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第 40 卷第 4 期2023 年 8 月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.40No.4August 2023论著收稿日期:2022-03-28基金项目:河北省医学科学研究课题(20200260)作者简介:郭伟(1973),男,副主任医师,研究方向:大肠肛门常见病多发病.E-mail:mrvi7873 基于 Nrf2/HO-1 信号通路研究黛玉膏对肛瘘大鼠血管生成的影响郭 伟1 闫丽霞1 常少青2 刘振丽2(1.保定市第二医院 肛肠科,保定071050)(2.河北省第七医院 影像科,保定073000)摘要:目的观察黛玉膏对肛瘘大鼠血管生成和 Nrf2/HO-1 信号通路的影响。方法将 20 只 SPF 级 SD 大鼠进行综合法构建肛瘘术后创面模型,建模成功后随机分为模型组和黛玉膏组,每组 10 只。黛玉膏组大鼠使用药物涂抹伤口,模型组以 0.9%氯化钠溶液擦洗。另选取 10 只仅造成创口的大鼠作为对照组,也以 0.9%氯化钠溶液擦洗,各组大鼠每天处理 2 次,均连续干预 14 d。观察创面愈合情况及局部血流。ELISA 法检测肛瘘创面组织血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF 受体(VEGFR)、内皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、白细胞介素 IL-1、IL-6、IL-10、大鼠肿瘤坏死因子(TNF-)水平;Western blot 法检测创面组织 Nrf2 及 HO-1 蛋白水平。结果与对照组相比,模型组创面愈合率及血流量显著下降(P0.05),与模型组相比黛玉膏组大鼠创面愈合率和血流量显著升高(P0.05);CD31 染色结果比较,模型组较对照组显著降低(P0.05),黛玉膏组较模型组显著升高(P0.05);肉芽组织 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-比较,模型组较对照组显著升高(P0.05),黛玉膏组较模型组显著降低(P0.05);肉芽组织 VEGF、VEGFR、EGF、PDGF 比较,模型组较对照组显著降低(P0.05),黛玉膏组较模型组显著升高(P0.05);Nrf2、HO-1 蛋白水平比较,模型组较对照组显著降低(P0.05),黛玉膏组较模型组显著升高(P0.05)。结论黛玉膏可以促进肛瘘模型大鼠创面的愈合,促进肉芽组织的血管新生,其机制可能与激活 Nrf2/HO-1 通路有关。关键词:Nrf2;肛瘘;血管新生;黛玉膏;HO-1中图分类号:Q95-3文献标志码:A文章编号:1006-6179(2023)04-0017-06DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2023.04.004Effect of Daiyu Ointment on Angiogenesis in Rats with AnalFistula via Nrf2/HO-1 Signal PathwayGUO Wei1,YAN Lixia1,CHANG Shaoqing2,LIU Zhenli2(1.Department of Proctology,Baoding Second Hospital,Baoding 071050,China)(2.Department of Imaging,Seventh Hospital of Hebei Province,Baoding 073000,China)Abstract:ObjectiveTo observe the effect of Daiyu ointment on angiogenesis and Nrf2/HO-1 signaling pathway in rats with anal fistula.Method 20 SPF-grade SD rats were constructed a post-operative wound model of fistula by comprehensive method,after successful modeling,they were randomly divided into model group and Daiyu paste group,with 10 rats in each group.Rats in the Daiyu paste group applied the wound with drugs,and the model group scrubbed with 0.9%sodium chloride