基于串联亲和层析法纯化并鉴定猪初乳中SIgA.pdf

畜牧兽医学报 2 0 2 3,5 4(9):3 8 8 4-3 8 9 4A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i:1 0.1 1 8 4 3/j.i s s n.0 3 6 6-6 9 6 4.2 0 2 3.0 9.0 2 7开放科学(资源服务)标识码(O S I D):基于串联亲和层析法纯化并鉴定猪初乳中S I g A杨 悦1,2,王 锐3,甘 源2,4,郝 飞2,4,谢 星2,4,张 磊2,4,邵国青2,4,孟庆国1,陈 蓉2,4*,冯志新1,2,4*(1.南京师范大学海洋科学与工程学院,南京 2 1 0 0 2 3;2.江苏省农业科学院兽医研究所,农业农村部兽用生物制品工程重点实验室,南京 2 1 0 0 1 4;3.南京农业大学生命科学院,南京 2 1 0 0 9 5;4.兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心,泰州 2 2 5 3 0 0)摘 要:分泌型免疫球蛋白A(S I g A)是黏膜免疫的主要效应分子,在临床上常常作为疾病早期诊断的靶标,此外,基于S I g A的治疗性单抗和靶向S I g A产生的黏膜疫苗也越来越受到关注。分离并纯化出完整且具有活性的S I g A是产品研发的前提。为了提高猪初乳中S I g A的纯化效率,本研究采用串联亲和层析,强阴离子柱和精细分子筛层析进行纯化,从1 0 m L初乳中获得3 m g具有活性的S I g A。使用W e s t e r n b l o t对纯化的S I g A进行鉴定,结果表明,纯化的S I g A与抗猪的重链蛋白单抗和抗S C单抗均具有良好的反应性。使用E L I S A测试S I g A与抗猪的I g A重链单抗的反应性,结果发现使用本方法纯化的S I g A较原先方法(即硫酸铵沉淀,D E A E 5 2弱阴离子层析,S e p h a-d e x G-2 0 0凝胶层析和多次亲和层析的纯化方法)具有更高的反应性。最后使用质谱鉴定纯化的蛋白,结果表明为猪的S I g A。本研究为从猪初乳中纯化S I g A建立了一种高效的纯化方法,也为其它来源的S I g A的纯化提供参考。关键词:猪初乳;S I g A;纯化;鉴定中图分类号:S 8 5 2.4 文献标志码:A 文章编号:0 3 6 6-6 9 6 4(2 0 2 3)0 9-3 8 8 4-1 1收稿日期:2 0 2 3-0 2-1 3基金项目:国家重点研发计划政府间国际科技创新合作重点专项(2 0 1 9 Y F E 0 1 0 7 3 0 0);江苏省农业科技自主创新资金项目(C X(2 2)3 0 2 9);国家自然基金面上项目(3 2 2 7 3 0 1 1)作者简介:杨 悦(1 9 9 8-),女,江苏兴化人,硕士,主要从事动物支原体致病机制研究*通信作者:冯志新,主要从事动物支原体致病机制研究,E-m a i l:f z x j a a s1 6 3.c o m;陈 蓉,主要从事动物支原体致病机制研究,E-m a i l:c h e n r o n g g r a p e 1 6 3.c o mP u r i f i c a t i o n a n d I d e n t i f i c a t i o n o f S I g A i n P o r c i n e C o l o s t r u m b a s e d o n T a n d e m A f f i n i t y C h r o m a t o g r a p h yYANG Y u e1,2,WANG R u i3,GAN Y u a n2,4,HAO F e i2,4,X I E X i n g2,4,Z HANG L e i2,4,S HAO G u o q i n g2,4,ME NG Q i n g g u o1,CHE N R o n g2,4*,F E NG Z h i x i n1,2,4*(1.S c h o o l o f M a r i n e S c i e n c e a n d E n g i n e e r i n g,N a n j i n g N o r m a l U n i v e r s i t y,N a n j i n g 2 1 0 0 2 3,C h i n a;2.K e y L a b o r a t o r y o f V e t e r i n a r y B i o l o g i c a l P r o d u c t s E n g i n e e r i n g,M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e a n d R u r a l A f f a i r s,I n s t i t u t e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e,J i a n g