基于microRNA探讨补肾养精颗粒对高龄小鼠卵母细胞质量的影响.pdf

基于 探讨补肾养精颗粒对高龄小鼠卵母细胞质量的影响王 昭付凌宇武丽丽刘鹏飞于 潇刘金星(.山东中医药高等专科学校山东 烟台.山东中医药大学附属医院山东济南)摘要 目目的的 基于颗粒细胞 和 探讨补肾养精颗粒对高龄小鼠卵母细胞质量的影响 方方法法 采用/小鼠雌性 周龄 只、月龄 只雄性 周龄 只 雌性 周龄小鼠作为青年组将 月龄小鼠随机分为高龄组、补肾养精低剂量组、补肾养精高剂量组各 只 补肾养精低、高剂量组分别给予补肾养精颗粒./、/灌胃青年组和高龄组给予同等体积生理盐水灌胃均连续干预 收集卵母细胞记录获卵数、卵母细胞成熟率进行体外受精培养至.记录体外受精率和囊胚率用 试剂盒检测卵母细胞线粒体膜电位用活性氧()试剂盒检测卵母细胞线粒体 含量 法检测颗粒细胞 和 表达量 结结果果与青年组比较高龄组小鼠获卵数、卵母细胞成熟率、体外受精率和囊胚率、卵母细胞线粒体膜电位均明显降低(均.)卵母细胞线粒体 含量和颗粒细胞 、表达量均明显增高(均.)与高龄组比较补肾养精高剂量组小鼠获卵数、卵母细胞成熟率、体外受精率、卵母细胞线粒体膜电位均明显增高(均.)补肾养精高剂量组卵母细胞线粒体 含量和补肾养精低、高剂量组颗粒细胞 、表达量均明显降低(均.)结结论论 补肾养精颗粒可能通过下调 和 表达减少颗粒细胞凋亡促进颗粒细胞增殖从而提高卵母细胞质量关键词 高龄小鼠卵母细胞颗粒细胞 补肾养精颗粒:./.中图分类号 文献标识码 文章编号 ()作者简介 王昭女博士讲师研究方向为月经病和不孕症通信作者 刘鹏飞 :.基金项目 山东省自然科学基金项目()山东省中医药科技项目()国家自然科学基金项目()山东省中医药重点学科(鲁卫中医药科教字 号)(.):././.().()现代中西医结合杂志 ()().(.)(.).(.)(.).:目前医学界虽然未对高龄妇女年龄作出明确界定但是根据“高龄产妇”的概念习惯上将 岁以上称之为高龄妇女 女性在 岁之后生育力逐渐开始下降尤其是 岁后生育力出现断崖式下降这与女性年龄相关的卵子数量减少和质量降低造成的卵巢储备功能减退()密切相关 据统计女性在 岁时不孕症发生率约为 随着年龄的增长不孕症的发生率越来越高在 岁时可达 随着医学技术的发展辅助生殖技术给不孕不育患者带来了福音但是高龄所导致的不孕依然是辅助生殖技术的难点 实验和临床研究均证实补肾类中药可以提高生殖能力 补肾养精颗粒是山东省名中医刘金星教授在三十余年临床经验的基础上结合“四二五合方”加减化裁而成用于月经病、不孕症等疾病的治疗效果显著 本研究从颗粒细胞 角度出发探讨了补肾养精颗粒对高龄小鼠卵巢储备功能的影响旨在为其临床应用提供理论基础 实验材料与方法 动物/小鼠雌性 周龄 只、月龄 只雄性 周龄 只体重 均购自北京唯尚立拓科技有限公司生产许可证号:(京)小鼠均饲养于山东中医药高等专科学校中心实验室室温 左右湿度 自由饮水和摄食 本实验操作符合动物伦理要求由山东中医药大学附属医院动物伦理委员会审核批准()药物 补肾养精颗粒由熟地 、当归 、白芍、川芎、菟丝子、枸杞子、盐车前子 、制五味子、覆盆子、川牛膝、醋香附、炒枳壳 、党参 、炙淫羊藿 、盐知母、益母草 组成颗粒剂购自江阴天江药业 试剂及仪器 试剂盒购自山东思科捷生物技术有限公司(提取试剂盒货号:反转录试剂盒货号:试剂盒货号:)试剂盒()、活性氧()检测试剂盒(货号:)购自碧云天孕马血清(货号:)、人绒毛膜促性腺激素(货 号:)、透 明 质 酸 