基于Wnt_β-catenin信号通路探讨四君子汤对胃癌脾气虚证裸鼠的作用机制.pdf

中 国 科 技核 心 期 刊Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2023 Vol.36 No.9药 理 研 究方方 药药 基于 Wnt/-catenin 信号通路探讨四君子汤对胃癌脾气虚证裸鼠的作用机制陈成，付越，李亮，李丰湖南中医药大学，湖南 长沙 410208摘 要 目的：探究四君子汤对胃癌脾气虚证裸鼠的分子学作用机制。方法：将20只BALB/c雄性裸鼠随机分为正常组6只和模型组14只，正常组常规喂养，模型组以番泻叶药液灌胃结合饥饱失常法建立脾气虚证模型，再行胃癌原位移植手术造模，造模成功的14只裸鼠随机抽取7只按10.92 g/kg灌胃四君子汤（四君子汤组），剩余7只裸鼠仍为模型组。记录各组裸鼠精神状态，皮毛色泽，反应力、活动度等行为学表征及肿瘤质量与抑瘤率；采用免疫印迹法和qPCR法检测肿瘤组织Wnt/-catenin的蛋白及其mRNA相对表达量。结果：正常组裸鼠活动正常，皮毛柔顺有光泽，大便正常；模型组裸鼠精神萎靡不振，毛发杂乱，反应迟钝，活动度欠佳，弓背懒动，肛门湿润红肿，大便不成形，呈溏状；四君子汤组裸鼠上述情况均有改善。与模型组相比，四君子汤组裸鼠肿瘤质量减轻（P0.05），抑瘤率为47%，Wnt1基因、-连环蛋白、MYC癌基因和基质金属蛋白酶7的mRNA及其蛋白表达降低（P0.05），糖原合酶激酶3的mRNA及其蛋白表达升高（P0.05）。结论：四君子汤可能是通过调控Wnt/-catenin信号通路来改善胃癌对机体的影响。关键词 胃癌；脾气虚证；Wnt/-catenin信号通路；四君子汤；裸鼠中图分类号 R285.5 文献标识码 A 文章编号 2096-9600（2023）09-0040-05The Mechanism of Sijunzi Tang in the Treatment of Gastric Cancer of Spleen Qi Deficiency Pattern in Nude Mice Based on Wnt/-catenin Signaling PathwayCHEN Cheng,FU Yue,LI Liang,LI FengHunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China AbstractAbstract Objective:To survey the molecular mechanism of Sijunzi Tang in the treatment of gastric cancer of spleen Qi deficiency pattern in nude mice.Methods:Twenty BALB/c male nude mice were randomized into six ones in the normal group and 14 in the model group,the normal group accepted normal feeding,and the model group adopted intragastric administration with Fanxieye soup and the method of hunger and aberration to establish the model of spleen Qi deficiency pattern,and then perform in-situ transplantation of gastric cancer for modeling,seven nude mice were randomly chosen from 14 ones after successful modeling and they were drenched with Sijunzi Tang(Sijunzi Tang group),and the remaining seven mice were selected as the model group.To record mental state,the color and lustre of skin and hair,behavioral characterization including reaction and activity,the weight of tumor and tumor-inhibition rate of the nude mice in different groups;Western blotting method and qPCR method were used to detect the relative expressions of Wnt/-catenin protein and its mRNA in tumor tissue.Results:Nude mice in the normal