s u A c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s,N a n j i n g 2 1 0 0 1 4,C h i n a;3.S c h o o l o f L i f e S c i e n c e s,N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,N a n j i n g 2 1 0 0 9 5,C h i n a;4.G u o t a i T e c h n o l o g y I n n o v a t i o n C e n t e r o f V e t e r i n a r y B i o l o g i c a l P r o d u c t s(T a i z h o u),T a i z h o u 2 2 5 3 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:S I g A i s t h e p r i m a r y e f f e c t o r m o l e c u l e o f m u c o s a l i mm u n i t y,a n d i t i s o f t e n u s e d a s a t a r g e t f o r e a r l y d i a g n o s i s o f d i s e a s e s i n c l i n i c.I n a d d i t i o n,m o r e a n d m o r e a t t e n t i o n h a s b e e n p a i d f o r t h e r a p e u t i c S I g A mA b s a n d m u c o s a l v a c c i n e s t a r g e t i n g S I g A p r o d u c i n g.I s o l a t i o n a n d p u r i f i-9期杨 悦等:基于串联亲和层析法纯化并鉴定猪初乳中S I g Ac a t i o n o f i n t a c t a n d a c t i v e S I g A i s a p r e r e q u i s i t e f o r p r o d u c t d e v e l o p m e n t.I n o r d e r t o i m p r o v e t h e p u r i f i c a t i o n e f f i c i e n c y o f S I g A f r o m s w i n e c o l o s t r u m,i n t h i s s t u d y,a n e w w a y w a s e s t a b l i s h e d,i n c l u d i n g u s i n g t a n d e m a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y,s t r o n g a n i o n c o l u m n a n d s u p e r p o s e 6 g e l f i l t r a-t i o n.B y u s i n g t h i s w a y,3 m g o f a c t i v e S I g A w a s a b t a i n e d f r o m 1 0 m L o f c o l o s t r u m.W e s t e r n b l o t i mm u n o b l o t t i n g w a s p e r f o r m e d w i t h a n t i-p i g I g A h e a v y c h a i n MA b a n d a n t i-S C MA b,a n d t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t b o t h o f t h e MA b s h a d g o o d r e a c t i v i t y w i t h p u r i f i e d S I g A h e r e.E L I S A m e t h o d w a s u s e d t o t e s t t h e r e a c t i v i t y o f S I g A p u r i f i e d h e r e a n d a n t i-p i g I g A h e a v y c h a i n MA b,i t s h o w e d t h a t t h e p u r i f i e d S I g A i n o u r s t u d y h a d h i g h e r r e a c t i v i t y t h a n S I g A p u r i f i e d