solution.In addition,10 rats with only wounds were selected as the control group,and scrubbed with 0.9%sodium chloride solution,and the rats in each group were treated twice a day,all of which were continuously intervened for 14 days.then the wound healing and local blood flow was observed.Then the rats were sacrificed.实验动物科学40 卷ELISA was used to detect the levels of vascular endothelial growth factor(VEGF),VEGF receptor(VEGFR),epidermal growth factor(EGF),platelet derived growth factor(PDGF),interleukin(IL)-1,IL-6,IL-10,tumor necrosis factor (TNF-)in wound tissues of anal fistula;Western blot was used to detect the protein levels of Nrf2 and HO-1 in the wound tissues.ResultCompared with the control group,the wound healing rate and blood flow of the model group significantly decreased(P0.05).Compared with the model group,the wound healing rate and blood flow of rats in the Daiyu ointment group significantly increased(P0.05);Compared with the control group,CD31 positive area significantly decreased(P0.05),while significantly increased in Daiyu ointment group compared with model group;The levels of IL-1,IL-6,IL-8 and TNF-in granulation tissue were significantly higher in the model group than in the control group(P0.05),and the Daiyu cream group was significantly lower than that in the model group(P0.05);wound tissue VEGF,VEGFR,EGF and PDGF in the model group were significantly higher than those in the control group(P0.05),and the Daiyu ointment group was significantly higher than the model group(P0.05);the levels of Nrf2 and HO-1 protein in the model group were significantly higher than those in the control group significantly higher(P0.05),and the Daiyu ointment group was significantly higher than the model group(P0.05).ConclusionDaiyu ointment can promote the healing of wounds and angiogenesis in anal fistula model rats.The mechanism may be related to the activation of Nrf2/HO-1 pathway.Key words:Nrf2;anal fistula;angiogenesis;Daiyu ointment;HO-1肛瘘是指直肠或肛管与肛周皮肤相通所形成的异常通道,中医称为“肛漏”“痔漏”“穿肠漏”等,为常见肛肠疾病,患病率为 8.6/105例1。肛瘘治疗以手术为主,但术后存在疼痛剧烈、创面愈合缓慢等问题2。