不同灌注方法及灌注量对大鼠脑组织及神经元固定的影响_徐一菲.pdf

书书书第 卷 第期 微 量 元 素 与 健 康 研 究 年 月 收稿日期：作者简介：徐一菲（），女，博士，中医诊断学专业。通讯作者：刘燕，高级实验师。不同灌注方法及灌注量对大鼠脑组织及神经元固定的影响徐一菲，云小雯，李宇轩，宋丹丹，郭圣盈，覃睿洁，刘燕（北京中医药大学中医学院，北京 ；湖南师范大学生命科学院，长沙 ）摘要：目的：探究不同灌注方法及灌注量对大鼠脑组织结构及神经元观察的影响并进行评价。方法：将 只 大鼠随机分成组，经戊巴比妥钠麻醉后，分别采用输液器、注射器，剪右心耳或剪肝的方法进行灌注操作，比较不同灌注方法下脑组织大体形态、灌注时间及用液量的差异，并采用 染色及免疫荧光技术对大鼠脑海马组织及神经元形态进行观察，客观化评价灌注方法选择对形态学呈现结果的影响。结果：采用输液器灌注与注射器灌注法在用时及灌注液用量方面有显著差别（），两种方法采取右心耳引流时对大鼠脑海马组织和神经元的呈现效果基本一致，均优于剪肝引流法。结论：灌注方法的选择对大鼠脑组织及神经元固定的效果有影响，实验时长及灌注液用量对实验结果影响不显著。关键词：大鼠；脑组织；灌注；神经元；客观化评价中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（.，；.，）：，：（），：；随着神经科学的不断发展和深入研究，脑组织切片、免疫荧光技术成为神经学研究的主要方法之一。在组织切片之前，需对组织进行固定，因为固定好的组织能抑制细胞内溶酶体酶的释放和活性，防止自溶；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败，使细胞的蛋白质、脂肪、糖等各种成分凝固成不溶性物质，以防止物质扩散，维持原有组织的形态结构，并且固定后的组织对染料有不同的亲和力，染色后可产生不同的折射率，颜色更为清晰鲜明，便于观察硬化组织，便于切片。故动物在体脑组织的固定效果对实验结果尤为重要。目前脑组织固定方法主要有：离体浸润固定和在体经心灌注固定法。离体浸润固定简单易行，但第 卷 第期 微 量 元 素 与 健 康 研 究 年 月 是整块脑组织浸没于固定液，固定液不能以相同的速度迅速到达组织的各个部位，所以固定效果差。它仅适用于有一定硬度且形态较易维持的组织，如肝、心和肾等，不适用于较软组织。脑组织柔软易变形，且内部神经丰富，操作不慎易导致脑组织变形受损，影响实验结果的观察。通过大鼠天然的循环系统直接进行内灌注固定，可使固定液快速、均匀地分布到脑组织各个部位，所以脑组织标本制备多采用此方法。脑组织内灌注有经心脏灌注、经颈总动脉灌注、经股动脉灌注等方法，由于后两种方法操作难度大且费时所以逐渐被淘汰。经心灌注固定法在中枢神经系统相关疾病的研究中应用十分广泛，它对脑和脊髓组织的快速冲洗固定作用是任何一种离体固定法都无法替代的。灌注过程中可采用夹闭腹主动脉、胸主动脉等方法提高灌注效率；目前常用的灌注针主要包括静脉输液器针、动脉置留针、自制灌流针，和普通针头等。尽管已有部分文献描述了经心灌注固定的方法，但尚无对灌注效果进行同标准下的观察，且未明确统计灌注耗液量。本研究在检索并整理现有灌注方法的基础上，按照同一标准设计不同灌注方法，从灌注时间、大体观察、脑组织呈现情况及神经元固定效果等多个角度对灌注效果进行客观化评价，以供科研工作者参考。材料与方法 材料实验动物与分组：健康成年清洁级 大鼠 只，雄性，常规条件下饲养，自由饮水，普通饮食。利用随机数字表将大鼠分为输液灌注组 只、剪肝组 只、实验组（剪右心耳组）只。主要 试 剂 和 器 材：生 理 盐 水、多 聚 甲 醛、戊巴比妥钠、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）、二甲苯（国药集团化学试剂有限公司）、缓冲液（）、一抗 （）、荧光二抗 标记山羊抗小鼠（）。正置光学显 微镜 及 成 像 系 统（，日本）、静脉输液器（包含输液瓶、输液管、三通、针头）、注射器、灌注针头（小鼠灌胃针）、止血钳、组织剪、眼科剪、组织镊。