧还蛋白样蛋白 CXXS1 5.28 13 326 70 9 拟南芥 35 DNA 定向 RNA 聚合酶 亚单位 6.23 39 395 59 4 毛茛属植物 36 线粒体输入受体亚单位 TOM20-3 4.94 22 551 43 9 拟南芥 37 含五三肽重复序列的蛋白质 At5g04810，叶绿体 6.71 106 671 76 2 拟南芥 41 可能的 LRR 受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 At1g53430 5.63 114 873 39 0 拟南芥 42（-）-异戊醇/（-）-卡维素脱氢酶，线粒体 6.99 27 174 53 4 洋薄荷 43 非生氰-葡萄糖苷酶 5.85 55 925 59 3 白三叶草 44 尿卟啉原合酶，叶绿体 8.84 32 103 52 3 水稻亚种粳稻45 14-3-3 样蛋白 GF14 4.83 30 526 51 7 拟南芥 46 真核翻译起始因子 4B2 8.69 59 289 64 3 拟南芥 47 含 B3 结构域的蛋白质 REM9 5.98 51 425 74 3 拟南芥 49 核酮糖二磷酸羧化酶大链（片段）6.34 48 828 55 4 毛核木雪果 表 4 成熟期蛋白质鉴定信息 Tab.4 The identifying information of ripe stage 编号 No.蛋白名称 Protein name 等电点 Isoelectric point分子量 Molecular weight/Da得分 Score 覆盖率 Fraction of coverage/%物种名称 Species name1 推定 pumilio 蛋白同系物 25 9.00 15 788 60 11 拟南芥 2 9 号因子蛋白质，线粒体 OS 9.09 45 180 57 3 拟南芥 3 DNA 引导的 RNA 聚合酶亚基 OS 8.85 11 921955 1 环脊双星藻 4 染色体蛋白 5 OS 的结构维持 6.52 12 136554 1 拟南芥 5 蛋白质短梗 2 型 5.71 41 837 49 4 拟南芥 6 丙氨酸-tRNA 连接酶，叶绿体/线粒体 OS 5.09 96 418 56 1 绿色鞭毛藻CCE9901 7（S）-2-羟酸氧化酶 GLO1 OS 9.16 40 316 54 3 拟南芥 8 肽-N4-（N-乙酰基-氨基葡萄糖）天冬酰胺酰胺酶 AOS8.61 64 440 52 2 巴旦杏巴旦杏 9 岩藻糖转移酶 23os 9.24 50 616 48 2 拟南芥 10 钙依赖性蛋白激酶 31 OS 5.99 54 662 44 2 拟南芥 11 番茄红素 环化酶，叶绿体 OS 5.71 58 454 61 2 拟南芥 12 钙依赖性蛋白激酶 31 OS 5.99 54 662 50 2 拟南芥 13 开花时间控制蛋白 FCA OS 9.00 79 541 43 2 水稻籼稻组 14 香叶基香叶基转移酶 2 亚基 1os 5.35 35 473 47 4 拟南芥 15 可能的受体样蛋白激酶 At1g49730 OS 8.36 72 896 36 1 拟南芥 16 豆球蛋白类 B 型 OS 5.87 54 415 48 2 蚕豆 17 转录终止因子 MTERF4，叶绿体 OS 5.70 55 196 66 3 玉米 18 蛋白质 Ycf2 OS 9.07 273 406 57 0 松叶蕨 19 抗病蛋白 Pik-1 OS 5.94 126 720 63 1 水稻亚种粳稻组20 乙酰乳酸合酶小亚基 1，叶绿体 OS 6.78 52 298 67 3 拟南芥 21 受体样蛋白 26 OS 5.50 89 061 51 1 拟南芥 1354 热带作物学报 第 44 卷 续表 4 成熟期蛋白质鉴定信息 Tab.4 The identifying information of ripe stage(continued)编号 No.