中 医 药 外 用 在 肛 瘘 治 疗 中 具 有 独 特 优势3。黛玉膏针对肛瘘湿热郁结而致痈溃不愈的病机而设,能够收湿敛疮、生肌止血,临床研究表明其能缩短创面愈合时间,减轻术后并发症,可能与提高 创 面 血 管 内 皮 生 长 因 子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平有关4。为进一步明确其作用靶点,本研究通过建立大鼠模型,深入探讨其干预的信号通路,为临床应用提供新的依据。1材料和方法1.1材料1.1.1实 验 动 物:10 周 龄 雄 性 SPF 级 SD 大 鼠(20020)g 共 30 只,购于北京维通利华实验动物技术有 限 公 司,生 产 许 可 证 号【SCXK(京)2021-0011】,使用许可证号【SYXK(京)2017-0023】。适应性饲养 5 d,室温(222),采用 12 h 12 h 昼夜间断照明,自由饮食饮水。本实验已通过保定市第二 医 院 福 利 伦 理 审 查,审 查 编 号:IACUC-20210307-12。1.1.2主要试剂和仪器:黛玉膏(由保定市第二医院药剂科加工制备,组成成分:煅炉甘石 7.5 g,煅石膏 107.5 g,赤石脂 7.5 g,青黛 50 g,滑石 100 g,黄柏 50 g,药物混合充分研磨成粉,过 100 目筛 2 次,加入麻油调成膏剂备用);大鼠 VEGF ELISA 检测试剂盒、大鼠血管 VEGFR ELISA 检测试剂盒(上海将来实业股份有限公司)、大鼠血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)ELISA 检测试剂盒(北京诺为生物技术有限公司)、大鼠表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)ELISA 检测试剂 盒、大 鼠 白 细 胞 介 素(interleukin,IL)-1 ELISA 检测试剂盒、大鼠 IL-6 ELISA 检测试剂盒、大鼠 IL-10 ELISA 检测试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-,TNF-)ELISA 检测试剂盒(均碧云天生物技术研究所)、兔抗核因子 2 相关因子 2(nuclear factor erythroiD-2-related factor 2,Nrf2)一抗(ab137550)、兔 抗 血 红 素 氧 合 酶 1(heme oxygenase-1,HO-1)一抗(ab52947)、兔抗 CD31 一抗(ab182981)、兔抗-actin 一抗(ab8227),试剂购自艾博抗(上海)贸易有限公司。PeriFlux 5000 型激光多普勒血流仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);5804R 高速冷冻离心机(德国 艾 本 德 股 份 公 司);奥 林 巴 斯 生 物 显 微 镜 OLYMPUS BX43(日本奥林巴斯株式会社);BioTek 81第 4 期郭伟等:基于 Nrf2/HO-1 信号通路研究黛玉膏对肛瘘大鼠血管生成的影响 ELx808 酶标仪(美国伯腾仪器有限公司);164505电泳系统、ChemiDoc XRS+化学发光成像系统(伯乐公司)。1.2方法1.2.1大鼠肛瘘模型的建立及分组:采用综合法构建肛瘘术后创面大鼠模型5-6,术前备皮,5%戊巴比妥钠(戊巴比妥 40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,肛门部手术区备皮消毒,采用创伤制作器在脊柱旁侧0.5 cm 处切割直径约为 1.8 cm 的圆形创口,且肌层伤口深度约为 0.3 cm,止血后在创面上加粪液1 mL,固定(油纱、敷料、胶带),48 h 后去除覆盖物,若见伤口有脓性分泌物与粪臭味出现,表示造模成功。将成功建立的 20 只肛瘘术后创面大鼠,根据随机数字表,按大鼠体质量随机分为模型组(n=10)及黛玉膏组(n=10);另选择 10 只仅造成创口后不敷以粪液作为对照组。黛玉膏组大鼠使用药物涂抹伤口,对照组和模型组以 0.9%氯化钠溶液擦洗,纱布包扎伤口,每天 2 次。造模成功后当天开始治疗,各组大鼠均连续干预 14 d,后以过量麻醉药注射处死,收集创面组织用以后续实验。1.2.2创面愈合情况及局部血流监测:于第 3 天药物干预结束后,采用透明格子胶片测量局部创面面积,创面愈合率=【原始创面面积(术后 3 d)-当前创面面积药物干预结束】/原始创面面积术后 3 d100%7。应用激光多普勒血流仪,所有大鼠均记录随机 3 处创面血流情况,并经 Power Lab Chart 数据采集分析系统计算 3 处创面血流取均值进行分析。