基于RNA条形码技术对新型冠状病毒的鉴定.pdf

doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.04.037基于 RNA 条形码技术对新型冠状病毒的鉴定蒋 帅1,游昌乔1,2,张红明1,2,秦 红2,郭新红1(1.湖南大学 生物学院,长沙 410082;2.南华生物医药股份有限公司,长沙 410006)摘 要 旨在设计一种通过 RNA 条形码片段对 SARS-CoV-2 进行更快、更准确鉴定的技术。该技术基于 NCBI 数据库对所有 Beta-CoV 属以及 7 种 HCoVs 的序列进行筛选并构建序列库。通过生物信息学方法对序列库进行遗传多样性分析、遗传距离分析以及系统发育树的构建,从而测试条形码片段在不同情况下对鉴定 SARS-CoV-2 的准确性与稳定性。基于 SNP 位点对序列进行剪裁并利用 NCBI 的 Blast 功能将剪裁的片段进行打分,得到鉴别效果最优的条形码片段并可视化。结果表明,RNA 条形码片段可以准确地将 SARS-CoV-2 从序列库内包含的所有毒株中鉴定出来,而通过 Blast 打分以及 P 值检验最终得到的 2 条条形码片段(分别位于 ORF1ab 和 S 基因编码区)对鉴定SARS-CoV-2 具有很好的稳定性。RNA 条形码技术不仅有利于探索 SARS-CoV-2 全基因组序列多态性与物种特异性遗传标记的关系,还有利于为 SARS-CoV-2 的鉴定技术提供新思路。关键词 新型冠状病毒;条形码技术;物种鉴定;RNA 片段中图分类号 R373;R563.1文献标识码 A文章编号 2095-1736(2023)04-0037-05Identification of SARS-CoV-2 based on RNA barcodingJIANG Shuai1,YOU Changqiao1,2,ZHANG Hongming1,2,QIN Hong2,GUO Xinhong1 1.School of Biology Hunan University Changsha 410082 China 2.NanHua Bio-medicine Co.Ltd.Changsha 410006 China Abstract It aimed to design a technology for the faster and more accurate identification of SARS-CoV-2 through RNA barcode seg-ments.Sequences of Beta-CoV genera and 7 HCoVs were screened to construct the sequences database based on the NCBI online data-base.The genetic diversity analysis genetic distance analysis and phylogenetic tree construction of the sequences database were per-formed on bioinformatics methods so as to examine the accuracy and stability of barcode segments in identifying SARS-CoV-2 in differ-ent cases.Finally the fragments clipped from the SNP sites on sequences were scored by using the Blast on NCBI to obtain the bar-code segments and visual barcodes with the optimal identification effect.Above results showed that the RNA barcode segments could precisely identify SARS-CoV-2 from all strains within the sequences database and the two barcode segments located in the coding re-gions of ORF1ab gene and S gene respectively screened with Blast Total scores and P value tests also had good stability for identifying SARS-CoV-2.RNA barcoding contributed to explore the relationship between the whole genome sequence polymorphism of SARS-CoV-2 and the species-specific genetic markers and to provide new idea for identification technologies of SARS-CoV-2.Keywords SARS-CoV-2 barcoding species identification RNA segment新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)属于冠状病毒科(Corona-viridae),乙型冠状病毒属(Betacoronavirus,Beta-CoV),沙贝病毒亚属(Sarbecovirus)的一种毒株,为正义单链RNA 病 毒(Positive-sense single-stranded RNA virus,(+)ssRNA virus)1。