b y t h e o l d m e t h o d(a mm o n i u m s u l p h a t e p r e c i p i t a t i o n,D E A E 5 2 w e a k a n i o n c h r o m a t o g r a p h y,S e p h a d e x G-2 0 0 g e l c h r o m a t o g r a p h y a n d m u l t i p l e P r o t e i n A a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y).F i n a l l y,p u r i f i e d S I g A w a s f u r t h e r c h e c k e d b y m a s s s p e c t r o m e t r y.O u r r e s e a r c h e s t a b l i s h e d a n e f f i c i e n t m e t h o d f o r t h e p u r i f i c a t i o n o f S I g A f r o m s w i n e c o l o s t r u m,a n d a l s o p r o v i d e d a r e f e r e n c e f o r t h e p u r i f i c a t i o n o f S I g A f r o m o t h e r a n i m a l s.K e y w o r d s:p o r c i n e c o l o s t r u m;S I g A;p u r i f i c a t i o n;i d e n t i f i c a t i o n*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:F E NG Z h i x i n,E-m a i l:f z x j a a s 1 6 3.c o m;CHE N R o n g,E-m a i l:c h e n r-o n g g r a p e 1 6 3.c o m 黏膜是脊椎动物免疫系统的第一道防线,分泌型免疫球蛋白A(s e c r e t o r y i mm u n o g l o b u l i n A,S I-g A)是黏膜免疫中结合病原,保护机体的主要效应分子1-3。S I g A主要以 二聚体 的 形 式 存 在,两 个I g A分子由一条J链(j o i n i n g-c h a i n)组装形成二聚体,二聚体I g A与多聚免疫球蛋白受体(t h e p o l y-m e r i c I g-r e c e p t o r)的胞外区,也叫分泌成分(s e c r e-t o r y c o m p o n e n t,S C)相结合,形成完整的S I g A4-5,随后,S I g A借助分泌成分,从上皮固有层分泌到黏膜器官的腔面3。与其它免疫球蛋白类似,I g A分子是由两条分子量约为5 5 k u的重链和两条分子量约为2 5 k u的轻链组成,加上1 5 k u的J链和约为7 5 k u的分泌成分,S I g A的分子量约为4 0 0 k u6。除了形成主要的二聚体形式外,S I g A还存在四聚体,五聚体等更多元的聚合形式7-8。近年来,基于I g A单克隆抗体的治疗药物研究越来越多9-1 0。针对结核分枝杆菌,大肠杆菌等呼吸道、消化道的病原,靶向黏膜免疫可产生特异性S I g A的黏膜疫苗也成为疫苗研究的新的方向9,1 1。病原感染机体后,S I g A出现时间相对较早,存在于取样方便的黏膜分泌液中,因此特异性病原的S I g A也作为早期诊断试剂的靶标分子。如乳汁中猪流行性腹泻病毒I g A抗体的检测1 2-1 3,胃癌的胃液分泌型I g A的检测等1 4,猪I g A双抗夹心E L I S A检测方法的建立等1 5。无论是作为抗体治疗药物,还是检测靶标,S I g A/I g A的分离纯化是关键步骤。目前,S I g A的纯化多以初乳为原材料,主要集中于人、鼠和牛1 6-1 9。本团队曾采用传统的硫酸铵盐析法沉淀蛋白,D E A E 5 2纤维离子、S e p h a d e x G-2 0 0凝胶层析和多次P r o t e i n A亲和层析,最终分离纯化出猪S I-g A2 0。为了进一步提高猪S I g A的纯化效率,本研究避开了费时的硫酸铵沉淀法,采用串联亲和层析,先用P r o t e i n G层析柱吸附过多的I g G,然后再用P r o-t e i n A和P r o t e i n L层析柱结合S I g A,最后用阴离子柱R e s o u r c e Q和分子筛S u p e r o s e 6对亲和层析柱上洗脱的蛋白进行精细纯化,获得了较高收率和较高纯度且具有活性的猪S I g A,本研究旨在探究一种分泌型免疫蛋白球(S I g A)纯化鉴定更高效的方法。