1.2.3HE 染色:中性多聚甲醛固定创面组织,并用石蜡包埋,乙醇梯度脱水,二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片。将切片进行粘片、烤片,脱蜡,梯度乙醇复水后进行抗原修复。用 CD31 抗体染色(1 300)。封片后光学显微镜下观察阳性染色。1.2.4ELISA 操作步骤:取肛瘘创面组织匀浆检测VEGF、VEGFR、EGF、PDGF、IL-1、IL-6、IL-10、TNF-水平,严格按照说明书操作,将标准品按照说明书操作方法梯度稀释后,另取待测样品孔加样 50 L并设空白孔,后于每孔加入酶标试剂 50 L(空白孔除外),封板膜封板并置 37 恒温箱温育 60 min,每孔加满洗涤液静置 15 s 弃去,重复 5 次,先后加入显色剂 A、B 各 50 L,37 避光显色 15 min,加终止液 50 L,450 nm 波长依序测量各孔的吸光度并进行浓度计算。1.2.5Western blot 法检测 Nrf2 及 HO-1 表达水平:采用 Western blot 法检测创面组织 Nrf2 及 HO-1蛋白水平。使用 RIPA 高效组织裂解液提取总蛋白,BCA 法测定蛋白浓度并加入 5SDS 蛋白上样缓冲液(按 1 4 的 比 例)煮 沸 后 备 用。每 孔 加 入40 g 样品或 3 L Marker 进行电泳,浓缩胶电压90 V,20 min,分离胶电压 120 V,45 min,电泳后转膜,3%BSA(体积分数 0.5%TBST)封闭 1 h。孵育一抗,分别用 Nrf2 兔单克隆抗体(1 1 500)、HO-1兔单克隆抗体(1 1 500),-actin 兔单克隆抗体(1 2 000),4 孵育过夜,后以 TBST 洗 3 次。山羊抗兔 IgG(1 5 000)室温下孵育 1 h 后,TBST 洗 3次,每次 5 min。ECL 曝光显影,Image J 图像处理软件分析结果。1.3统计学分析 采用 SPSS 27.0 统计分析软件,计量资料以均数标准差(xs)表示。组内和组间进行两两比较时,若满足正态分布且方差齐性采用 Students t 检验;若服从正态分布但方差不齐,则用 Welch s t-test;若非正态分布,则用 Mann-Whitney U test,P 0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠的创面愈合率比较 与对照组相比,模型组和黛玉膏组的创面愈合率显著下降(P0.05);与模型组相比,黛玉膏组大鼠创面愈合率显著升高(P0.05);与对照组比较,模型组和黛玉膏组显著下降,而黛玉膏组较模型组显著升高(P0.05)(表 1)。表 1各组大鼠的创面恢复情况比较(xs,n=10)Table 1Comparison of wound recovery ineach group of rats(xs,n=10)组别创面愈合率/%创面血流量(mL/min)对照组91.546.12175.665.47模型组25.244.8983.567.72黛玉膏组63.887.21#120.398.73#注:与对照组比较,#P0.05;与模型组比较,P0.05Note:Compared with control group,#P0.05;Compared with model group,P0.052.2各组大鼠创面 CD31 阳性率比较 CD31 免疫组化染色结果显示(图 1),与对照组比较,模型组肉芽组织 CD31 染色阳性面积显著降低,差异具有统计学意义(P0.05);与模型组相比,黛玉膏组大鼠肉芽组织,CD31 染色阳性面积显著升高,差异具有统计学意义(P0.05)。91 实验动物科学40 卷注:与对照组相比,P0.05;与模型组相比,#P0.05Note:Compared with control group,P0.05;Compared with model group,#P0.05图 1各组大鼠创面组织 CD31 染色结果比较(100,xs,n=10)Fig.1Comparison of CD31 staining results in wound tissues of rats in each group(100,xs,n=10)2.3各组大鼠肉芽组织炎性因子水平比较与对照组比较,模型组和黛玉膏组大鼠肉芽组织 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-水平均显著增高,差异具有统计学意义(P0.05);与模型组相比,黛玉膏组大鼠肉芽组织 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-水平均显著下降,差异具有统计学意义(P0.05),见表 2。