group had normal activity,with smooth and shiny coat,and normal stools;the ones in the model group were depressed,with disorganized fur,slow response,poor activity,bow-backed and slouching,wet and red anus,unformed and loose stool;the above conditions of the nude mice in Sijunzi Tang group were improved.Compared with the model group,the weight of tumor reduced in nude mice in Sijunzi Tang group(P0.05),the tumor-inhibition rate was 47%,the expressions of Wnt1 gene,-Collagen,MYC cancer gene and MMP-7 mRNA and protein lowered(P0.05),the levels of glycogen synthase kinase 3 mRNA and protein increased(P0.05).Conclusion:Sijunzi Tang could improve the influence of gastric cancer on human body possibly through regulating of Wnt/-catenin signaling pathway.KeywordsKeywords gastric cancer;spleen Qi deficiency pattern;Wnt/-catenin signaling pathway;Sijunzi Tang;nude mice胃癌是世界上发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，对人类健康和安全构成严重威胁。根据国际癌症研究机构（IARC）最新统计，2020年全球大约76.3万人死于胃癌，在恶性肿瘤发病率排名第五，死亡率排名第四1。东亚、东欧和南美是胃癌高发的重点地区2。其发生发展是一个多因素掺杂、存在多个阶段的复杂病理过程。临床实践和科学研究发现中医药在治疗癌症方面具有确切疗效3。四君子汤源自 太平惠民和剂局方。LI等4研究发现四君子汤可整合增强非替尼抗癌的DOI：10.12174/j.issn.2096-9600.2023.09.0840中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 2023年第36卷第9期调节特性，提示四君子汤可能在癌症治疗中发挥作用。LUO等5通过高通量组学研究发现四君子汤可通过上调MicroRNA表达改善胃癌症状，其靶基因中关系最为密切的通路是 Wnt/-catenin。Wnt/-catenin是一个高保守的信号通路，大量证据证明其参与了肿瘤的增殖、分化、迁移和侵袭过程6。因此，这一分子途径在癌症靶向治疗中具有重要意义。有研究揭示脾气虚证在胃癌的整个病程中具有重要作用7。四君子汤为治疗脾气虚证的代表方，但四君子汤能否通过调节 Wnt/-catenin发挥作用的机制仍不明确。前期研究发现四君子汤对胃癌脾气虚证具有改善作用8，四君子汤通过作用于血浆和唾液的共同靶基因 miR-151a-3调控胃癌脾气虚证的发生、发展。因此，基于前期研究基础，本研究以Wnt/-catenin信号通路为切入点进一步探讨四君子汤对胃癌脾气虚证的治疗作用。1 材料与方法1.1细胞人胃癌 NCI-N87细胞购自北纳生物制品公司（质检编号：338548）。1.2实验动物BALB/c雄性裸鼠25只，46周龄，体质量（164）g，湖南中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK（湘）2019-0009，饲养在湿度（5010）%和温度（222）的环境下，实验方案已通过动物伦理委员会批准，伦理编号：LL2020061501）。1.3药品、试剂与仪器1.3.1四君子汤由人参12 g、白术12 g、茯苓12 g和甘草6 g组成，购于辽宁龙参健康药业有限公司（批号：200905），经湖南中医药大学药学院袁林祥教授鉴定合格。四君子汤药液制备：以10倍水充分浸泡中药2 h，回流提取2次，转移至旋转蒸发仪，75 蒸发浓缩成 2 g/mL 的药液于-20 冰箱保存。灌胃时水浴加热至37。1.3.2番泻叶购于湖南中医药大学第一附属医院（批号：201019），以10倍水充分浸泡30 min，回流提取2次，转移至旋转蒸发仪，75 蒸发浓缩成1 g/mL的药液于-20 冰箱保存。