SARS-CoV-2 及其变体的基因组测序2、蛋白质结构预测3和遗传谱系构建4等问题逐渐被攻克。检测人群感染 SARS-CoV-2 的鉴定技术主要包括:一是对区域内大规模人群或个人的核酸采样并进行 PCR 检测5-6,二是采用化学发光技术检测人群血清特异性抗体 IgM、IgG 水平7。以上技术不但消耗大量的时间和人力成本,而且鉴定病毒感染的重复性和准确性也欠佳6-7。条形码技术于 2003 年首次由保罗赫伯特(Paul 73第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023收稿日期:2022-06-07;最后修回日期:2022-07-04基金项目:国家 重点研 发计 划项目(2017YFF0210303);湖 南大学 生物 学院和 南华生 物医 药股份 有限公 司产学 研合 作项目(H202191490139)作者简介:蒋帅,博士,研究方向为生物信息学,E-mail:gs2022 通信作者:郭新红,博士,教授,研究方向为基因组学与生物信息学,E-mail:gxh Hebert)提出8。与传统生物识别技术相比,条形码片段通过挖掘物种的遗传信息进而获得更多特异性分子遗传标记9。这些特异性标记不仅能够有效鉴定物种,也可以作为物种出现大规模变异的判断依据。近年来,研究表明条形码技术在病毒鉴定方面卓有成效10-11。因此,旨在设计 RNA 条形码片段对 SARS-CoV-2 进行更快、更精确的鉴定。1 材料与方法1.1 病毒全基因组序列库构建从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库12中收集所有已发表的乙型冠状病毒属参考全基因组(Refseq complete genome)序列。此外,序列库(Sequences database)还收集了 SARS-CoV-2的6 种主要变种(Alpha B.1.1.7,Belta B.1.351,Delta B.1.617.2,Gamma P.1,Lambda C.37,Omi-cron B.1.1.529)以及甲型冠状病毒属(Alphacoronavirus,Alpha-CoV)的剩余2 种人冠状病毒(Human Coronaviruses,HCoVs)1毒株(Human coronavirus 229E,HCoV-229E;Hu-man coronavirus NL63,HCoV-NL63)的参考(Reference)全基因组序列以研究 SARS-CoV-2内部的变异水平。1.2 序列库的生物信息学分析基于 MAFFT 算法,序列库进行在线多重序列比对(https:mafft.cbrc.jp/alignment/server/)13。完成比对过程后,利用分子进化遗传(Molecular Evolutionary Genetics Analysis,MEGA 11.0)14与基因多态性分析软件(DNA sequence polymorphism,DNAsp6)15对结果进行核酸序列与遗传多样性分析。根据 MEGA 11.0 中的核酸演化速率 K2P 模型(Kimura 2-parameter model,K2P),分别以序列库内的SARS-CoV-2 和人体冠状病毒序列作为同一分类群(Groups),其他序列作为外群(Outgroups),对 2 种序列库分别计算种内平均遗传距离(Within group mean dis-tance)与种间平均遗传距离(Between group mean dis-tance)并构建各自相应的种内种间平均遗传距离热图。以上 2 个热图中,对角线中的方格表示每个毒株的种内平均遗传距离。由于序列库中毒株数量较多,因此出于分析结果准确性的考虑,采用 Phylip16自带的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建进化树(置信度设置大于 90),并使用 iTOL(Interactive Tree Of Life,iTOL)(https:itol.embl.de/)17在线网站完成对进化树的可视化。1.3 关键遗传分子标记查找将 SARS-CoV-2 及其变种的相关序列设置为序列库内的唯一数据集(Dataset),并利用 DNAsp6 中的“Polymorphism”功能检索 SARS-CoV-2 所含单核苷酸多态性位点(Single nucleotide polymorphism sites,SNP sites)18的数目(以下简称为 SNP 位点)。本质上,SNP 位点与变异位点(Variable sites)含义相同19,因此,再利用 DNAsp6 中的“Polymorphic sites”功能记录SARS-CoV-2 中所有变异位点在序列库中的相对位置。1.4 条形码片段查找与可视化根据检索到的所有 SNP 位点,以其中一个位点为截取条形码片段的起始端,以该位点后续一个位点作为片段的末端对序列库内 SARS-CoV-2 序列进行片段剪切。利用 NCBI 的 Blast 序列比对窗口(https:blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对剪切的所有片段进行标准核苷酸数据库(Standard nucleotide databases)内比对,其比对对象包括所有在 NCBI 正式发布的核苷酸序列(截至 2022 年 6 月共计发布 83 793 632 条),并设置比对结果参数(Program selection parameters)为仅包含最高相似度序列(Highly similar sequences)。得到片段的前 5 000 个 Blast 比对结果后(最大结果显示数目为5 000),记录所有结果中的最高比对总分值(Total scores)。