海鲈鱼酸性磷酸酶分离纯化及其抑制剂虚拟筛选.pdf

第 41 卷 第 5 期2023 年 9 月食 品 科 学 技 术 学 报Journal of Food Science and TechnologyVol.41 No.5Sep.2023doi:10.12301/spxb202201012文章编号:2095鄄6002(2023)05鄄0144鄄09引用格式:李园园,魏天雨,丁悦艳,等.海鲈鱼酸性磷酸酶分离纯化及其抑制剂虚拟筛选J.食品科学技术学报,2023,41(5):144-152.LI Yuanyuan,WEI Tianyu,DING Yueyan,et al.Isolation and purification of acid phosphatase from Lateolabrax maculatusand virtual screening of inhibitorsJ.Journal of Food Science and Technology,2023,41(5):144-152.海鲈鱼酸性磷酸酶分离纯化及其抑制剂虚拟筛选李园园,摇 魏天雨,摇 丁悦艳,摇 李红燃,摇 师丹华,摇 李颖畅*,摇 李学鹏*(渤海大学 食品科学与工程学院/生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁 锦州摇 121013)摘摇 要:为延缓海水鱼类肌苷酸降解,保留鱼类本身的鲜味成分,以新鲜的海鲈鱼为研究对象,经NaAc-HAc 缓冲液(pH 值为 5郾 0)提取,饱和硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱和葡聚糖凝胶柱分离纯化后,研究海鲈鱼肝中酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)的酶学特性,采用虚拟筛选和分子对接技术筛选潜在的天然 ACP 抑制剂。结果表明:分离纯化出 ACP I 和 ACP 域 2 种同工酶;ACP I的比活力为6郾 57 U/mg,纯化了 36郾 50 倍,回收率为 9郾 96%;ACP 域的比活力为 4郾 62 U/mg,纯化了25郾 69 倍,回收率为 6郾 07%。对回收率和纯化倍数相对较高的 ACP I 进一步研究,发现其 Km为3郾 174 mmol/L,vmax为 0郾 982 滋mol/(L min)。ACP I 最适温度为 30 益,最适 pH 值为 5郾 0。ACP I 的二级结构中 琢鄄螺旋含量为 14郾 10%,茁鄄折叠含量为 35郾 90%,茁鄄转角含量为 18郾 20%,无规则卷曲含量为 32郾 60%。虚拟筛选出 5 个多酚类化合物可作为 ACP 抑制剂,与 ACP 相互作用方式主要是氢键和疏水作用。在一定浓度范围内(0 1 mmol/L),5 个多酚类化合物均能有效抑制 ACP 活性,浓度越大抑制效果越好。研究旨在为贮藏过程中水产品的风味和品质控制提供理论依据。关键词:海鲈鱼;酸性磷酸酶;分离纯化;圆二色谱;虚拟筛选;多酚化合物中图分类号:TS254郾 4摇 摇 摇 摇 摇 文献标志码:A收稿日期:20221104基金项目:渤海大学海洋研究院课题资助项目(BDHYYJY2022001)。Foundation:Institute Project of Ocean Research of Bohai University(BDHYYJY2022001).第一作者:李园园,女,硕士研究生,研究方向为水产品加工及贮藏。摇*通信作者:李颖畅,女,教授,博士,主要从事水产品加工及贮藏方面的研究;李学鹏,男,教授,博士,主要从事水产品加工及贮藏方面的研究。摇 摇 海鲈鱼(Lateolabrax maculatus)是常见的海洋经济鱼类之一,因味道鲜美、营养价值高而深受国内消费者喜爱1。由于海鲈鱼富含多不饱和脂肪酸和各种氨基酸,在贮藏期间极易腐烂变质,严重影响其风味。酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP,E.C.3.1.3.2)存在于细胞溶酶体中,是参与风味物质肌苷酸(inosine 5忆鄄monophosphate,IMP)降解的关键酶2。它催化 IMP 降解,产生次黄嘌呤核苷(hypo鄄xanthine riboside,HxR)和次黄嘌呤(hypoxanthine,Hx)3,使鱼类产生不愉快的气味和味道,降低鱼肉食用价值4。