1.3.3主要试剂RPMI-1640培养基（大连美仑生物技术有限公司，批号：MA0215-Feb-16G2）；BI特级胎牛血清（Biological Industries公司，批号：04-001-1ACS）；超纯总 RNA提取试剂盒（新景生物试剂开发有限公司，批号：5003050）；BCA蛋白定量试剂盒（伊莱瑞特生物科技有限公司，批号：E-BC-K318-M）；ECL发光液（Biosharp公司，批号：BL520B）；RIPA 蛋白裂解液（批号：CW2333s）、蛋白磷酸酶抑制剂混合物（批号：CW2383S）；SDS-PAGE上样缓冲液（批号：CW0027S）均购自康为世纪科技有限公司；Wnt1、-catenin、C-myc、Mmp-7、Gsk-3、GAPDH抗体（武汉三鹰生物技术科技有限公司，批号分别为：27935-1-AP、66379-1-Ig、67447-1-Ig、10374-2-AP、22104-1-AP、10494-1-AP）；山羊抗兔免疫球蛋白、山羊抗鼠免疫球蛋白（伊莱瑞特生物科技有限公司，批号分别为E-AB-1003、E-AB-1001）。1.3.4主要仪器细胞培养箱（Thermo 公司）；低温高速离心机（长沙维尔康）；varioskan LUX酶标仪（Thermo公司）；蛋白电泳仪、蛋白表达成像系统、580BRMy-CyclerPCR仪、ChemiDocXRS+凝胶成像分析系统均美国Biorad公司。1.4方法1.4.1模型制备1.4.1.1脾气虚证制备 将20只裸鼠分为正常组6只、模型组14只，正常组常规喂养，灌胃蒸馏水；模型组灌胃番泻叶结合饥饱失常法制备脾气虚证模型，番泻叶药液（1 g/mL）按每日10 mL/kg剂量灌胃，灌胃后禁食12 h，再恢复足量喂食，共15天。1.4.1.2人胃癌裸鼠原位移植瘤模型制备9 另取5只46周龄BALB/c雄性裸鼠，将NCI-N87人源胃癌细胞悬液（2106/mL）接种于裸鼠腋下，培育胃癌组织块。观察裸鼠腋下种植瘤生长情况，长到直径10 mm左右剥取出来，作为原位移植瘤的癌源。脱颈处死癌源裸鼠，剥取腋下肿瘤，清理瘤体上的包膜纤维和残留血管等，PBS溶液冲洗呈鱼肉状，剪成1 mm大小瘤体，将瘤体种植于脾气虚证裸鼠胃体上，用无菌针头轻微挑破胃大弯中部皮下筋膜，微微渗血即可，将制备好的瘤体用OB胶粘贴于筋膜划破处，医用胶凝固定，粘牢瘤体，分层关闭腹腔，整个操作过程要迅速、保温，严格遵守无菌原则。1.4.2动物分组、干预及样本采集将造模成功的模型组（14只）中裸鼠随机挑选7只（四君子汤组）灌胃四君子汤（10.92 g/kg），每日1次，剩余裸鼠仍记为模型组。模型组、正常组灌胃蒸馏水。于造模后14天末，禁食禁水12 h，处死裸鼠，打开腹腔，分离剥取模型组和四君子汤组裸鼠胃癌组织。测量肿瘤质量，置于无菌冻存管-80 冰箱保存。1.5观察指标及测定方法1.5.1中医行为学表征及体质量造模后，每日清晨8点密切观察3组裸鼠精神状态、皮肤色泽、反应力、活动度及肛门、粪便状态10等行为学表征，每3天测量裸鼠体质量。41Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2023 Vol.36 No.9中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 1.5.2瘤体体积及抑瘤率末次给药后处死裸鼠，称重肿瘤组织，计算肿瘤生长抑制率（抑瘤率）。抑瘤率（%）=（模型组平均瘤重-给药组平均瘤重）/模型组平均瘤重100%1.5.3肿瘤组织 Wnt/-catenin 相关蛋白表达检测（Western blot法）将-80 冰箱中的肿瘤组织取出，称重，在研磨器中加入含蛋白酶抑制剂的裂解液，冰上低温研磨，离心取上清，用BCA试剂盒测定胃癌组织蛋白浓度，配上样缓冲液，于-20 保存。剩余原液置-80 保存。电泳条件：160 V，30 min，400 V，90 min。PVDF膜湿转400 mA，1 h。5%脱脂奶粉摇床封闭90 min，TBST冲洗干净牛奶后孵育一抗Wnt1抗体（1 1000）、-catenin抗体（1 30000）、C-myc抗体（1 30000）、Mmp-7抗体（1 5000）、Gsk-3抗体（1 4000）4 过夜，TBST清洗4次，每次8 min，37 孵育二抗（兔抗1 10000，鼠抗 1 10000）1 h，TBST 清洗 4 次，8 min，ECL 显影液于凝胶成像系统中显影成像，Image J软件分析图像。1.5.4Wnt1、-catenin、C-myc、Mmp-7和Gsk-3的mRNA表达检测（qPCR法）-80 冰箱取出肿瘤组织称重，TRIzol法提取胃癌组织RNA，测其浓度，按照1000 ng每20 L逆转录成cDNA，使用SYBR染料，检测Wnt-1、-catenin、C-myc、Mmp-7和Gsk-3的 mRNA 表达（qPCR），以 GAPDH 为内参，用 2-Ct法计算各mRNA相对表达量。各引物序列见表1。1.6统计学方法采用 SPSS 26.0软件分析数据，计量资料以x s表示，采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1裸鼠脱落情况手术种瘤后，模型组死亡1只，四君子汤组死亡1只。