方法手术操作：手术前用 浓度的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，大鼠麻醉后仰卧于操作台上，迅速打开胸腔，用血管钳钝性分离心包膜，充分暴露心脏，同时暴露升主动脉。分别按种不同方式对组实验大鼠进行灌流。输液灌注组：将分别装有生理盐水和多聚甲醛的输液瓶悬吊于距离操作台 高的位置，左手持止血钳夹住心尖少部，右手用连接有生理盐水输液瓶的注射针头，从心尖略偏左下进入左心室，有突破感表明插入成功，并向上推送至升主动脉，用止血钳固定，打开腹腔，结扎腹主动脉，剪破右心耳，打开静脉输液器开关，先用生理盐水灌注，观察输液器管液体流动是否顺畅，当从右心耳流出澄清液体时，不拔出灌注针，更换输液管，换多聚甲醛，待大鼠头后仰，前肢剧烈抽动，前肢及颈部僵硬，表明灌注固定完成。随后断头取脑，之后将脑组织置于多聚甲醛中固定保存。剪肝组：提前准备好装有生理盐水和多聚甲醛的 注射器，左手捏持心脏，右手持剪刀在心尖处剪一小口，将灌注针插入左心室并向上推送至升主动脉，止血钳固定，并打开腹腔结扎腹主动脉。剪碎肝脏，先用生理盐水灌注，当肝脏颜色变白或变褐色，即可更换多聚甲醛，待大鼠头后仰，前肢剧烈抽动，前肢及颈部僵硬时，表明灌注固定完成。实验组：其他方法同剪肝组，从心尖处插入灌注针后，结扎腹主动脉，剪破右心耳，先用生理盐水灌注，当从右心耳流出澄清液体时，即可更换多聚甲醛，待大鼠头后仰，前肢剧烈抽动，前肢及颈部僵硬时，表明灌注固定完成。观察指标 大体观察拍照记录断头取脑后脑组织的质地、硬度、脑组织颜色是否变白。多聚甲醛的用量、灌注时间记录灌注时间是从针进入心尖开始至灌注固定成功所用时间。石蜡切片与 染色将经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等步骤的石蜡切片进行 染色。染色步骤为：依次将切片放入二甲苯、无水乙醇及 酒精中脱蜡至水；苏木素染液染 ；、的梯度酒精脱水各 ；伊红染液染色 ；脱水透明后封片；于显微镜下观察并拍照。标记神经元免疫荧光染色石蜡切片脱蜡至水后，置于盛满柠檬酸抗原修复液的修复盒中于微波炉内中进行抗原修复，自然冷却后用 洗涤洗次，每次 ；滴加牛血清第 卷 第期 微 量 元 素 与 健 康 研 究 年 月 白蛋白孵育 封闭；加一抗（）孵育过夜；用 洗次，每次 ，加入 标记的山羊抗小鼠二抗避光室温孵育 ；用 洗涤次，每次 ，滴加 染液复染细胞核，避光室温孵育 后用 洗去；封片后于荧光显微镜下观察并拍照。结果 三种灌注方法大鼠脑组织大体观察实验结果（图略）显示，从脑组织的外观、色泽、硬度三方面进行观察：注射器剪右心耳组及输液器剪右心耳组无明显差异，注射器剪肝组脑组织上有明显的血液残留，脑组织硬度也较其余两组差。不同灌注方法的灌注用时及用量见表。表三种灌注方法比较组别灌注方法引流位置是否结扎腹主动脉灌注用时（）多聚甲醛用量（）第组输液器灌注右心耳否 第组注射器灌注右心耳是 第组注射器灌注肝是 注：与输液器灌注法比较，。结果表明：注射器灌注剪右心耳组、注射器灌注剪肝组灌注用时及多聚甲醛用量明显少于输液器灌注剪右心耳，差异有统计学意义（）。不同灌注方法的脑组织及神经元形态观察染色显示剪右心耳组灌注的脑组织切片组织结构清晰，无共染现象，组织切片完整均匀，海马区组织、细胞形态正常，未见扩张的毛细血管。剪肝组大脑皮层及海马区组织水肿，细胞周围间隙增宽，胞体肿胀，部分细胞境界模糊不清，核着色不良。免疫组织荧光观察神经元细胞核免疫荧光染色显示剪肝组部分视野可见神经元水肿，神经元边缘模糊，显色状态不清晰。其余两组神经元形态以及染色效果无明显差异。讨论病理标本的制作和组织切片都必须先进行固定。如果固定不佳，染色就难以进行。新生大鼠脑组织切片常用于对新生大鼠脑形态学影响的研究，比如免疫组化、细胞凋亡等实验。组织的固定是形态学研究中不可缺少的重要步骤。组织的固定有以下作用：抑制细胞内溶酶体酶的释放和活性，防止自溶；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败，使细胞的蛋白质、脂肪、糖等各种成分凝固成不溶性物质，维持原有的组织形态结构；固定后的组织对染料有不同的亲和力，染色后可产生不同的折射率，颜色更为清晰鲜明，便于观察，硬化组织，便于切片。