已有学者从麦瑞加拉鲮鱼5、鲫鱼6、珠贝母7、海参8中分离纯化出了不同分子质量(几十至几百 kDa)的 ACP,其米氏常数(Km)、酶最适反应条件各不相同。研究表明,不同水产品中分离得到的 ACP 结构和特性存在差异。因此,本研究以海鲈鱼为原料分离纯化 ACP 并对其酶学性质进行研究。虚拟筛选技术是在生物原有结构的基础上发现新配体的过程,也是从大量的化合物中筛选潜在活性化合物的过程9。尚随锦等10基于药效团虚拟441筛选和数据挖掘技术,筛选天然黄嘌呤氧化酶抑制剂,共得到 102 个天然化合物。马青云等11运用计算机虚拟筛选技术寻找新型冠状病毒水解酶的中药小分子抑制剂,共获得 66 个化合物。唐彪等12基于 Discovery Studio 2郾 5 平台筛选出转化生长因子鄄茁1 蛋白抑制剂,成功从黄芪、丹参、三七中筛选出 4种与 TGF鄄茁1 结合良好的天然化合物。然而,虚拟筛选技术用于寻找 ACP 抑制剂的研究鲜有报道。本研究以海鲈鱼肝为对象,通过饱和硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱和葡聚糖凝胶柱层析分离纯化ACP,并探究纯化后 ACP 酶学特性,最后利用 DiscoveryStudio 4郾5 平台分子对接技术筛选出潜在抑制剂并探究其对酶活性的影响,旨在为进一步研究酶结构与功能,探究抑制剂对 ACP 的抑制机理提供理论依据。1摇 材料与方法1郾 1摇 材料与试剂新鲜海鲈鱼,辽宁省锦州市林西水产市场;聚乙二醇(聚合度20000)、儿茶素(纯度逸97%)、表没食子儿茶素(EGC,纯度逸97%)、没食子酸(GA,纯度逸97%)、表 儿 茶 素 没 食 子 酸 酯(ECG,纯 度 逸97%)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG,纯度逸97%),上 海 源 叶 生 物 科 技 有 限 公 司;Tris鄄HCl、NaAc鄄HAc(纯度逸99%)、对硝基苯磷酸钠(p鄄NPP,纯度逸97%)、对硝基苯酚(p鄄NP,纯度逸97%),上海麦克林生化科技有限公司;总蛋白浓度考马斯亮蓝试剂盒,南京建成有限公司。其他试剂均为分析纯。1郾 2摇 仪器与设备S18-A928 型绞肉机,山东九阳股份有限公司;SORVALL Stratos 型冷冻高速离心机,美国 Thermo公司;UV-2550 型紫外-可见分光光度仪,苏州岛津仪器有限公司;YC-2 型层析柜,上海嘉鹏科技有限公司;HL-2S 型数显恒流泵、BS-160 型自动部分收集器,上海沪西分析仪器厂;DEAE-Sepharose 型阴离子交换柱,美国 Sigma 公司;Sephadex G-200 型葡聚糖凝胶柱,美国 Bioruler 公司。1郾 3摇 实验方法1郾 3郾 1摇 ACP 粗酶提取和酶活力测定新鲜海鲈鱼,体质量(1郾 84 依 0郾 26)kg,体长(39郾 78 依4郾 67)cm。将鱼敲头致死,取肝脏(35 依0郾 3)g,-80 益保存,4 益解冻 30 min 放入预冷的绞肉机中,绞碎 30 s,加入 20 mmol/L NaAc鄄HAc 缓冲液(5 mmol/L 茁鄄巯基乙醇和 20 g/L 甘油,pH 值5郾 0),料液比(g/L)1颐 3,在 4 益 层析柜中磁力搅拌1 h,5 000 r/min 离心 30 min,提取的上清液即为粗酶液6。ACP 酶活力测定参考 Zhu 等8的方法,将0郾 5 mL 粗酶液与 3 mL 20 mmol/L 的 NaAc鄄HAc 缓冲液(5 mmol/L 茁鄄巯基乙醇,pH 值 5郾 0)混合,再加入0郾 5 mL 12 mmol/L p鄄NPP。将混合物在37 益预热15 min,并通过添加 0郾 5 mL 0郾 1 mol/L NaOH 终止反应。405 nm 处测量吸光度,计算释放 p鄄NP 的量。酶活力定义为在该分析条件下 1 min 产生 1 nmol/LP鄄NP 所需的酶量。总蛋白质含量采用考马斯亮蓝试剂盒测定。1郾 3郾 2摇 ACP 的分离纯化1郾 3郾 2郾 1摇 硫酸铵分级沉淀参考 Zhu 等8方法,并略加修改。在粗酶液中缓慢加入饱和硫酸铵溶液(质量分数 25%)后,磁力搅拌 1 h,4 益离心 30 min(5 000 r/min),弃沉淀取上清液。上清液中再加入饱和硫酸铵溶液(质量分数 75%),磁力搅拌 1 h,4 益 离心 30 min(5 000r/min),弃去上清液,用 20 mmol/L NaAc鄄HAc 缓冲液(5 mmol/L 茁鄄巯基乙醇,pH 值 5郾 0)溶解沉淀后,4 益透析 24 h,以除尽 SO2-4,然后 4 益 离心 30 min(5 000 r/min)。