1 材料与方法1.1 初乳的采集及乳清的分离 采集产仔当天的二元母猪初乳,4保存,然后用冷冻离心机5 0 0 0g,在4 下离心3 0 m i n,用移液器吸取中层乳清,并分装保存于-4 0。1.2 抗体与蛋白阳性对照S I g A,为本实验室每年由专人通过标准方法与流程2 0,从产仔后2 d内母猪初乳中提取,经过鉴定后冻干,保存于-8 0 的标准品。抗猪S I g A的单抗购于B e t h y l公司。S C蛋白和抗S C的单抗也为本实验制备与保存2 1。1.3 猪初乳S I g A的纯化 取1 0 m L乳清,用P B S缓冲液5倍稀释,然后5883畜 牧 兽 医 学 报5 4卷 用超高速离心机1 0 0 0 0 0g,4 离心1 h,再次吸取中层乳清并用0.2 2 m 滤器过滤。用1 0倍柱体积的P B S缓冲液对P r o t e i n G(G e n S c r i p t)、P r o t e i n A(G e n S c r i p t)及P r o t e i n L(G e n S c r i p t)进行平衡。将过滤后的乳清先到P r o t e i n G上进行挂柱,收集流穿液。P r o t e i n G的流穿液再依次到P r o t e i n A和P r o t e i n L柱 上 进 行 挂 柱。最 后 用 洗 脱 缓 冲 液(0.1 m o lL-1 g l y c i n e,p H 3.0)对挂柱的蛋白进行洗脱并收集。蛋白被洗脱下来立即用1 m o lL-1 T r i s-HC l p H 8.0缓冲液进行中和,防止抗体长期在酸性环境中被破坏。用S D S-P AG E进行鉴定,将含有目的蛋白的洗脱液使用超滤管进行离心浓缩,用低盐缓冲液A(1 0 mm o lL-1 T r i s-HC l p H 8.0,1 0 mm o lL-1 N a C l)换液,然后用阴离子交换柱R e s o u r c e Q(C y t i v a)进行纯化,通过缓慢增加高盐缓冲液B(1 0 mm o lL-1 T r i s-HC l P H 8.0,1 m o lL-1 N a C l)的比例来洗脱目的蛋白。收集在A2 8 0 n m处有吸收值的洗脱液,经S D S-P AG E及W e s t e r n b l o t鉴定,然后选取含有目的蛋白的峰进行下一步试验。最后用分子筛层析柱S u p e r o s e 6(C y t i v a)进行纯化,缓冲液使用2 0 mm o lL-1 T r i s-HC l p H 8.0,3 0 0 mm o lL-1 N a C l。收集在A2 8 0 n m处有吸收值的洗脱液,并通过S D S-P AG E及W e s t e r n b l o t鉴定收集目的蛋白。整个蛋白的纯化流程如图1所示。1.4 E L I S A鉴定S I g A的特异性 将纯化后的S I g A按照3 g m L-1稀释,每孔1 0 0 L,4 包 被 过 夜,P B S T清 洗 后 用5%B S A(P B S T缓冲液稀释)3 7封闭2 h。用稀释的H R P标记的羊抗猪S I g A的单抗(1 1 0 0 0 0)3 7孵育1 h。最后每孔加入TM B 显色液1 0 0 L,3 7避光显色8 1 0 m i n。加入5 0 L终止液来终止反应,观察结果。1.5 W e s t e r n b l o t鉴定S I g A的特异性 将纯化后的S I g A经S D S-P AG E电泳后,转印至P V D F膜。P V D F膜用含5%脱脂乳的T B S T缓冲液4 封闭过夜。T B S T洗涤后加入1 1 0 0 0 0稀释的HR P标记的羊抗猪S I g A的单抗(T B S T缓冲液稀释),3 7,孵育2 h。最后加E C L显色液显色后曝光检测。鉴定S C特异性是以S C单抗为一抗,3 7孵育2 h。加入1 1 0 0 0 0稀释的HR P标记山羊抗鼠I g G,3 7孵育2h,其他步骤不变。1.6 质谱鉴定猪初乳S I g A 将纯化后的S I g A进行S D S-P AG E电泳,然后图1 猪初乳S I g A的纯化流程图F i g.1 F l o w d i a g r a m o f t h e p u r i f i c a t i o n o f S I g A f r o m p o r c i n e c o l o s t r u m用考马斯亮蓝染色液染色,最后用脱色液进行脱色。将S I g A的重链条带及S C条带切成胶粒,分别装入1.5 m L E P管中,送上海拜谱生物科技有限公司进行质谱鉴定。每份样品先用胰蛋白酶进行消化,然后使用E a s y n L C 1 2 0 0系统(T h e r m o S c i e n t i f i c)进行色谱分离。色谱柱使用反相T r a p c o l u m n(1 0 0 m2 0 mm,C 1 8)以1 0 0%的0.1%甲酸水溶液平衡,再用0.1%甲 酸 乙 腈 水 溶 液 进 行 洗 脱,流 速 为3 0 0 n Lm i n-1,分析时间为6 0 m i n。