酶(货 号:)购自索莱宝矿物油(货号:)购自 体视显微镜()荧光倒置显微镜()超净台(苏州净化 )培养箱()实时定量 仪(公司)实验方法 只雌性 周龄小鼠作为青年组将 只 月龄小鼠随机分为高龄组、补肾养精低剂量组、补肾养精高剂量组每组 只雄性小鼠不予以分组仅标记编号 按照人和小鼠等效剂量换算标准补肾养精低、高剂量组分别给予补肾养精颗粒./(./)、/(./)灌胃青年组和高龄组给予同等体积生理盐水灌胃均连续干预 精子制备方法提前制作小鼠精子受精液获能滴和受精滴平衡一夜 处理雌鼠前约 脱颈椎处死雄鼠腹部 酒精消毒 剖腹取出附睾尾在提前准备好的获能滴中于附睾尾中间处剪开使精子充分流出放于 、培养箱中获能.为受精备用 检测指标及方法现代中西医结合杂志 ()获卵数及卵母细胞成熟率灌胃干预第 天各组雌性小鼠均腹腔注射 后腹腔注射 注射 后脱颈椎处死小鼠 酒精消毒背部剖开取下输卵管壶腹部在体式显微镜下用 注射器划破输卵管透明膨大壶腹部收集卵丘 卵母复合物()用透明质酸酶脱颗粒细胞 反复清洗后收集卵母细胞以第一极体排出作为卵母细胞成熟的标志分别记录获卵数及成熟卵母细胞的数量计算卵母细胞成熟率 体外受精率与囊胚率将卵母细胞用平衡过夜的受精液清洗后放入提前准备好的受精滴中用上游法优化精液取 获能.的上游精子加入受精滴放至、培养箱培养 用受精液清洗后移至平衡 的 液滴中反复清洗洗掉卵子周围的精子 培养至二细胞观察二细胞率即受精率 将受精卵培养至.计算囊胚率 卵母细胞线粒体膜电位 每组取 个 期卵母细胞于 液滴中加入 染色工作液放入 、培养箱孵育 孵育结束后用 清洗卵母细胞注意避光 送至荧光倒置显微镜下观察拍照检测 单体时使用绿色荧光将激发光设置为 发射光设置为 检测 单体聚合物时使用红色荧光将激发光设置为 发射光设置为 用 软件分析目标条带的光密度值以红色荧光与绿色荧光比值衡量卵母细胞线粒体膜电位 卵母细胞线粒体 含量 每组取 个 期卵母细胞于 液滴中加入 稀释的 放入、培养箱孵育.孵育结束后清洗卵母细胞注意避光 迅速送至荧光倒置显微镜下拍照观察使用绿色荧光将激发光设置为 发射光设置为 用 软件分析目标条带的光密度值 颗粒细胞 和 表达量灌胃干预第天腹腔注射 后脱颈椎处死 酒精消毒剖腹取卵巢用 冲洗多遍后转移至高糖/培养基中 在体式显微镜下用 注射器针头刺破卵泡以充分释放颗粒细胞 加入胰酶反复吹打细胞悬液分离成团的颗粒细胞置于 、培养箱中消化 完成消化后加入完全培养基终止消化静置 目细胞滤网过滤轻取细胞悬液于离心管中 /离心 弃上清加入完全培养基轻轻吹打制成细胞悬液计数后分装于细胞培养瓶中置于 、培养箱中培养每 换液 次 待细胞长满至瓶底 时收集颗粒细胞加入 提取总 按照试剂盒说明将 反转录成 实时荧光定量采取 反应体系:.(/).(/).反应程序:预变性 变性 退火 个循环 延伸 延伸 采用 法分析数据引物由山东思科捷生物技术有限公司合成引物序列见表 表 引物序列基因名称上游引物序列下游引物序列退火温度/统计学方法采用 .软件进行数据统计分析计量资料若满足正态分布和方差齐性数据采用均数 标准差()表示多组比较采用单因素方差分析两两比较采用 检验若不满足正态分布或(和)方差齐性采用秩和检验计数资料采用构成比表示组间比较采用卡方检验 以 为差异有统计学意义 结 果 各组小鼠获卵数、卵母细胞成熟率比较 高龄组、补肾养精低剂量组、补肾养精高剂量组获卵数、卵母细胞成熟率均明显低于青年组(均.)补肾养精高剂量组获卵数、卵母细胞成熟率均明显高于高龄组(均.)