采用 1郾 3郾 1 节方法检测酶活力和总蛋白质含量,然后用聚乙二醇浓缩,每管 10 mL 分装后保存于-80 益备用。纯化倍数和回收率计算见式(1)、式(2)。纯化倍数=纯化后的比活力粗酶的比活力摇;(1)回收率=纯化后的酶活力粗酶的酶活力伊100%摇。(2)1郾 3郾 2郾 2摇 阴离子柱纯化阴离子层析柱(1郾 6 cm 伊 20 cm)用 20 mmol/LNaAc鄄HAc 缓冲液(5 mmol/L 茁鄄巯基乙醇,pH 值5郾 0)平衡后,取 10 mL 酶液上样,用不同浓度的NaCl(0、0郾 1、0郾 2、0郾 3、0郾 4、0郾 5 mol/L)进行线性梯度洗脱,流速为 0郾 5 mL/min,每管收集 5 mL。收集蛋白质含量和酶活力均较高的酶液,透析浓缩,-80 益保存,用于后续进一步纯化。酶活力和总蛋白质含量测定方法同 1郾 3郾 1 节。1郾 3郾 2郾 3摇 葡聚糖凝胶柱纯化葡聚 糖 凝 胶 层 析 柱(1郾 6 cm 伊 80 cm)用20 mmol/L NaAc鄄HAc 缓冲液(5 mmol/L 茁鄄巯基乙醇,pH 值 5郾 0)进 行 平 衡 和 洗 脱,流 速 为0郾 3 mL/min,每管收集 5 mL 酶液,收集蛋白质含量541第 41 卷 第 5 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李园园等:海鲈鱼酸性磷酸酶分离纯化及其抑制剂虚拟筛选和酶活力均高的酶液,将酶液浓缩后置于-80 益保存备 用。酶 活 力 和 总 蛋 白 质 含 量 测 定 方 法 同1郾 3郾 1 节。1郾 3郾 2郾 4摇 ACP 分子质量测定参考 Siddiqua 等5方法并略做修改,分离胶的质量分数为 12%,浓缩胶的质量分数为 5%,纯化后的 ACP 蛋白质量浓度为 1 mg/mL,按照体积比 1颐 4加入 5 伊 上样缓冲液,混匀后煮沸 5 min,上样量为10 滋L。电泳仪初始电压为 80 V,40 min 后调为 120V,保持40 min后关闭电源。考马斯亮蓝染色液对凝胶染色 30 min,脱色 12 h,观察结果。1郾 3郾 3摇 ACP 最适温度和 pH 值测定在 20 90 益以 10 益的间隔测定酶活力,确定了 ACP 的最适温度和热稳定性。在 pH 值 3郾 0 8郾 0 的反应液中测定酶活力,酶活力测定方法同1郾 3郾 1 节。1郾 3郾 4摇 酶解动力学参数分析动力学参数参考 Siddiqua 等5的方法,略作修改。将纯化后的 ACP 与不同浓度的底物 P鄄NPP(0郾 1 0郾 5 mmol/L)等体积混合,黑暗条件下 30 益反应 15 min,加入 1 mL 0郾 1 mol/L NaOH 终止反应,室温静置 10 min 后测定 405 nm 处吸光度。采用Line鄄weaver-Burk 双倒数绘图法计算 Km和 vmax,见式(3)、式(4)。v=vmaxSS+Km摇;(3)1v=Kmvmax伊1S+1vmax摇。(4)式(3)、式(4)中,v、vmax分别为反应速率和反应最大速率,滋mol/(L min),Km为米氏常数,mmol/L,S为 p鄄NPP 的浓度,mmol/L。1郾 3郾 5摇 ACP 二级结构测定圆二色谱测定参考 Moradi 等13方法,并略作修改。ACP 的蛋白质质量浓度为 0郾 3 mg/mL,在60 nm/min的扫描速度下,测定 190 250 nm ACP 的圆二色谱,以 20 mmol/L NaAc鄄HAc 缓冲液(5 mmol/L茁鄄巯基乙醇,pH 值 5郾 0)为空白对照,并计算样品二级结构的含量。1郾 3郾 6摇 基于分子对接的抑制剂虚拟筛选参考李颖畅等14方法。ACP 的晶体结构从PDB 数据库(http:椅www.rcsb.org/pdb)下载并保存为 pdb 格式,利用 PyMol 软件对 ACP 进行去水、加氢和能量最小化,从 PubChem 数据库(https:椅pub鄄chem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取小分子的 2D 结构,用 CHem3D 软件对小分子进行能量最小化,最后采用 Discovery Studio 4郾 5 的 LibDock 和 CDOCKER 程序对其进行筛选。筛选过程如下:首先采用 Lib鄄Dock 筛选方法与 ACP 进行对接,然后选取对接得分大于 100 的小分子,最后使用 CDOCKER 程序将小分子与 ACP 进行分子对接并处理对接结果。