肽 段 分 离 后 使 用Q-E x a c t i v e H F-X质 谱 仪(T h e r m o S c i e n t i f i c)进行数据依赖采集式质谱分析。分析时长为3 0 m i n,检测模式为正离子,母离子扫描范围为3 0 0 1 8 0 0 m/z,一级质谱分辨率为3 0 0 0 0 m/z 2 0 0,二级质谱分辨率为1 7 5 0 0 m/z 2 0 0。质谱数据库检索软件使用 M a x Q u a n t 1.6.1 7.0,检索的数据库为猪的参考蛋白组数据库(h t t p s:/w w w.u n i p r o t.o r g/p r o t e o m e s/U P 0 0 0 0 0 8 2 2 7)。6883 9期杨 悦等:基于串联亲和层析法纯化并鉴定猪初乳中S I g A2 结 果2.1 猪初乳乳清的分离经过低温台式离心机离心后,猪初乳可以明显地分为3层,最上层为白色乳脂层,中间层为淡黄色乳清层,最底层为白色酪蛋白沉淀(图2 A),其中乳清层占9 0%9 5%呈现悬浊液状态。把乳清层用A.猪初乳经过离心后的分层情况(经过离心后可以分成3层,分别为乳脂层,乳清层和酪蛋白层,不同分层已经用箭头及相应文字进行标注);B.经过超速离心后的乳清层A.S t r a t i f i c a t i o n o f p o r c i n e c o l o s t r u m a f t e r c e n t r i f u g a t i o n(T h e d i f f e r e n t l a y e r s h a v e b e e n m a r k e d w i t h a r r o w s a n d c o r-r e s p o n d i n g t e x t);B.T h e w h e y l a y e r a f t e r u l t r a c e n t r i f u g a-t i o n图2 猪初乳经离心后的分层情况及经过超速离心后的乳清层F i g.2 S t r a t i f i c a t i o n o f p o r c i n e c o l o s t r u m a f t e r c e n t r i f u g a t i o n a n d t h e w h e y l a y e r a f t e r u l t r a c e n t r i f u g a t i o n 超速离心机离心后,依然分成乳脂,乳清和酪蛋白3层,乳清层变为透明的浅黄色(图2 B)。2.2 串联亲和层析对猪初乳S I g A进行粗纯乳清样品经过S D S-P AG E,显示在5 0和2 5 k u处各有一条条带,分别对应免疫球蛋白的重链和轻链,提示在乳清中含有大量的免疫球蛋白(图3 A)。经过P r o t e i n G和P r o t e i n A和P r o t e i n L挂柱后,用甘氨酸洗脱3个亲和层析柱时,从P r o t e i n G柱上洗脱下来的蛋白最多,约有4 0 0 m g,其次为从P r o t e i n A柱上洗脱的蛋白,约有1 0 0 m g,从P r o-t e i n L柱上洗脱下来的蛋白最少,大约只有4 0 m g。对洗脱下来的蛋白进行S D S-P AG E鉴定,发现从三个亲和层析柱上洗脱下来的样品均在5 5和2 5 k u处各有一条蛋白条带(图3 B),为免疫球蛋白,但是尚无法区分I g G和S I g A,洗脱样品的杂蛋白条带较弱或者没有,表明亲和层析已经达到一个较好的效果。由于理论上只有在P r o t e i n A和P r o t e i n L柱上洗脱下来的样品中含有S I g A,因此,这对这两个样品进行进一步的纯化。2.3 离子交换和分子筛层析对猪初乳S I g A进行精细纯化 从P r o t e i n A柱上洗脱下来的蛋白,进行离子交换时,蛋白分别在1 5%和3 5%的离子强度处各有 A.猪乳清层的S D S-P A G E分析(M.蛋白质相对分子质量标准;1.分离的猪乳清);B.猪初乳乳清串联亲和层析纯化过程中各样品的S D S-P A G E分析(M.蛋白质相对分子质量标准;1.乳清结合P r o t e i n G柱后的流穿液;2.P r o t e i n G柱的甘氨酸洗脱收集液;3.P r o t e i n A柱的甘氨酸洗脱收集液;4.