补肾养精高剂量组获卵数明显高于补肾养精低剂量组(.)见表 各组小鼠体外受精率和囊胚率比较 高龄组、补肾养精低剂量组、补肾养精高剂量组受精率、囊胚现代中西医结合杂志 ()表 青年组和高龄各组小鼠获卵数、卵母细胞成熟率比较组别只数获卵数/(个)卵母细胞成熟率/(个/个)青年组.(/)高龄组.(/)补肾养精低剂量组.(/)补肾养精高剂量组.(/)注:与青年组比较.与高龄组比较 .与补肾养精低剂量组比较.率均明显低于青年组(均.)补肾养精高剂量组受精率明显高于高龄组和补肾养精低剂量组(均.)见表 各组小鼠卵母细胞线粒体膜电位和 含量比较与青年组比较高龄组、补肾养精低剂量组、补肾养精高剂量组线粒体膜电位均明显降低(均 表 青年组和高龄各组小鼠体外受精率和囊胚率比较组别只数成熟卵母细胞/个受精卵/个囊胚/个受精率/囊胚率/青年组.高龄组.补肾养精低剂量组.补肾养精高剂量组.注:与青年组比较.与高龄组比较.与补肾养精低剂量组比较.)线粒体 含量均明显增高(均.)与高龄组比较补肾养精高剂量组线粒体膜电位明显增高(.)线粒体 含量明显降低(.)见表 及图、图 各组小鼠颗粒细胞 和 表达量比较 高龄组、补肾养精低剂量组、补肾养精高剂量组 表达量和高龄组、表 青年组和高龄各组小鼠卵母细胞线粒体膜电位和 含量比较()组别只数线粒体膜电位(红色荧光/绿色荧光)线粒体 含量青年组.高龄组.补肾养精低剂量组.补肾养精高剂量组.注:与青年组比较.与高龄组比较.图 青年组和高龄各组小鼠卵母细胞线粒体膜电位检测荧光染色情况()补肾养精低剂量组 表达量均明显高于青年组(均 .)补肾养精低、高剂量组 和 表达量均明显低于高龄组(均.)且补肾养精高剂量组均明显低现代中西医结合杂志 ()图 青年组和高龄各组小鼠卵母细胞线粒体活性氧表达荧光染色情况()于补肾养精低剂量组(均.)见表 表 青年组和高龄各组小鼠颗粒细胞 和 表达量比较()组别只数 青年组.高龄组.补肾养精低剂量组.补肾养精高剂量组.注:与青年组比较.与高龄组比较 .与补肾养精低剂量组比较.讨 论 是一种大小 个核苷酸的内源性非编码小 广泛存在于真核细胞 目前在人类基因中发现一千余个 其中/参与了人类蛋白质的表达和调控同时也参与了人类的多个生理、病理过程 和 同属于 家族该家族高度参与了细胞的增殖、分化和凋亡等 相关研究发现卵巢早衰患者与健康女性的血浆中存在部分差异基因表达卵巢早衰会上调 、表达 、可通过多途径促进细胞凋亡 王英研究报道采用戊酸雌二醇片和补肾为主的中药治疗卵巢早衰患者可明显下调 和 表达 海派朱氏妇科传人朱南孙根据“肾主生殖”的理论提出补肾活血治疗卵巢早衰的原则临床研究证实补肾活血法可以通过降低 过度表达减少卵泡颗粒细胞凋亡引发的卵泡闭锁提高血清抗缪勒管激素()水平改善卵巢早衰中山大学团队研究发现加味八珍方可能通过降低 和 表达而改善卵巢早衰大鼠的卵巢功能 杨延周等对大鼠卵巢颗粒细胞体外培养研究发现过表达的 会诱导大鼠卵泡闭锁促进颗粒细胞凋亡而抑制 表达对卵泡发育和颗粒细胞没有明显影响提示颗粒细胞 的异常表达可能是导致大鼠卵泡闭锁的主要原因并进一步证实了 是通过靶向调节缝隙连接蛋白()而实现的 孙婧研究发现 有促进颗粒细胞凋亡、抑制颗粒细胞增殖和雌激素分泌作用推测其可能是通过调节下游的靶基因环磷腺苷效应元件结合蛋白 而实现的 等发现卵巢早衰患者血浆中 含量明显升高其可能是通过靶向 和 信号通路级联诱导人类颗粒细胞凋亡的 等认为 和 通过靶向 促进人类颗粒细胞凋亡或者说 和 直接靶向 后通过 途径促进颗粒细胞凋亡 