对接参数:活性位点半径 20 魡,活性位点 XYZ 位置(34郾 85,76郾 23,83郾 57),运行次数 10 次。1郾 3郾 7摇 抑制剂抑制效果分析取一定量的筛选出的小分子物质溶液,加入ACP 酶液 1 mL(酶活力 600 U/mL,蛋白质质量浓度为 1郾 4 mg/mL),用 20 mmol/L NaAc鄄HAc 缓冲液(5 mmol/L 茁鄄巯基乙醇,pH 值 5郾 0)稀释。将小分子物质与 ACP 混合物混匀,4 益黑暗中反应 15 min。酶活力和蛋白质含量测定方法同 1郾 3郾 1 节。1郾 4摇 数据处理采用SPSS 26 进行统计学分析,Origin 2019 软件绘图,所有实验平行重复3 次,结果均以平均值 依标准偏差表示,单因素方差分析差异显著性(P 0郾05)。2摇 结果与分析2郾 1摇 海鲈鱼肝 ACP 分离纯化结果分离纯化后海鲈鱼肝 ACP 酶活力和总蛋白质变化见表 1。由表 1 可看出,粗酶的比活力为0郾 18 U/mg,经饱和硫酸铵溶液沉淀后该酶纯化了5郾 94 倍,回收率为 63郾 38%。ACP 分离纯化过程见图 1。将透析浓缩后的粗酶液上样置于阴离子交换柱,进行钠盐梯度洗脱后的结果见图 1(a)。由图 1(a)可知,该酶有 2 个不同的峰,故推测该酶可能存在同工酶,命名为 ACP I 和 ACP 域,且 ACP 玉含量高。该研究结果与杨立红等15结果类似,其研究表明刺参内脏中 ACP 经过分离纯化后有 3 个不同的峰,即在刺参 ACP 中存在 3 个同工酶。经 DEAE-Sepharose 层析柱纯化后 ACP I 和 ACP 域的比活力为 3郾 02、4郾 86 U/mg,分别纯化了 16郾 83、14郾 33 倍,回收率分别为 43郾 07%和 50郾 24%。将浓缩后的 2种酶液分别加到葡聚糖凝胶柱中,经20 mmol/LNaAc鄄HAc 缓冲液洗脱,分别得到 2 个单一的峰图1(b)、(c)。酶液经 Sephadex G-200 凝胶柱过滤后,ACP I 和 ACP 域比活力分别增加至 6郾 57、4郾 62U/mg,分别纯化了 36郾 50、25郾 67 倍,回收率分别达641食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 9 月到 9郾 96%和 6郾 07%。由于分离纯化的 ACP I 回收率和纯化倍数相对较高,后续研究均使用 ACP I。SDS-PAGE 结果如图 1(d)。条带 1 表示粗酶,经分离纯化后,条带2 和3 均呈单一条带,表明 ACP I达到一定纯度,且分子质量约45 kDa。该研究结果与高举等6研究鲫鱼中 ACP 类似,鲫鱼 ACP 分子质量为33郾 3 kDa;Siddiqua 等5研究麦瑞加拉鲮鱼(淡水鱼类)ACP,其分子质量分别为18、100、130 kDa。ACP不同的原因可能是鱼类种类不同,生活环境不同,与淡水鱼相比,海鲈鱼生活水温接近室温,盐度稍高。表 1摇 海鲈鱼肝 ACP 纯化倍数及回收率Tab.1摇 Purification time of original activity and recovery of ACP from sea bass liver纯化步骤总酶活力/Um(总蛋白质)/mg比活力/(U mg-1)纯化倍数/倍回收率/%粗酶液614郾 12 依0郾 84a3 411郾 78 依15郾 54a0郾 181郾 00100郾 00质量分数 25%硫酸铵沉淀486郾 19 依2郾 42b3 864郾 92 依77郾 48b0郾 130郾 7279郾 17质量分数 75%硫酸铵沉淀389郾 25 依1郾 45c364郾 35 依10郾 79c1郾 075郾 9463郾 38DEAE-SepharoseACP I264郾 49 依2郾 60d87郾 44 依1郾 81d3郾 0216郾 8343郾 07ACP 域308郾 54 依0郾 75e63郾 49 依2郾 96e4郾 8614郾 3350郾 24Sephadex G-200ACP I61郾 16 依0郾 82f9郾 31 依0郾 05f6郾 5736郾 509郾 96ACP 域37郾 27 依0郾 79g8郾 06 依0郾 09g4郾 6225郾 676郾 07摇 摇 不同小写字母表示同列数据差异显著(P 0郾 05)。