当 5 000 个比对结果均为 SARS-CoV-2 毒株并且相应的比对总分值始终等于最高比对总分值时,认为该片段可以准确稳定地鉴定 SARS-CoV-2。在Blast 系统中,输入的每个片段长度并不相同,对片段Blast 后的比对总分值大小也不相同。由于序列库经MEGA 比对后内部出现部分空缺位(Gaps and missing data)20,需要利用 DNAsp6 中的“Conserved DNA re-gions”功能对剪切的片段进行序列库内保守性测试21,以得到每个片段的打分数据(P values)作为评价条形码片段的依据。选取 SARS-CoV-2 中各基因编码区内比对总分值最高以及 P 值最低的物种特异性片段绘制成可视化一维与二维组合条形码。对一维梳齿状条形码而言,其内部碱基 A、U、C 和 G 分别用绿色、红色、蓝色和黑色表示,而 AU 和 GC 碱基对则分别以长梳齿以及短梳齿表示以作区分。二维码则通过在线二维码生成网站(https: 30%,以确保二维码在部分缺失时仍可使用。2 结果与分析2.1 序列库基本信息通过对 NCBI 数据库进行序列查找与筛选,构建的序列库共包含 Betacoronavirus 属(5 个亚属,21 种毒株)以及 Alphacoronavirus 属(2 个亚属,2 种毒株)的26 条序列(表 1),平均长度为 31 491 bp。其中,Hibe-covirus、Duvinacovirus 和 Setracovirus 亚属只包含单种单毒株。2.2 单核苷酸与序列多态性过滤掉比对后序列库内的所有缺失位点后,分析结果表明序列库内全基因组序列之间存在较高的单核苷酸多态性(表 2)。其中,保守位点的数目(4 041 个)远小于变异位点的数目(16 681 个),仅占所有分析位点的 19.50%。此外,简约性信息位点和单一变异位点作为两种不同类型的变异位点,它们之间也同样存在很大 的 数 目 与 变 异 位 点 占 比 差 异(15 721,960;94.24%,5.76%)。83第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023表 1 病毒毒株 NCBI 编录号与名称Table 1 Accession numbers and strain names published at NCBI website属Genera亚属Subgenera毒株的 NCBI 序列号与简称Accession numbers and acronyms of strains at NCBI websiteBetacoronavirus EmbecovirusNC_003045.1 Bovine coronavirus(BCoV)NC_006213.1 Human coronavirus OC43(HCoV-OC43)NC_026011.1 China Rattus coronavirus HKU24(ChRCoV HKU24)NC_006577.2 Human coronavirus HKU1(HCoV-HKU1)NC_048217.1,NC_001846.1 Murine coronavirus virus(MCV)NC_012936.1 Parkers rat coronavirus(PRC)HibecovirusNC_025217.1 Bat Hp-betacoronavirus(Hp-BatCoV)MerbecovirusNC_039207.1 Erinaceus coronavirus(EriCoV)NC_038294.1,NC_019843.3 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus(MERS-CoV)NC_009020.1 Pipistrellus bat coronavirus HKU5(Pi-BatCoV HKU5)NC_009019.1 Tylonycteris bat coronavirus HKU4(Ty-BatCoV HKU4)NobecovirusNC_030886.1 Rousettus bat coronavirus GCCDC1(Ro-BatCoV GCCDC1)NC_009021.1 Rousettus bat coronavirus HKU9(Ro-BatCoV HKU9)Sarbecovirus NC_045512.2 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2 reference)MZ622251.1 Alpha B.1.1.7MZ068153.1 Belta B.1.351MZ724466.1 Delta B.1.617.2 MW642248.1 Gamma P.1MZ275302.1 Lambda C.37OM570259.1 Omicron B.1.1.529NC_004718.3 Severe acute respiratory syndrome coronavirus(SARS-CoV)Alphacoronavirus Duvinacovirus NC_002645.1,NC_028752.1 Human coronavirus 229E(HCoV-229E)Setracovirus NC_005831.2 Human coronavirus NL63(HCoV-NL63)表 2 序列库单核苷酸多态性Table 2 Single nucleotide polymorphism in the sequences database位点数量与占比Number and proportion of site保守位点Conserved site变异位点Variable site简约性信息位点Parsimony informative site单一变异位点Singleton site数量4 04116 68115 721960总位点占比/%19.5080.5075.874.63在变异位点内占比/%94.245.76 所有序列的 AU 比 GC 碱基对的平均含量高出21.6%,单倍型多样性为 0.994,核苷酸多样性(0.390 3)和核苷酸替换率(转换率与颠换率之和;0.410 4)均高达0.4 左右,说明序列整体存在较高的多态性(表 3)。