乳清结合P r o t e i n G柱后又结合P r o t e i n A柱后的流穿液;56.P r o t e i n L柱的甘氨酸洗脱收集液)A.S D S-P A G E a n a l y s i s o f t h e p o r c i n e w h e y l a y e r(M.P r o t e i n r e l a t i v e m o l e c u l a r q u a l i t y s t a n d a r d;1.I s o l a t e d p o r c i n e w h e y);B.S D S-P A G E a n a l y s i s o f e a c h s a m p l e d u r i n g t h e t a n d e m a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y p u r i f i c a t i o n o f p o r c i n e c o l o s t r u m w h e y(M.P r o t e i n r e l a t i v e m o l e c u l a r q u a l i t y s t a n d a r d;1.F l o w-t h r o u g h a f t e r w h e y b i n d i n g t o P r o t e i n G c o l u m n;2.G l y c i n e e l u e n t c o l l e c t i o n f r o m P r o t e i n G c o l u m n;3.G l y c i n e e l u e n t c o l l e c t i o n f r o m P r o t e i n A c o l u m n;4.F l o w-t h r o u g h a f t e r w h e y b i n d i n g t o P r o t e i n G c o l u m n a n d t h e n t o P r o t e i n A c o l u m n;5-6.G l y c i n e e l u e n t c o l l e c t i o n f r o m P r o t e i n L c o l u m n)图3 猪初乳乳清亲和层析纯化过程中的S D S-P A G E分析F i g.3 S D S-P A G E a n a l y s i s o f p o r c i n e c o l o s t r u m w h e y d u r i n g a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y p u r i f i c a t i o n7883畜 牧 兽 医 学 报5 4卷 一个洗脱峰,分别命名为P 1峰和P 2峰(图4 A)。其中P 1峰的面积远远大于P 2峰,表明 P 1峰有更多的蛋白。S D S-P AG E对各个峰的不同收集管进行鉴定,发现各个收集管在5 5和2 5 k u处都各有一条蛋白条带。对P 1峰和P 2峰的蛋白条带进行进一步的对比,发现,P 2峰收集的蛋白,5 5 k u处条带要相对P 1峰的要略微偏上,即蛋 白要略微偏 大(图4 A)。根据之前的研究,S I g A的重链要比I g G的重链要略微偏大2 0(图5),因此推测P 1峰为I g G,P 2峰为S I g A。为了进一步确定P 1和P 2峰的蛋白性质,作者用羊抗猪S I g A重链的抗体对两个峰的蛋白进行免疫印迹,结果表明,抗体可以很好地与P 2峰的蛋白,还有阳性对照S I g A进行反应,而与P 1峰 的 蛋 白,猪 的I g G,B S A等 不 发 生 反 应(图4 B)。因此,P 2峰是主要含有S I g A的目的峰。A.P r o t e i n A柱纯化蛋白的离子交换层析(横坐标为洗脱体积,纵坐标为A2 8 0 n m的吸光值,次坐标为电导率。P 1和P 2两个峰分别用箭头标出。插入的S D S-P A G E图为目的蛋白洗脱收集峰各个收集管的鉴定,其中14号收集管来源于P 1收集峰;59号收集管来源于P 2收集峰);B.离子交换层析洗脱峰的W e s t e r n b o l t鉴定(M.蛋白质相对分子质量标准;1.P 1峰的蛋白样品;2.P 2峰的蛋白样品;3.S I g A标准品;4.猪的I g G;5.B S A)A.I o n-e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e i n p u r i f i e d b y P r o t e i n A c o l u m n(T h e h o r i z o n t a l c o o r d i n a t e i s t h e e l u t i o n v o l u m e,t h e v e r t i c a l c o o r d i n a t e i s t h e a b s o r b a n c e v a l u e o f A2 8 0 n m a n d t h e s e c o n d a r y c o o r d i n a t e i s t h e c o n d u c t i v i t y.T w o p e a k s,P 1 a n d P 2,a r e m a r k e d w i t h a r r o w s r e s p e c t i v e l y.T h e i n