图 1摇 海鲈鱼肝 ACP 的分离纯化过程Fig.1摇 Isolation and purification process of ACP from sea bass liver2郾 2摇 海鲈鱼 ACP I 最适温度和 pH 值分析纯化后 ACP I 在不同温度和 pH 值时的活力变化见图 2。由图 2(a)可知,海鲈鱼肝 ACP I 在30 益时显示出最高的催化活性,20 40 益 保持超过 80%的活力,超过40 益后ACP I 活力显著降低且酶的热稳定性也急剧下降(P 0郾 05),并在 70益时几乎完全失活。这一结果与刺参 ACP 活力的研究结果基本一致15。Kuda 等16研究发现,鲭鱼 ACP 在 55 益 加热 10 min 后,其活力降低至10%。ACP I 最适温度为 30 益,这个结果低于麦741第 41 卷 第 5 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李园园等:海鲈鱼酸性磷酸酶分离纯化及其抑制剂虚拟筛选瑞加拉鲮鱼肝中 ACP 的最适温度(40 益)5和草鱼肝脏中 ACP 的最适温度(45 益)17。由图 2(b)可知,海鲈鱼肝 ACP I 最适 pH 值为 5郾 0,随着 pH值升高,酶活力显著降低(P 0郾 05)。王彩霞等18研究了草鱼、鱼、鳝鱼 3 种淡水鱼中 ACP最适 pH 值分别为 5郾 0、5郾 8 和 5郾 6,而陈素丽等19结果表明文昌鱼 ACP 的最适 pH 值为 4郾 5。本研究中 ACP I 最适温度和最适 pH 值结果与文献结果存在一定差异,原因是鱼的种类不同或鱼的生活环境不同。图 2摇温度和 pH 值对海鲈鱼肝 ACP 活力的影响Fig.2摇 Effects of temperature and pH on ACP activity from sea bass liver2郾 3摇 ACP I 的动力学特性分析ACP I 的动力学参数如图3,底物为P鄄NPP 时,ACP的 Km为 0郾098 mmol/L,vmax为 1郾07 滋mol/(Lmin)。Siddiqua 等5研究表明,麦瑞加拉鲮鱼肝中 ACP 对底物 P鄄NPP 的 Km为 0郾25 mmol/L,vmax为 1郾10 滋mol/(L min)。可能因为 ACP 来自不同类型鱼类的鱼肝,酶的动力学特性存在一定差异。图 3摇 海鲈鱼肝 ACP I 的酶动力学参数Fig.3摇 Dynamic characteristics of ACP I from sea bass liver2郾 4摇 海鲈鱼 ACP I 二级结构分析圆二色谱可以反映蛋白质二级结构20。海鲈鱼肝 ACP I 二级结构中,琢鄄螺旋的含量为 14郾 10%,茁鄄折叠的含量为 35郾 90%,茁鄄转角和无规则卷曲的含量分别为 18郾 20%和 32郾 60%。茁鄄折叠的含量较高,说明 ACP 二级结构中肽链之间交替分布,形成稳定构象。Moradi 等21研究表明:在 ACP 二级结构中,琢鄄螺旋的含量 10郾 8%,茁鄄折叠的含量 30郾 2%,茁鄄转角 和 无 规 则 卷 曲 的 含 量 分 别 为 17郾 6%和41郾 4%,与本研究结果基本一致。2郾 5摇 海鲈鱼 ACP 抑制剂虚拟筛选结果采用 Discovery Studio 4郾 5 的 CDOCKER 程序进行海鲈鱼 ACP 抑制剂的虚拟筛选,结果如表 2。筛选出 5 个 ACP 抑制剂(儿茶素、表没食子儿茶素、没食子酸、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯),ACP 与它们相互作用的能量分别是-171郾 473、-198郾 309、-140郾 189、-221郾 409、-256郾 647 kJ/mol。对虚拟筛选后的 5 个化合物进行ACP 活性抑制实验验证。2郾 6摇 抑制剂对 ACP 活性的影响不同抑制剂对 ACP 活性的影响见图4。儿茶素浓度小于等于 0郾 4 mmol/L 时,ACP 的相对酶活均为65%左右,无明显差异;当儿茶素浓度在0郾 6 1郾 0 mmol/L 时,ACP 的 相 对 酶 活 显 著 性 下 降(P 0郾 05),说明儿茶素抑制 ACP 具有浓度依赖性,且儿茶素浓度为 1郾 0 mmol/L 时,ACP 的相对酶活是 39郾 74%,经线性拟合儿茶素抑制 ACP 的 IC50为 0郾 76 mmol/L。