而该库的序列转换颠换率比接近 0.7,也意味着这些序列内碱基替换(点突变)主要以转换形式。表 3 序列库序列多态性Table 3 Sequences polymorphism in the sequences databaseGC 碱基对含量GC base-paircontents/%AU 碱基对含量AU base-paircontents/%单倍型多样性Haplotypediversity,Hd核苷酸多样性Nucleotidediversity,核苷酸转换率Nucleotidetransition rate,si核苷酸颠换率Nucleotidetransversion rate,sv转换颠换率比Ratio of si tosv,R39.260.80.994 0 0.390 30.168 80.241 60.698 42.3 序列库内平均遗传距离SARS-CoV-2 分类群的种内平均遗传距离值远小于序列库内与其他病毒毒株之间的种间平均遗传距离值,说明 SARS-CoV-2 及其变种内部的遗传多样性与其他毒株均不相同(图 1)。Hp-BatCoV 和 SARS-CoV 毒株与 SARS-CoV-2 的种间遗传距离最小,三者的核酸序列更具有同源性。HCoVs 分类群的种内平均遗传距离值较高,且该值相近于 HCoVs 分类群与序列库内其他所有病毒毒株之间的种间平均遗传距离值,因此,无论HCoVs 分类群内部或与其他毒株之间均存在较小的序列同源性(图 2)。2.4 序列库内系统发育树系统发育树结果表明,SARS-CoV-2 参考株与其他SARS-CoV-2 变体之间有着显著的同源性(图 3,黄色区域)。对HCoVs分类群的其他毒株(红色区域),它图 1 序列库种内与种间平均遗传距离(SARS-CoV-2 为分类群)Figure 1 Within and between group mean distances ofsequences database(the group:SARS-CoV-2)93第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023们与 SARS-CoV-2 及其变体之间则存在明显的分化差异。其 中 HCoV-HKU1、HCoV-OC43、MERS-CoV 和SARS-CoV 与 SARS-CoV-2 分类群的分化差异逐渐缩小,Alpha-CoV 属的 HCoV-229E 与 HCoV-NL63 毒株则单独被分成一支,与 SARS-CoV-2 的分化差异最大。而HCoVs 分类群之外的其他毒株(白色区域)和 SARS-CoV-2 及其变体之间也存在一定的分化差异。因此,SARS-CoV-2 分类群中存在着大量稳定、关键的遗传标记(SNP 位点)得以将该分类群与其他毒株区分开,而这些遗传标记最终将作为挖掘条形码片段的关键位点。图 2 序列库种内与种间平均遗传距离(HCoVs 为分类群)Figure 2 Within and between group mean distances ofsequences database(the group:HCoVs)图 3 序列库的系统发育树(NJ 法)Figure 3 The phylogenetic tree(NJ)of sequences database2.5 条形码可视化以 SARS-CoV-2 分类群内部序列特有的 SNP 位点(16 681 个)为剪切端,对序列进行片段裁剪并 Blast 比对,最终得到符合要求的 18 条(17 条位于 ORF1ab 基因编码区,1 条位于 S 基因编码区)长度(Length),比对总得分值(Total scores)以及 P 值(P value)均不相同的条形码片段(图 4)。所有符合要求的条形码片段长度均大于 100 bp。这些条形码片段的比对总得分值随着片段长度的增长而上升,同时 P 值则呈现波动式下降。出于鉴定重复性与稳定性的考虑22,本文选取分别位于 ORF1ab 和 S 基因编码区的 2 条得分值最优的条形码片段并将其可视化,其片段全长、比对总得分值以及P 值大小分别为 427 bp,100 bp;789,185;0,0.042 3(图 5)。通过电子移动设备扫描可视化的二维码可以便捷地获得文本形式的条形码片段核酸序列,而该序列的长度与碱基组成信息则在一维条形码中更加直观地表达出来。图 4 位于 ORF1ab 与 S 基因区的所有条形码片段 Blast 比对结果Figure 4 NCBI Blast output of barcode segments in ORF1ab andS gene regions图 5 基于 ORF1ab 与 S 基因区的条形码片段构成的SARS-CoV-2 的组合条形码Figure 5 Combinatorial barcodes of SARS-CoV-2 based onbarcode segments in ORF1ab and S gene regions3 讨论条形码概念提出以来的近 20 年间8,已经在动物23、植物21以及微生物24的物种分类与鉴定方面取得了显著成就。条形码本质作为一种分子遗传标记,和微卫星相似25,同样对病毒的快速鉴定与变异程度检测起到一定的作用。在鉴定山茶科(Theace-ae)18以及兰科(Orchidaceae)21植物的研究中,研究人员均利用纯生物信息学方法筛选到了特异性物种条形码片段,并根据遗传距离以及系统发育树结果证明了条形码确实可以有效地对以上植物物种进行鉴别。