蛋白名称 Protein name 等电点 Isoelectric point分子量 Molecular weight/Da 得分Score覆盖率 Fraction of coverage/%物种名称 Species name 22 NADH 脱氢酶泛醌1 亚基复合物 8-b os 7.51 11 960 79 20 拟南芥 23 可能的醛氧化酶 4 OS 6.32 91 313 40 2 水稻亚种粳稻组24 驱动蛋白样蛋白 KIN-14L OS 9.11 106 943 52 1 拟南芥 25 生长素反应因子 3 OS 8.16 79 533 54 1 水稻亚种粳稻组26 Remorin 蛋白 OS 6.15 21 756 39 5 马铃薯 27 生长素反应因子 3 OS 8.16 79 533 56 1 水稻亚种粳稻组28 tRNAse Z TRZ4，线粒体 OS 8.04 104 660 60 2 拟南芥 29 半胱氨酸蛋白酶 3 OS 8.59 38 920 60 5 番茄 30 胼胝质合酶 9 OS 8.71 216 949 41 0 拟南芥 31 解旋酶蛋白 MOM1 OS 5.24 218 433 57 0 拟南芥 32 胚胎蛋白 DC-8 OS 5.77 60 223 52 2 胡萝卜 33 3-乙酸吲哚-葡萄糖基转移酶 OS 5.75 49 679 45 2 玉米 34 推定的 F-box 蛋白 At3g22710OS 8.69 38 911 54 3 拟南芥 35 ATP 合酶亚基，叶绿体 OS 5.48 54 999 65 2 猪鬃草 36 果胶酯酶抑制剂 8 OS 5.67 18 955 70 5 水稻亚种粳稻组37 酰基脂质（8-3）-去饱和酶 OS 7.10 54 232 53 3 小立碗藓 38 25S rRNA（胞嘧啶-C（5）-甲基转移酶 NOP2A OS4.99 76 729 55 2 拟南芥 39 bZIP 转录因子 17 OS 5.96 78 389 67 2 拟南芥 实中植物蛋白的提取和鉴定实验，成功匹配了花蕾期、半成熟及成熟诺丽果实分别有 44、49 和40 个高表达蛋白，通过质谱鉴定，相应确定了分别有 33、49 及 39 个蛋白，从属不同植物功能的蛋白种类，对这些差异表达的蛋白进行了简单的生物学功能分析，详见表 5表 7。花蕾期和半成熟期相同的蛋白有：硫氧还蛋白、驱动蛋白、叶绿体、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、蛋白连接酶、Squamosa 启动子结合样蛋白、转录因子；花蕾期和成熟期相同的蛋白有：转移酶、可能的抗病蛋白、F-box 蛋白；半成熟期和成熟期相同的蛋白有：蛋白短梗、半胱氨酸蛋白酶、转移酶、叶绿体、蛋白质 Ycf2。3 讨论 诺丽果不同成熟期的蛋白相差较大，表现在众多的生长、发育及遗传功能方面。花蕾期的 23号根向光蛋白与半成熟期的 31 号光敏色素均与植物的光感应相关，由于开花是植物从营养生长到生殖生长的一个重要转折点，直接影响着种子植物生育期的早晚、授粉及种子发育的最佳时期，这暗示不仅可通过人为调节光的某些特性来调控花蕾期诺丽果的根向光蛋白，从而促使花蕾期诺丽果尽快开花，也可从不同成熟的诺丽果提取根向光蛋白并用于科学培植诺丽果91。此外，发现花蕾期的 8 号蛋白枯草杆菌蛋白酶92、18 号蛋白可能的抗病蛋白 RPP193与成熟期的 19 号抗病蛋白 Pik-194，均与植物抵抗病菌相关，也表明这 3种抗病蛋白可有望开发为高效、低毒的生物农药。本研究发现部分蛋白与动物体内的蛋白相同，具有不同的生物学或药学功能，如花蕾期的1、28 号蛋白和半成熟期的 34 为硫氧还原蛋白，作为一种小的热稳定酸性蛋白，是细胞中重要的氧化还原蛋白，具有调节细胞抗氧化、抗胁迫、细胞凋亡、DNA 结合转录因子活性等功能，说明在诺丽果花蕾期到半成熟期的发育过程中，可能在抗氧化应激、阻止线粒体介导的细胞死亡、调节某些基因的表达等方面起关键作用15；作为人体重要的内源性抗氧化系统之一，硫氧还原蛋白被研究证明具有出色的抗氧化活性或调节众多细胞生存相关信号通路，从而抵抗活性氧损伤95。