s e r t e d S D S-P AG E p l o t s s h o w t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t h e i n d i v i d u a l c o l l e c t e d f r a c t i o n s o f t h e e l u t i o n p e a k s o f t h e t a r g e t p r o t e i n,w h e r e f r a c t i o n s 1-4 a r e f r o m t h e P 1 p e a k;f r a c t i o n s 5-9 a r e f r o m t h e P 2 p e a k);B.W e s t e r n b o l t i d e n t i f i c a t i o n o f t h e c o l l e c t e d f r a c t i o n s f r o m i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y(M.P r o t e i n r e l a t i v e m o-l e c u l a r q u a l i t y s t a n d a r d;1.P r o t e i n s a m p l e o f t h e P 1 p e a k;2.P r o t e i n s a m p l e o f t h e P 2 p e a k;3.S I g A s t a n d a r d s;4.P i g I g G;5.B S A)图4 P r o t e i n A柱纯化蛋白的离子交换层析及相应洗脱峰样品的W e s t e r n b o l t鉴定F i g.4 I o n-e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f P r o t e i n A c o l u m n p u r i f i e d p r o t e i n s a n d W e s t e r n b o l t i d e n t i f i c a t i o n o f t h e c o r r e s p o n d i n g e l u t i o n p e a k s a m p l e s 类似,从P r o t e i n L柱上洗脱下来的蛋白进行离子交换层析时,出现了P 1峰、P 2峰和P 3峰3个峰,分别在1 5%、3 5%和5 0%的离子强度处被洗脱(图6 A)。对三个峰收集的蛋白进行S D S-P AG E鉴定,结果显示:P 1、P 2峰的蛋白在5 5和2 5 k u处均各有单一的条带(图6 A),其中P 2峰5 5 k u 处的重链要略大于P 1峰的重链,推测P 1峰为I g G,P 2峰为S I-g A。P 3峰的蛋白条带位于3 32 5 k u,可能为残留的酪蛋白或者乳清中的其它蛋白。此外P 2峰的所有收集管在7 09 0 k u有一条额外的条带,推测可能是S I g A上的S C片段。对P 1和P 2峰收集的蛋白进行W e s t e r n b l o t鉴定,结果显示P 2峰的蛋白能够与羊抗猪S I g A重链的抗体于5 5 k u发生特异性结合,与阳性对照S I g A出现条带的位置一致(图6 B),判断P 2峰为S I g A。而抗体与P 1峰蛋白,猪的I g G和B S A都没有明显反应。经过上述阴离子柱交换层析,发现通过P r o t e i n L柱纯化得到的S I g A蛋白更多,阴离子交换层析时的峰型更好,因此,选取图6中的P 2峰,进行进一步的分子筛层析。分子筛层析结果显示,蛋白主要在1 3 m L 左右出现较为单一的峰(图7 A),在1 0和1 5.5 m L左右分别由一个较小的峰。S D S-P AG E鉴定发现,主峰蛋白在5 5和2 5 k u各有一条蛋白条带,提 示 为 免 疫 球 蛋 白。1 0 m L左 右 的 小 峰,蛋8883 9期杨 悦等:基于串联亲和层析法纯化并鉴定猪初乳中S I g A M.蛋白质相对分子质量标准;1.S I g A;2.I g GM.P r o t e i n r e l a t i v e m o l e c u l a r q u a l i t y s t a n d a r d;1.S I g A;2.I g G图5 S I g A及I g G的S D S-P A G E分析F i g.5 S D S-P A G E a n a l y s i s o f S I g A a n d I g G白条 带 位 于7 09 0 k u,推 测 可 能 是S C蛋 白。1 5.5m L处的小峰,在5 5和2 5 k u各有一条蛋白条带,可能为残留的少量I g G。W e s t e r n b l o t鉴定,结果显示主峰的蛋白能够与羊抗猪S I g A重链的抗体在5 5 k u发生特异性结