利用条形码片段等分子遗传标记可以在物种和种群水平上快速鉴定病毒26。本文首次采用纯生物信04第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023息学方法通过大数据筛选并获得了 SARS-CoV-2 全基因组序列中 ORF1ab 和 S 编码区的 2 条条形码片段,并通过遗传距离与系统发育分析不仅验证了以上条形码片段 能 够 有 效 地 将 SARS-CoV-2 从 Beta-CoV 以 及HCoVs 中鉴别出来而不受 SARS-CoV-2 自身突变的影响,还证实了以上条形码片段对鉴别 SARS-CoV-2 具有很强的稳定性。文内序列库主要由 NCBI 官网所提供的参考序列或已发表的序列构建,而这些序列在确保测序准确性的同时,研究人员也对这些全基因组序列内部基因进行了注释,从而也为查找条形码片段所在基因的位置提供了参考。单核苷酸与序列多态性实验结果也说明序列库内的全基因组序列之间存在极大遗传差异,相比非裂解性纺锤状病毒(Sulfolobus spindle-shaped viru-ses,SSV)27,Beta-CoV 属以及 HCoVs 分类群病毒毒株内部存在更多潜在的 SNP 位点,而这些 SNP 位点将有助于条形码片段的查找。遗传距离分析结果表明,序列库内 SARS-CoV-2 分类群的种内与种间平均遗传距离差值较大,因此 SARS-CoV-2 及其变种之间的内部遗传差异不会影响 SARS-CoV-2 的鉴别。同样,系统发育树结果也表明 SARS-CoV-2 的参考序列与相关突变株之间的内部遗传分化差异非常小,但与 Beta-CoV 属以及 HCoVs 分类群的所有毒株之间遗传分化差异较大。因此,无论在 Beta-CoV 或者 HCoVs 分类群中,条形码片段鉴定 SARS-CoV-2 都具有显著的效果。值得注意的是,在 Saini22以及 Badua28等对 SARS-CoV-2各基因变异水平的研究中,他们发现 ORF1ab 基因序列内部的变异程度远小于 SARS-CoV-2 中的大多数编码区,而且 ORF1ab 的核苷酸突变热点(Nucleotide mu-tation hotspots)位于第 11 083 位核苷酸(5-3)左右。因此选择超过长度 400 bp,截选自 1 600(50 bp)位至2 040(50 bp)位核苷酸的片段,并不会受到因 SARS-CoV-2 变异所造成的条形码难以使用或失效的影响。本研究仍存在一定局限性。首先,NCBI 数据库中测序的全基因组序列含有少量空缺位,导致部分 SNP位点被忽略,筛选到的条形码片段更少。其次,基于RNA 片段鉴定 SARS-CoV-2 的条形码技术目前有待实验验证。实际上,这些空缺位占比不足基因组全长的1%,而且基于大数据的 Blast 比对结果也验证了条形码的鉴别准确性,因此少数被忽略的 SNP 位点不会对条形码片段筛选操作造成较大影响。未来,我们会将得到的可视化组合条形码在在线数据库中公布,并希望能通过实验来验证条形码片段以进一步完善技术流程。参考文献 1 KIRTIPAL N BHARADWAJ S KANG S G.From SARS to SARS-CoV-2 insights on structure pathogenicity and immunity aspects of pandemic human coronaviruses J.Infection Genetics and Evolution 2020 85 104502.2 NIMAVAT N SINGH S FICHADIYA N et al.Online medical education in India-different challenges and probable solutions in the age of COVID-19 J.Advances in Medical Education and Practice 2021 12 237-243.3 SWANSON S J CONANT L L HUMPHRIES C J et al.Changes in descrip-tion naming for common and proper nouns after left anterior temporal lobectomy J.Epilepsy&Behavior 2020 106 106912.4 PENG C HE M CUTRONA S L et al.Theme trends and knowledge struc-ture on mobile health Apps bibliometric analysis J.JMIR mHealth and uHealth 2020 8 7 e18212.5 CHAIMAYO C KAEWNAPHAN B TANLIENG N et al.Rapid SARS-CoV-2 antigen detection assay in comparison with real-time RT-PCR assay for laboratory diagnosis of COVID-19 in Thailand J.Virology Journal 2020 17 1 177.6 冒鑫娥 窦英茹 潘云龙 等.价值链视角下医疗机构在大规模新冠病毒咽拭子采样中全流程应急管理与困境分析 J.江苏卫生事业管理 2022 33 4 456-460.7 章波 刘为勇 侯红艳.550 例 COVID-19 患者血清 IgM 和 IgG 检测结果分析 J.