表 2各组大鼠肉芽组织炎性因子水平比较(xs,n=10,ng/mL)Table 2Comparison of inflammatory factor levels in granulation tissue of rats in each group(xs,n=10,ng/mL)组别IL-1IL-6IL-8TNF-对照组21.0614.786.782.3459.269.22319.249.74模型组451.9915.7237.849.11115.3310.97842.6412.59黛玉膏组231.4215.24#26.658.70#83.839.22#677.1914.48#注:与对照组比较,#P0.05;与模型组比较,P0.05Note:Compared with the control group,#P0.05;Compared with the model group,P0.052.4各组大鼠肉芽组织血管生成调控因子水平 与 对 照 组 比 较,模 型 组 肉 芽 组 织 VEGF、VEGFR、EGF、PDGF 水平均显著降低,差异具有统计学意义(P0.05);与模型组和对照组相比,黛玉膏组大鼠肉芽组织 VEGF、EGF、PDGF 水平均显著增高,差异具有统计学意义(P0.05);与模型组相比,黛玉膏组大鼠肉芽组织 VEGFR 显著增高(P0.05),见表 3。表 3各组大鼠肉芽组织血管生成调控因子水平比较(xs,n=10)Table 3Comparison of levels of angiogenic regulatory factors in granulation tissue of rats in each group(xs,n=10)组别VEGF(pg/mL)VEGFR(pg/mL)EGF(ng/mL)PDGF(pg/mL)对照组330.4110.08186.142.33216.598.41241.8911.08模型组227.6911.4389.046.18168.119.87165.9715.54黛玉膏组472.6011.89#181.637.74344.298.81#486.1710.49#注:与对照组比较,#P0.05;与模型组比较,P0.05Note:Compared with the control group,#P0.05;Compared with the model group,P0.052.5各组大鼠创面组织 Nrf2、HO-1 蛋白的表达水平比较与对照组相比,模型组的 Nrf2、HO-1 蛋白显著降低(P0.05);与模型组和对照组相比,黛玉膏组大鼠创面组织 Nrf2、HO-1 蛋白的表达水平均显著升高,差异具有统计学意义(P0.05),见图 2。3讨论肛管直肠瘘,简称肛瘘,为肛管或直肠腔与肛门外皮肤相通的一种异常管道,中医亦称“痔漏”“漏疮”“单漏”8。瘘最早见于 素问 生气通天论篇:“陷脉为瘘,留连肉腠”。医宗金鉴外科心法要诀痔疮篇释曰“破溃而出脓血,黄水浸淫,淋漓久不止者,为漏”。肛瘘一般由内口、瘘管和外口三部分组成,也有只有内口或外口者9。内口多为原发性,多数位于肛窦内。外口是继发的,在肛门周围皮肤上,口不只一个10。其特征为瘘管内口多位于肛窦内,管道穿过肛门直肠周同组织,外口位于肛周皮肤,经常有脓性分泌物由外口流出,每因外口闭合而致局部肿痛,继而在原外口处或附近重新溃破出脓,如此反复发作,经久不愈11。中医学将肛02第 4 期郭伟等:基于 Nrf2/HO-1 信号通路研究黛玉膏对肛瘘大鼠血管生成的影响 注:与对照组比较,#P0.05;与模型组比较,P0.05Note:Compared with the control group,#P0.05;Compared with the model group,P0.05图 2各组大鼠创面组织 Nrf2、HO-1 蛋白的表达水平比较(xs,n=10)Fig.2Comparison of expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins in wound tissues of rats in each group(xs,n=10)瘘的病因归纳为肛痈溃后、虚痨久咳、外感六淫、饮食不节、内伤七情、痔久不愈、肛周气血运行不足,而致毒邪集聚,最终穿肠透穴,败坏肌肉,消损骨髓,而为之瘘12。黛玉膏针对肛瘘的病机而设,方由煅炉甘石、煅石膏、赤石脂、滑石、青黛、黄柏组成,其中煅炉甘石、煅石膏、滑石、赤石脂性平味甘,入肝、胃经,能够收湿敛疮,青黛、黄柏苦寒能够清热燥湿解毒;诸药相合,共奏燥湿解毒、拔腐生新之功4。以往的临床研究表明,黛玉膏外用能够减轻肛瘘患者术后创面的疼痛,促进创面愈 合,其机制可 能与增加创 面 VEGF 表达、促进创面血管生成和成纤维细胞聚集有关4。VEGF 对血管内皮细胞的迁移、扩散、分化具有重要作用,是目前已知的作用最强的促血管生长因子,此外也能促进肉芽生长,加速上皮化13。