随着 EGC、GA、ECG 和 EGCG 浓度升高,ACP 的相对酶活均显著下降(P 0郾 05),说明 EGC、GA、ECG 和 EGCG 抑制 ACP 活性具有浓度依赖 性;当 EGC、GA、ECG 和 EGCG 浓 度 均 为1郾 0 mmol/L时,ACP 的相对酶活分别是 31郾 49%、34郾 76%、29郾 76%、30郾 76%,EGC、GA、ECG 和 EGCG抑 制 ACP 的 IC50分 别 是 0郾 47、0郾 80、0郾 44、0郾 45 mmol/L。Siddiqua 等5选取金属化合物和有机841食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 9 月摇 摇 摇表 2摇 ACP 抑制剂虚拟筛选结果Tab.2摇 Virtual screening results of ACP inhibitors化合物名称结构式分子式MrE(相互作用)/(kJ mol-1)儿茶素C15H14O6290郾 27-171郾 473表没食子儿茶素C15H14O7306郾 27-198郾 309没食子酸C7H6O5170郾 12-140郾 189表儿茶素没食子酸酯C22H18O10442郾 37-221郾 409表没食子儿茶素没食子酸酯C22H18O11458郾 40-256郾 647不同字母表示同种抑制剂不同浓度时数据差异显著(P 0郾 05)。图 4摇 不同抑制剂对 ACP 活性的影响Fig.4摇 Effects of different inhibitors on ACP activity物探究对麦瑞加拉鲮鱼肝 ACP 活性的抑制作用,结果表明 Ca2+和 Mn2+不会降低 ACP 活性,其相对酶活为 97%、82%;ACP 活性不受甲醇、乙醇和甘油的影响;而酒石酸盐可以降低 ACP 活性,相对酶活是6%;而氟化物使 ACP 相对酶活降低至 40%。相比于化学类抑制剂,天然多酚类化合物具有为安全、低毒、高效等特点。多酚抑制 ACP 相对酶活在 40%,抑制强度和氟化物类似。因此,可以推测筛选出的5 个多酚抑制剂均能有效抑制 ACP 活性,且浓度越大,抑制效果越好。2郾 7摇 抑制剂与 ACP 的分子对接分析筛选的抑制剂与 ACP 的分子对接结果如图 5。由图 5(a)可知,儿茶素与 ACP 相互作用的主要氨基酸是天冬氨酸(Asp)和精氨酸(Arg)等,与这 2 种氨基酸形成 2 个氢键,键长分别是 1郾 95、2郾 61 魡。EGC 与 ACP 相互作用的主要氨基酸有甘氨酸(Gly)、Arg、蛋氨酸(Met)和谷氨酰胺(Gln)等,其中与 Gly、Arg、Met 和 Gln 共形成 7 个氢键,键长分别是 2郾 02、2郾 03、1郾 89、3郾 01、2郾 95、2郾 01、2郾 72 魡图 5(b)。由图 5(c)可知,GA 与 ACP 相互作用的主要氨基酸是 Gly、Met 和 Arg 等,其中与 Gly、Met形成了 2 个氢键,键长分别是 2郾 16、2郾 68 魡。由图 5(d)可知,ECG 与 ACP 相互作用的主要氨基酸有 Arg、Met、Gln、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)和丙氨酸(Ala)等,其中与 Arg、Met、Gln、Thr、Val 和 Ala 形成了 9 个氢键,键长分别是 2郾 41、2郾 01、2郾 29、2郾 47、2郾 63、2郾 42、2郾 06、2郾 03 魡。EGCG 与 ACP 相互作用的主要氨基酸有 Yhr、Arg、Gly 和 Met 等,其中与Yhr、Arg、Gly 和 Met 形成了 8 个氢键,键长分别是2郾 42、1郾 87、4郾 52、2郾 39、2郾 22、2郾 27、1郾 97、2郾 17 魡941第 41 卷 第 5 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李园园等:海鲈鱼酸性磷酸酶分离纯化及其抑制剂虚拟筛选图 5摇 抑制剂与 ACP 分子对接结果Fig.5摇 Molecule docking results of inhibitors with ACP图 5(e)。儿茶素、EGC、GA、ECG 和 EGCG 与 ACP相互作用除了氢键外,还有疏水相互作用。而已有研究表明大分子与小分子之间的相互作用方式是氢键和范德华力。Moradi 等21研究发现腐胺与 ACP相互作用是氢键和范德华力。原因是多酚类化合物和腐胺二者结构不同,导致与 ACP 相互作用力不同。步营等22采用分子对接技术从食品原料(虾夷扇贝)中筛选具有抗 2019 新型冠状病毒(SARS鄄CoV鄄2)能力的生物活性肽段,二者之间相互作用方式也是氢键和范德华力。