中国感染控制杂志 2021 20 7 592-596.8 HEBERT P D CYWINSKA A BALL S L et al.Biological identifications through DNA barcodes J.Proceedings.Biological Sciences/The Royal So-ciety 2003 270 1512 313-321.9 SHETH B P THAKER V S.DNA barcoding and traditional taxonomy an in-tegrated approach for biodiversity conservation J.Genome 2017 60 7 618-628.10 MINERVINA A A POGORELYY M V KIRK A M et al.SARS-CoV-2 antigen exposure history shapes phenotypes and specificity of memory CD8+T cells J.Nature Immunology 2022 23 5 781-790.11 WESTHAUS A CABANES-CREUS M RYBICKI A et al.High-throughput in vitro ex vivo and in vivo screen of adeno-associated virus vectors based on physical and functional transduction J.Human Gene Therapy 2020 31 9-10 575-589.12 SCHOCH C L CIUFO S DOMRACHEV M et al.NCBI taxonomy a com-prehensive update on curation resources and tools J.Database Oxford 2020 2020 baaa062.13 ROZEWICKI J LI S AMADA K M et al.MAFFT-DASH integrated pro-tein sequence and structural alignment J.Nucleic Acids Research 2019 47 W1 5-10.14 TAMURA K STECHER G KUMAR S.MEGA11 molecular evolutionary genetics analysis version 11 J.Molecular Biology and Evolution 2021 38 7 3022-3027.15 FU Y X.Statistical tests of neutrality of mutations against population growth hitchhiking and background selection J.Genetics 1997 147 2 915-925.16 RETIEF J D.Phylogenetic analysis using PHYLIP J.Methods in Molecu-lar Biology 2000 132 243-258.17 LETUNIC I BORK P.Interactive Tree Of Life iTOL v5 an online tool for phylogenetic tree display and annotation J.Nucleic Acids Research 2021 49 1 293-296.18 JIANG S CHEN F QIN P et al.The specific DNA barcodes based on chloroplast genes for species identification of Theaceae plants J.Physiology and Molecular Biology of Plants 2022 28 4 837-848.19 GONG L ZHANG D DING X et al.DNA barcode reference library con-struction and genetic diversity and structure analysis of Amomum villosum Lour.Zingiberaceae populations in Guangdong Province J.PeerJ 2021 9 e12325.20 CHAVEERACH A TANEE T SANUBOL A et al.Efficient DNA barcode regions for classifying Piper species Piperaceae J.PhytoKeys 2016 70 1-10.21 LI H XIAO W TONG T et al.The specific DNA barcodes based on chlo-roplast genes for species identification of Orchidaceae plants J.Scientific Reports 2021 11 1 1424.22 SAINI S K HERSBY D S TAMHANE T et al.SARS-CoV-2 genome-wide T cell epitope mapping reveals immunodominance and substantial CD8+T cell activation in COVID-19 patients J.Science Immunology 2021 6 58 eabf7550.23 NOIKOTR K CHAVEERACH A PINTHONG K et al.RAPD and barcode analyses of groupers of the genus Epinephelus J.Genetics and Mole