目前对于如何下调 和 改善卵巢早衰尚无具体定论这也正是本课题研究的方向线粒体作为卵母细胞中数量最多的细胞器不仅是卵母细胞发育过程中能量的主要提供者而且也参与其他的细胞活动如减数分裂纺锤体的形成调节细胞内钙离子的浓度参与细胞氧化还原反应控制细胞的凋亡与老化等所以线粒体近年来也常常被作为卵母细胞质量评价的指标 随着年龄的增加 期卵母细胞中的线粒体膜电位逐渐降低是造成线粒体功能障碍降低高龄女性生育力的重要原因 线粒体通过氧化磷酸化为细胞供能同时也会制造副产物 的过度积累会引发氧化应激反应使细胞膜受损导致线粒体 突变、缺失影响 的产生造成卵母细胞发育障碍、损伤降低卵母细胞发育潜能在胚胎中表现为卵裂球溶解出现细胞碎片素问上古天真论言:“女子四七筋骨坚发长极身体盛壮五七阳明脉衰面始焦发始堕七七任脉虚太冲脉衰少天癸竭地道不通故形坏而无子”指出了女性在五七的年纪身体由“盛壮”逐渐走向“衰”肾气开始出现减弱气血现代中西医结合杂志 ()暗耗 卵巢内的卵泡属于生殖之精此时由于肾气的不足导致可以募集的卵泡数量和质量降低卵泡发育障碍无法排出 刘金星教授认为肾虚是高龄 不孕的根本主张“补肾填精益气养血”拟定了补肾养精颗粒方中四物汤补血养血五子衍宗丸填补肾精二者共奏补血填精之效且精血同源二者共用效果相得益彰 配伍二仙汤中仙灵脾和知母取其温补肾阳之意与四物汤、五子衍宗丸共奏阴阳双补之效且配伍应用温阳而不助热 酌加党参补中益气与四物汤共奏气血双补之效 香附、枳壳理气行滞防止久服行呆腻之弊川牛膝引血下行益母草活血化瘀与香附、枳壳共行行气活血之效使全方补而不滞本实验结果显示高龄组小鼠获卵数、卵母细胞成熟率、体外受精率和囊胚率、卵母细胞线粒体膜电位均明显低于青年组卵母细胞线粒体 含量和颗粒细胞 、表达量均明显高于青年组与高龄组比较补肾养精高剂量组小鼠获卵数、卵母细胞成熟率、体外受精率、卵母细胞线粒体膜电位均明显增高补肾养精高剂量组卵母细胞线粒体 含量和补肾养精低、高剂量组颗粒细胞 、表达量均明显降低 结合既往研究分析补肾养精颗粒可能是通过降低卵巢颗粒细胞 和 的表达抑制颗粒细胞凋亡促进颗粒细胞增殖从而提高卵母细胞的质量增加优质卵子获取数量提高受精率 但目前对于 的具体生物功能和调节机制仍知之甚少有待确定其相应的靶基因和调节途径在分子水平解开 的神秘面纱利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 邢长英.高龄女性生育力变化及诊治进展.世界临床药物():.?.():.曹颖.补肾调冲方通过抑制 改善小鼠卵母细胞质量的研究.天津:天津医科大学.彭艳丽.补肾填精法治疗 的临床观察及对小鼠卵巢 信号转导的影响.广州:广州中医药大学.郑伟李瑞娟薛玲等.补肾养精颗粒治疗肾虚型卵巢储备功能减退异常子宫出血的临床观察.中华中医药杂志():.郑伟张芳张若乾等.补肾养精颗粒对卵巢储备功能减退不孕患者周期性预处理的疗效.实用医学杂志():.王晶.资冲颗粒对反复超促排卵小鼠卵母细胞质量影响的分子机制研究.成都:成都中医药大学.康莉娜.改善老龄化卵母细胞成熟和质量的探索性研究.武汉:华中科技大学.王珺晓李凤卿刘建伟等.研究进展.医学综述():.陈妍郎立敏臧树成等.()对细胞凋亡的调控作用.中国兽医学报():.():.():.王英.和 在卵巢早衰患者治疗前后的差异及疗效评估可行性.实用医学杂志():.宋靖宜夏艳秋董莉.基于 与 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