3摇 结摇 论粗酶液经过硫酸铵沉淀后,纯化了 5郾 94 倍,回收率为 63郾 38%,经 DEAE-Sepharose 离子交换柱和Sephadex G-200 凝胶层析后,得到 2 种 ACP,即ACP I 和 ACP 域。ACP I 经纯化后比活力6郾57U/mg,纯化了 36郾 50 倍,回收率为 9郾 96%。ACP 域比活力为 4郾 62 U/mg,纯化了 25郾 67 倍,回收率为 6郾 07%。由于 ACP I 回收率和纯化倍数相对较高,对其进行了进一步的研究。ACP I 最适温度为 30 益,最适 pH值为5郾0;ACP I 的 Km为 0郾 098 mmol/L,vmax为 1郾 07滋mol/(L min)。ACP I 的 琢鄄螺旋含量 14郾 10%,茁鄄折叠含量 35郾 90%,茁鄄转角含量 18郾 20%,无规则卷曲含量 32郾 60%。通过虚拟筛选技术筛选出 5 个潜在多酚类化合物可作为 ACP 抑制剂;多酚类物质与ACP 的主要作用力为氢键和疏水作用。在一定浓度范围内(0 1郾0 mmol/L),5 个多酚化合物均能有效降低 ACP 活性,且浓度越大抑制效果越好,儿茶素、表没食子儿茶素、没食子酸、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯抑制酶活性的 IC50分别是0郾 76、0郾 47、0郾 80、0郾 44、0郾 45 mmol/L。参考文献:1摇 LAN W Q,YANG X,LIU J L,et al.Effects of phenolicacid grafted chitosan on moisture state and protein proper鄄ties of vacuum packaged sea bass(Lateolabrax japonicus)during refrigerated storageJ.LWT-Food Science andTechnology,2022,159:113208.051食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 9 月2摇 GADEKAR G P,BAILE V V.Histochemical distributionof acid phosphatase in the tissues of Indian major carp,Labeorohita(ham)J.Materials Today:Proceedings,2018,5(10):22317-22327.3摇 FUKE S,UEDA Y.Interactions between umami andother flavor characteristicsJ.Trends in Food Scienceand Technology,1996,7(12):407-411.4摇TIKK M,TIKK K,T覫RNGREN M A,et al.Develop鄄ment of inosine monophosphate and its degradation pro鄄ducts during aging of pork of different qualities in relation tobasic taste and retronasal flavor perception of the meatJ.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(20):7769-7777.5摇SIDDIQUA A,SAEED A,NAZ R,et al.Purificationand biochemical properties of acid phosphatase from rohufish liver J.International Journal of Agriculture andBiology,2012,14(2):223-228.6摇 高举,赵欣平,詹付凤,等.鲫鱼酸性磷酸酶酶学特性及不同效应物对酶活力的影响J.