2.2裸鼠中医行为学表征正常组裸鼠活动度正常，皮毛柔顺有光泽，反应灵敏、大小便正常；模型组裸鼠精神萎靡不振，反应迟钝，弓背懒动，皮毛杂乱，肛门红肿且湿润，大便呈溏状；四君子汤组裸鼠精神状态改善，活动度提高，反应尚佳，无明显弓背懒动现象，皮肤光泽度尚可，泄泻情况改善，粪便数量减少并趋于正常，肛周未见红肿，便质变硬，呈黑褐色。2.3裸鼠体质量正常组裸鼠体质量呈平稳上升趋势；与正常组相比，不同时间段模型组、四君子汤组体质量降低（P0.05）。与模型组相比，第19 天开始，四君子汤组体质量增加（P0.05）。见表2。2.4裸鼠瘤体质量与模型组相比，四君子汤组瘤体质量减轻（P0.05），抑瘤率为47%。见表3。2.5Wnt-1、-catenin、C-myc、Mmp-7和Gsk-3的mRNA表达与模型组相比，四君子汤组Wnt1、-catenin、C-myc和Mmp-7的mRNA表达下降（P 0.05），Gsk-3的mRNA表达升高（P0.05）。见表4。2.6 Wnt-1、-catenin、C-myc、Mmp-7 和 Gsk-3的蛋白表达 与模型组相比，四君子汤组Wnt-1、-catenin、C-myc和Mmp-7蛋白表达降低（P0.05），Gsk-3蛋白表达升高（P0.05），见表5和图1。表1Wnt-1、-catenin、C-myc、Mmp-7和Gsk-3引物序列名称Wnt-1-cateninC-mycMmp-7Gsk-3GAPDH正向序列（5-3）GGGTTTCTACTACGTTGCTACTGCTGCTGTCCTATTCCGAATGTCTGTTCTATCACCAGCAACAGCAGAGCGGCTGTGTGTTGGCTGAATTGTTGGGCTGTGTGTTGGCTGAATTGTTGGGTTGTCTCCTGCGACTTCA反向序列（5-3）CAGACTCTTGGAATCCGTCAAGGCACCAATGTCCAGTCCAAGATCCCGCAACATAGGATGGAGAACAGAGTTTGCTCCCTTGTTGGTGTTCCTAGTTTGCTCCCTTGTTGGTGTTCCTAGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCC产物长度（bp）131141139112112183表2不同时间段3组裸鼠体质量比较（x s）g组别正常组模型组四君子汤组鼠数666第16天24.170.4020.250.54*20.550.41*第19天24.430.7019.950.47*20.880.40*#第22天25.160.6419.480.39*21.130.34*#第25天25.230.7418.930.42*21.330.40*#第28天25.560.6218.280.37*21.630.42*#注：*表示与正常组比较，P0.05；#表示与模型组比较，P0.05表33组裸鼠瘤体质量比较（x s）g组别正常组模型组四君子汤组鼠数666瘤体质量-0.0450.00780.0240.0040#注：#表示与模型组比较，P0.05；-表示无瘤体42中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 2023年第36卷第9期3 讨论胃癌是一种常见的恶性病质，包括上皮内瘤变、黏膜内癌、黏膜下癌及浸润癌，病因未明，可发生于胃的任何部位11。胃癌属中医“反胃”“胃脘痛”“噎膈”“癥瘕”等范畴12。中医认为脾胃为后天之本，脾胃受损则元气不充，诸病由生，致积聚结块。现代研究认为胃癌的发生与“虚”“痰”“瘀毒”等因素密切相关，因脾气不足，运化水湿失治，聚湿成痰，进一步加重中焦虚弱，气血化生乏源，血液运行不畅，瘀血由生，痰瘀互结，痰瘀蕴久化毒，最后生成痰瘀毒交结的病理产物13。病性是本虚标实，脾胃气虚是胃癌产生的根本，贯穿胃癌早、中、晚期及术后等，健脾益气是治病求本，培本固元14。现代药理研究显示，机体的免疫逃逸也是造成肿瘤细胞持续增殖的主要原因，健脾益气法可增强自身免疫15。因此可通过培本固元，调节机体阴阳、脏腑、气血、经络平衡，调动人体内的防御机制，抑制肿瘤生长。四君子汤方中人参为君，甘温益气，健脾养胃；臣以白术苦温健脾燥湿，益气助运；佐以甘淡茯苓，健脾渗湿，苓术相配则健脾祛湿之力显著；使以甘草益气和中，调和诸药16。慢性萎缩性胃炎是胃癌进程中的重要过程，现代药理研究发现四君子汤可改善胃局部炎症和外周血白细胞炎症，降低慢性胃炎患者胃癌的发生率17。四君子汤还可抑制胃癌干细胞GCSCs，通过降低-catenin核积累和DNA结合活性来实现18。Wnt/-catenin 信号通路也被称为经典或-catenin依赖信号通路，是一个保守的信号轴，参与各种生理过程，如细胞生长、分化、凋亡、迁移、侵袭和组织稳态19。研究发现Wnt/-catenin信号通路与胃癌、肝癌和乳腺癌等多种恶性病质密切相关20，其通路的激活依赖于-catenin的过度积累和表达。但一种被称为“破坏复合物”的复合物有助于-catenin在生理条件下的降解。