CD31 表达于血管内皮细胞,血小板等,是标记组织中血管的经典指标。研究通过建立大鼠肛瘘模型研究发现,使用综合法造模能成功建立肛瘘模型,而黛玉膏能够促进创面愈合、减轻创面病理损伤,抑制炎性因子表达而促进血管生成相关因子的表达,提高创伤部分血管数量和血流量。目前,关于黛玉膏发挥创面修复作用的基础研究较少,但关于其组分的药理作用已有报道。如煅石膏可以通过水通道蛋白(aquaporin,AQP)升高 AQP1、AQP3 的表达,促进急性软组织损伤的修复14;炉甘石可以促进肉芽组织中的新生毛细血管生成,增加受损创面的血供,加速创面恢复15;青黛能够促进皮损和黏膜创伤愈合,近期研究表明其能抑制皮损的炎性细胞浸润16;减轻网络药理学分析表明,黄柏中的有效成分能够靶向炎性和血管新生通路相关分子治疗创面损伤17。以上数据表明使用综合法造模能成功建立肛瘘模型,而黛玉膏可能通过促进创面局部的血液循环、抑制炎性反应而加速肛瘘的好转。创面愈合过程中,肉芽的生长速度和质量是愈合的关键18。为进一步探索其促进血管新生、增高血流量促进愈合的机制,本研究进一步检测了 Nrf2/HO-1 信号通路的表达水平。Nrf2 转录调控因子,在细胞面对不良环境刺激时 可被激活19。激活后Nrf2 与内源性抑制因子 Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH associated protein1,Keap1)结合,发生核转位并 与抗氧化反 应元件(antioxidant response element,ARE)结 合,调 控 下 游 基 因 表达20。其中 HO-1 的启动子区富含 ARE 区域,是Nrf2 下游最重要的基因之一21。HO-1 是一种可将血红素降解产生胆绿素、亚铁离子和一氧化碳的水解酶,大量研究已经报道了 HO-1 在创伤愈合、肿瘤以及其他疾病中是重要的调控血管新生的因子22。如 HO 敲除小鼠表现出皮肤伤口愈合障碍及血管新生减少23;类似的,使用小分子化合物抑制 HO-1/CO 信号可以 显著降低血 管新生水平24。另 外,Nrf2/HO-1 信号通路可以上调诸多血管新生因子的表达,如 EGF、VEGF 和 PDGF25。最后,有文献报道了 Nrf2/HO-1 与炎性因子的表达密切相关26。本研究结果显示,模型组大鼠创面组织的 Nrf2 及HO-1 的水平较对照组显著降低,而涂抹黛玉膏后,Nrf2 及 HO-1 的水平升高,表明其可以激活 Nrf2/HO-1 通路从而发挥促进血管新生的作用。综上,本研究结果表明,黛玉膏可以促进肛瘘模型大鼠创面的愈合,促进肉芽组织的血管新生,其机制可能与激活 Nrf2/HO-1 通路有关。但血管新生涉及多条信号通路,因此黛玉膏的药理作用还有待进一步研究。12 实验动物科学40 卷参 考 文 献 1 LEE M J,HEYWOOD N,ADEGBOLA S,et al.Systematic review of surgical interventions for Crohns anal fistula J.BJS Open,2017,1(3):55-66.2 HALLIGAN S,TOLAN D,AMITAI M M,et al.ESGAR consensus statement on the imaging of fistula-in-ano and other causes of anal sepsis J.Eur Radiol,2020,30(9):4734-4740.3 周鹏飞,颜帅,刘佃温,等.中医药治疗肛周慢性创面的研究进展 J.四川中医,2019,37(3):212-214.4 杨艳黎,薛亭,潘友珍,等.黛玉膏对湿热下注型肛瘘术后创面血管生成和 VEGF 表达的影响 J.上海中医药大学学报,2020,38(6):30-35.5 谢昌营,赵晓娟,吴成成,等.肛门洗剂对肛瘘模型大鼠TGF-1/p-Smad3/MMP-1 信号 通路蛋白的影响 J.中 成药,2016,38(1):167-169.6 凌水莲,张昊悦,王业皇.橡皮生肌膏对大鼠肛瘘术后创面愈合的影响及机制研究 J.世界中医药,2020,15(10):40-43.7 瞿胤,张志君,芦亚峰,等.促愈熏洗方促进肛瘘术后大鼠肛门部创面修复效果及机制探究 J.陕西中医,2021,42(7):823-826.8 倪羽佳,隋华,周琪,等.益气生血法治疗肛瘘术后切口愈合缓慢的机理探讨 J.浙江中医药大学学报,2019,43(8):753-756.9 MEI Z,WANG Q,ZHANG Y,et al.Risk Factors for recurrence after anal fistula surgery:a 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