水生生物学报,2010,34(2):394-401.GAO J,ZHAO X P,ZHAN F F,et al.Properties of acidphosphatase from Carassias auratus and effects of severaleffectors on the activity of the enzymeJ.Acta Hydrobio鄄logica Sinica,2010,34(2):394-401.7摇 JING G,LI L Y,LI Y,et al.Purification and partialcharacterization of two acid phosphatase forms from pearloyster(Pinctada fucata)J.Comparative Biochemistryand Physiology Part B,Biochemistry&Molecular Bio鄄logy,2006,143(2):229-235.8摇 ZHU B W,YU J W,ZHANG Z S,et al.Purificationand partial characterization of an acid phosphatase fromthe body wall of sea cucumber Stichopus japonicusJ.Process Biochemistry,2009,44(8):875-879.9摇 葛改变,吴心悦,陈姣,等.计算机虚拟筛选技术在中药苦味物质基础中的研究应用J.中国新药杂志,2022,31(13):1273-1281.GE G B,WU X Y,CHEN J,et al.Application of virtualscreening technology in the material basis study on bittertaste and bitter efficacy of traditional Chinese medicineJ.Chinese Journal of New Drugs,2022,31(13):1273-1281.10摇 尚随锦,高宇,王凤雪,等.中草药中天然黄嘌呤氧化酶抑制剂的虚拟筛选J.中国现代中药,2022,24(2):249-257.SHANG S J,GAO Y,WANG F X,et al.Virtualscreening of natural xanthine oxidase inhibitors from Chi鄄nese herbal medicinesJ.Modern Chinese Medicine,2022,24(2):249-257.11摇 马青云,刘辰,杜海涛,等.基于高通量分子对接虚拟筛选 SARS-CoV-2 3CL 水解酶中药小分子抑制剂及抗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的中药及其复方预测J.中草药,2020,51(6):1397-1405.MA Q Y,LIU C,DU H T,et al.Virtual screening ofsmall molecular inhibitors of SARS-CoV-2 3CL hydro鄄lase based on high鄄throughput molecular docking andprediction of Chinese materia medica and its compoundagainst COVID-19J.Chinese Traditional and HerbalDrugs,2020,51(6):1397-1405.12摇 唐彪,王浩翔,付晓丽,等.基于 Discovery Studio 平台对 TGF-茁1 中药小分子抑制剂的虚拟筛选J.中华中医药杂志,2021,36(11):6669-6673.TANG B,WANG H X,FU X L,et al.Virtual screen鄄ing of TGF-茁1 inhibitors of Chinese materia medicasmall molecule based on Discovery Studio platformJ.China Journal of Traditional Chinese Medicine and Phar鄄macy,2021,36(11):6669-6673.13摇 MORADI S,SHAREGHI B,SABOURY A A,et al.In鄄vestigation on the interaction of acid phosphatase withputrescine using docking,simulations methods and mul鄄tispectroscopic techniquesJ.International Journal ofBiological Macrom