“破坏复合物”由腺瘤性大肠息肉病、Dishevelled（Dvl）、酪蛋白激酶 1 和 Axin/Axin2 组成，-catenin 会导致其被糖原合成酶激酶-3（Gsk-3）降解，然而，Dvl的刺激会“破坏复合体”，从而导致抑癌基因Gsk-3失活，大量-catenin在细胞质中积累，并转运至细胞核，与淋巴增强子结合因子和t细胞因子相互作用，从而活化转录，促进下游靶基因如C-myc和Mmp-7等，造成细胞周期调节失控，细胞周期调节失控是恶性肿瘤的重要特征之一，这将对细胞产生灾难性影响21。Wnt1是Wnt家族的第一个成员，其在系统发育方面保守，对于肿瘤发生和多种发育过程至关重要。研究发现Wnt1表达与胃癌大小、分化程度、浸润深度和淋巴结转移及生存率密切相关。正常成熟的胃组织Wnt1信号表现缺如22。说明Wnt1可作为胃癌潜在生物标志物的靶标23。-catenin又名B-连环蛋白，是Wnt通路的关键因子，幽门杆菌可激活-catenin以促进胃上皮细胞的肠道转分化24，-catenin及胃癌相关E-钙黏蛋白被证实不仅是黏附连接的静态成分，而且是下游Wnt信号级联的重要介质，二者可作为胃癌发生和发展的独立危险因素25。C-myc基因是MYC基因家族的重要成员之一，C-myc蛋白为细胞程序的主要调节剂，该基因既是可转基因，也是受多种因子调控的调控基因。C-myc通过肿瘤细胞内在机制及宿主免疫和TME依赖机制启动和维持癌症26。Mmp-7蛋白（又称金属蛋白酶7）属Mmp家族，参与基底膜和细胞外基质的破坏，导致肿瘤侵袭和转移。LONG等27发现Mmp-7与胃癌的分化程度和临床分期密切相关，并提示表4两组裸鼠Wnt/-catenin信号通路相关蛋白mRNA表达结果（x s）组别模型组四君子汤组鼠数66Wnt-1 mRNA0.720.350.330.12#-catenin mRNA1.170.800.510.18#C-myc mRNA1.160.550.230.17#Mmp-7 mRNA1.040.270.470.13#Gsk-3 mRNA1.531.252.181.16#注：#表示与模型组比较，P0.05表5两组裸鼠Wnt/-catenin信号通路相关蛋白表达（x s）组别模型组四君子汤组鼠数66Wnt-11.150.200.560.22#-catenin1.500.770.600.04#C-myc1.060.190.780.04#Mmp-70.970.060.750.08#Gsk-30.650.201.140.28#注：#表示与模型组比较，P0.0546 kDa92 kDa45 kDa29 kDa48 kDa36 kDaWnt-1-cateninC-mycMmp-7Gsk-3GAPDH 模型组 四君子汤组图1两组裸鼠胃癌组织蛋白电泳43Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2023 Vol.36 No.9中 国 科 技核 心 期 刊药 理 研 究方方 药药 Mmp-7参与了胃癌组织的侵袭和转移，有望作为确定胃癌进展和预后的有用生物标志物。本研究结果显示，模型组裸鼠胃癌组织中Wnt1、-catenin、C-myc和Mmp-7蛋白及其mRNA表达上升，Gsk-3蛋白及其mRNA表达下降，四君子汤组Wnt1、-catenin、C-myc 和 Mmp-7 蛋白及其 mRNA表达下降，Gsk-3蛋白及其mRNA表达上升。由此推断，四君子汤可通过影响Wnt信号通路相关蛋白来影响胃癌脾气虚证裸鼠癌瘤体的生长。预测影响途径可能是上游wnt配体的调控、关键基因-catenin核异位下调和基因表达或影响下游靶基因C-myc和Mmp-7表达，细胞周期调节失控。综上所述，四君子汤可下调肿瘤因子表达，在一定程度上抑制 Wnt/-catenin 信号通路的激活，减缓胃癌脾气虚证病程。参考文献1刘宗超，李哲轩，张阳，等.2020全球癌症统计报告解读 J.肿瘤综合治疗电子杂志，2021，7（2）：1-14.2SMYTH E C，NILSSON M，GRABSCH H I，et al.Gastric cancer J.Lancet，2020，396（10251）：635-648.3LIU J，MAO J J，WANG X S，et al.Evaluation of tradi-tional chinese medicine herbs in oncology clinical Trials J.Cancer J，2019，25（5）：367-371.4LI X，CHEN W，MIAO L，et 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Biol，2014，35（11）：11415-11426.收稿日期：2023-03-15*基金项目：湖南省自然科学基金（2019JJ40221）。作者简介：陈成（1993），女，在读硕士研究生。研究方向：肿瘤病证结合的分子机制研究。通讯作者：李丰（1976），男，博士学位，博士后，硕士研究生导师，教授。研究方向：肿瘤病证结合的分子机制研究。44