还可将抗原固定在原位，保持其抗原性，使抗原能准确可靠地显示出来。总体而言，固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤；心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定，避免了组织的自溶现象，经过灌注的脑组织，可去除红细胞背景影响，是脑组织切片观察的常用方法；多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。此外，灌注针的选择在实验中至关重要。本实验中统一选择小鼠灌胃针作为灌注针头，灌注针为银色，比起透明的自制灌流针，可以清楚地观察到针头是否准确进入目标部位，方法更为方便，且小鼠灌胃针前端钝圆不容易刺穿血管、心肌，可降低肺循环风险。本实验的创新性在于：采用统一的标准对三种常见的脑灌注方法进行比较，并将其量化，通过比较灌注使用时间、多聚甲醛消耗量、染色以及免疫荧光效果，更加直观地呈现出结果；注射器剪肝组虽然耗时耗液较少但是固定效果较差，大脑皮层及海马区组织水肿，细胞周围间隙增宽，胞体肿胀，有些细胞境界模糊不清，核着色不良。免疫荧光观察部分视野可见神经元水肿，神经元边缘模糊，显色状态不清晰。输液器剪右心耳组及注射器剪右心耳组均能较好地固定脑组织，能较好地保留脑组织形态及神经元，但是从实验结果可知输液器剪右心耳组的耗时耗液均多于注射器剪右心耳。综上所述，我们提出推论，注射器剪右心耳在耗时耗液较少的情况下能够较好固定脑组织，优于其他两种灌注方式。参考文献：陈广斌，谢玲，林坚涛不同固定方法对新生大鼠脑组织切片的影响中国民康医学，（）：季正剑，张冬霞，张立波，等大鼠在体脑组织灌流方法的比较实验动物与比较医学，（）：李宝红，贺旭，于培兰，等用于脑缺血小鼠海马 表达的改进灌注固定法动物学杂志，（）：季正剑，张冬霞，许小媛，等大鼠在体脑组织灌流方法的优化 全国动物生理生化第十第 卷 第期 微 量 元 素 与 健 康 研 究 年 月 一次学术交流会论文摘要汇编 卢文朋，栗世方大鼠脑组织灌注固定方法的改进医学研究生学报，（）：王章敬，李煌元静脉输液器应用在小鼠体脑组织 灌 注 方 法 微 量 元 素 与 健 康 研 究，（）：代小思脑组织局部灌注固定的改良及体会四川解剖学杂志，（）：陈浩宇，高亚兵，彭瑞云，等一种改进的大鼠脑组织灌注固定方法军事医学科学院院刊，（）：收稿日期：作者简介：王琳琳（），女，住院医师，研究生，呼吸系病专业。通讯作者：杨晓东。在低氧性肺动脉高压中的表达及临床意义王琳琳，刘铭宇，刘丽云，杨晓东（佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 ）摘要：目的：探讨低氧性肺动脉高压患者血浆中 表达水平及临床意义。方法：选取住院治疗的 患者 例（实验组），依据心脏超声所测的肺动脉收缩压将患者分为轻度 组、中度 组、重度 组；同时在患者组中依据是否吸烟及戒烟是否超过一月以上，分为吸烟组、未吸烟组、戒烟组。健康体检者 例（对照组）。收集所有研究对象的基本信息、超声心动图所测的肺动脉收缩压、血气分析中动脉血氧分压、血浆 水平等指标。结果：各组血浆 均高于健康对照组（）；轻度 组血浆 低于中度 组（）；中度 组血浆 低于重度 组（）；各组 （）明显低于健康对照组（）；各组血浆 与 、吸烟情况呈正相关（），与 呈负相关（）。结论：血浆 在 中高表达，并且各组间血浆 水平随着严重程度增高而升高，外周血 表达水平有助于判断疾病严重程度，并为早发现、早治疗低氧性肺动脉高压提供了简易的检测指标。关键词：低氧性肺动脉高压；解偶联蛋白；肺动脉收缩压中图分类号：文献标识码：文章编号：（）肺动脉高压（，）是一种因各种原因引起肺动脉压力异常升高的一种病理生理状态，随着逐年进展最终发展为慢性肺源性心脏病。低氧性肺动脉高压（，）是 依 据 年 与 修订的肺动脉高压分类中的一个类型，在临床上与肺部疾病关系密切，常常出现在慢性缺氧疾病晚期患者中，比如患有慢性高原病、睡眠呼吸暂停综合征、慢性阻塞性肺疾病、间质性肺疾病等疾病的患者。有研究显示，在 的病理变化中长期处于低氧条件下会产生过量的活性氧（，），而过量的 会促使肺动脉