花蕾期的 2 号、成熟期的 24 号蛋白为驱动蛋白，作为一类重要的微管调节蛋白，可能在诺丽果的神经元的发育、纺锤体的组装和染色体的分离过程 第 7 期 邱 静等：海南不同成熟期诺丽果的蛋白鉴定及功能分析 1355 表 5 花蕾期诺丽果主要蛋白功能分析 Tab.5 The functional analysis of main proteins of bud stage 编号 No.蛋白质名称 Protein name 生物学作用 Biological function 1、28 硫氧还蛋白 M2，叶绿体 具有调节细胞抗氧化、抗胁迫、细胞凋亡、DNA 结合转录因子活性等功能15 2 驱动蛋白 在神经元的发育、纺锤体的组装和染色体的分离过程中起着重要的作用16 3、12、30 叶绿体 编号 3 为对肽链合成的起始、延伸和终止有重要作用的蛋白质因子17-18。编号 12 为定位叶绿体的 mTERF 蛋白，广泛参与到拟南芥逆境响应及叶绿体基因的转录及转录后加工的各个过程19。编号 30 与植物生长素系统之间存在相互协调机制，生长素信号可能在核糖体应激通路中发挥重要作用20 4 染色质重塑蛋白 染色质重塑蛋白通过调控基因组稳定性和基因表达影响细胞生长与发育，具有激活或抑制转录因子转录的双重活性作用21 5 果胶乙酰酯酶 参与植物生长发育繁殖过程、果实硬度变化及植物防御生物和非生物胁迫；参与植物细胞壁对重金属等的富集和解毒22 6、20、24、2，蛋白连接酶 编号 6 及 20 蛋白为 E3 泛素蛋白连接酶，其广泛参与细胞内的代谢过程23。编号 24 及 29蛋白为生物素蛋白连接酶，通过调节微生物的乙酰辅酶 A 羧化酶和丙酮酸羧化酶，控制重要代谢途径的关键反应24 7 谷氨酸受体 在调控植物信号转导、在抵御非生物胁迫如干旱、低温、盐胁迫等以及生物胁迫如真菌、细菌、线虫侵染的过程中发挥着重要的作用25 8 枯草杆菌蛋白酶 可调控植物发育，在许多植物应对环境胁迫和病菌侵染过程中发挥重要作用26 9 类成束蛋白阿拉伯半乳聚糖 蛋白 15 能够促进根和花粉管的伸长；某些在植物激素存在的情况下其表达量快速下调；可能在细胞伸长、细胞粘连和次生壁成熟的过程中起作用27 10 蛋白质单秆突变体 表达与否直接决定水稻能不能分蘖，表达量的高低也在一定程度上决定分蘖数目的多少，而且 MOC1 突变还会影响花序的分枝状况28 11、31 蛋白激酶 在不同植物中参与调节酵母盐胁迫适应、构成 Ca2+结合蛋白、对植物激素 ABA 的耐受性、响应冷胁迫等多种植物逆境胁迫过程中起到重要作用29 13、14、25 转移酶 编号 13 为甘露糖基转移酶，其功能表现在酿酒酵母缺失复合酶后，导致菌体出现不同程度的缺陷表型，包括细胞骨架起始或延长受阻、生长减慢、细胞周期停滞、细胞壁结构脆弱、对杀菌剂和渗透胁迫敏感性增加30。编号 14 对细胞壁的结构组织和生长发育具有重要的调控作用；在维持细胞壁结构和拉伸强度中具有重要作用31 15 Squamosa 启动子结合样蛋白 在植物的胚胎、芽、叶片、花、果实等器官生长发育过程中起着重要作用32 16 赖氨酸特异性脱甲基酶 非组蛋白赖氨酸特异性脱甲基酶，在调控众多细胞过程中起非常关键的作用，比如可影响干细胞在自我恢复和发挥多潜能的过程中调控其形态等33 17 F-box 蛋白 植物中的 F-box 蛋白参与许多信号传导体系，在信号通路中起着非常重要的作用34 18 可能的抗病蛋白 能够特异地识别病原微生物分泌的效应蛋白,触发免疫响应以对抗病原微生物的侵扰35 19、26、27、12 转录因子 编号 19 为乙烯反应性转录因子，参与植物发育、植物应答逆境胁迫应答过程、与乙烯反应或盐反应过程，能调控植物耐盐性36。编号 26 及 27 为植物中的两种重要转录因子，参与调控植物生长发育、生理代谢和响应逆境等37-38 21 肉桂醇脱氢酶 在