不同比例的α-生育酚及α-生育三烯酚抗氧化能力的比较_任颖.pdf

，收稿日期：；修回日期：基金项目：中央引导地方科技发展资金：猪用生育三烯酚饲料添加剂新产品的开发及作用机制研究（赣科发计字【】号）。作者简介：任颖（），女，硕士，研究方向为动物营养与饲料学。通讯作者：马立保（），男，副教授，研究方向为猪的营养与代谢调控；王艳青（），女，副教授，研究方向为反刍动物的营养需要及矿物质营养的研究。不同比例的生育酚及生育三烯酚抗氧化能力的比较任颖，赵嘉楠，孙海辉，京芳华，代志凯，廖英俊，黄辉其，王艳青，马立保（华中农业大学动物科学技术学院动物医学院，湖北 武汉 ；宜春大海龟生命科学有限公司，江西 宜春 ）摘要为了探究不同比例的生育酚及生育三烯酚抗氧化能力的大小，共开展个试验。试验一设置 个不同比例的生育酚及生育三烯酚，分别为生育酚（组）、生育酚生育三烯酚 （组）、生育酚生育三烯酚 （组）、生育酚生育三烯酚 （组），生育酚及生育三烯酚之和均为 ，测定其羟自由基清除率、超氧阴离子清除率。试验二选用与试验一相同比例的生育酚及生育三烯酚，与猪小肠上皮细胞（）共培养后加入敌草快（，）处理，用 法测定细胞活力，用流式细胞仪测定细胞内活性氧含量。试验结果表明不同比例的生育酚与生育三烯酚对羟自由基的清除率存在差异，其中 组羟自由基清除率显著高于 组（），其余各组间无显著性差异；超氧阴离子清除率也受生育酚与生育三烯酚比例的影响，组超氧阴离子清除率显著高于 组（），、组极显著高于 组（）。细胞培养试验表明敌草快处理后极显著降低了细胞活力（），预处理组细胞活力显著高于敌草快处理组（），预处理组细胞活力极显著（）高于敌草快处理组，组抵抗敌草快氧化应激的效果最佳；不同比例的生育酚与生育三烯酚对细胞内活性氧的含量也有显著的影响，与 组相比，加入敌草快后，各试验组细胞内活性氧含量极显著上升（），与 组相比，、组细胞内活性氧含量均显著下降（），组细胞内活性氧含量极显著下降（），与 组相比，、组细胞内活性氧含量显著下降（）。因此不同比例的生育酚及生育三烯酚的抗氧化能力不同，其中生育酚生育三烯酚 时，其羟自由基清除率、超氧阴离子清除率最高；对 细胞的预保护作用最好，抗氧化能力最佳。关键词生育酚；生育三烯酚；抗氧化；活性氧；细胞中图分类号 文献标志码文章编号 （），（，；，）：，：（），（），（），（），（）（），（任颖等：不同比例的生育酚及生育三烯酚抗氧化能力的比较 年第期 ），（），（）（），（），（），（），（），（），（），：；氧化应激会产生过多的自由基，使细胞内抗氧化系统失衡。当细胞中活性氧（）的产生超过细胞的抗氧化能力时，就会发生氧化应激，从而导致脂质、和蛋白质等大分子受损，并导致疾病。在动物整个养殖生产过程中，氧化应激随时存在，如仔猪断奶应激、转群应激等。氧化应激会破坏肠道结构，诱导上皮细胞凋亡和坏死。肠道上皮是消化吸收营养物质和抵抗病原体的关键屏障，肠道上皮损伤阻碍了仔猪的生长发育，降低了仔猪的抗病能力，制约了养猪效益。所以，寻找安全而有效的方法来维持肠道的氧化还原平衡，抵御肠道氧化应激值得研究。维生素 是动物体必需的维生素，具有抗氧化活性，主要由生育酚和生育三烯酚两大类组成，其中每类具有种同分异构体。生育酚是维生素的形式之一，以其较高的生物利用度和广泛的抗氧化能力引起了人们的关注，主要存在于绿色植物、玉米油和花生油中，早先被认为是抗氧化能力、生物学活性最强的形式，是真正的“维生素”。随着研究的深入，生育三烯酚的抗氧化能力也逐渐被人们发现，且强于生育酚。生育三烯酚主要存在于米糠油、棕榈油中，有研究表明，生育三烯酚能通过减弱氧化应激、神经炎症和细胞凋亡来增强糖尿病动物模型的认知功能，具有神经保护作用。此外，米糠油中的生育三烯酚可以通过抑制羟甲基戊二酰辅酶 还原酶（还原酶）来降低胆固醇的合成。且生育三烯酚在中和大鼠肝脏和脂质体膜的过氧自由基和过氧化方面要强于生育酚 。除此之外，在 （人脐静脉内皮细胞）中，棕榈生育三烯酚降低硫代巴比妥反应性物质（）的能力比生育酚更有效，抑制脂质过氧化的能力更强。然而，生育三烯酚的生物利用度低于生育酚，生育三烯酚在大鼠体内的生物利用度有限，约为 ，与其吸收率低和代谢速度快有关。研究表明，生育三烯酚的吸收率低，因为生育酚和生育三烯酚主要依靠生育酚转运蛋白（）被动吸收，对生 育 酚 有 很 高 的 亲 和 力（），但 对生育三烯酚的亲和力只有生育酚的 ；另外，生育三烯酚的代谢快，在人 体 血 浆 中，生 育 三 烯 酚 的 半 衰 期 约 为 ，而生育酚的半衰期为 左右。生育三烯酚的抗氧化能力更强但生物利用度较低，目前满足动物对维生素的需要量，主要还是以生育酚的形式添加到饲料中，如何在保证动物对维生素需要的前提下提高抗氧化能力值得研究。因此，本研究设置个不同比例的生育酚及生育三烯酚，通过两个试验，旨在探究不同比例的生育酚及生育三烯酚的抗氧化能力。试验材料与方法 试验材料生育酚油（含生育酚 ）、生育酚与生育三烯酚油（生育酚 ，生育三烯酚 ，宜春大海龟生命科学有限公司）；敌草快（），阿拉丁；超氧阴离子清除能力检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；甲基紫（）、猪小 肠 上 皮 细 胞（细 胞）、任颖等：不同比例的生育酚及生育三烯酚抗氧化能力的比较 年第期 、胎牛血清、（甲氧基硝基苯基）（硝基苯基）（，二磺酸苯）四唑单钠盐（）、探针等。试验方法 维生素的浓缩与制备维生素的浓缩与制备见图。不同比例的生育酚及生育三烯酚体外抗氧化活性的测定 体系可产生羟基自由基。在比色管中依次加 入 ，样品，（），最终用 的 溶液补齐至，用分光光度计在 处测定吸光值。超氧阴离子清除率采用试剂盒进行测定。不同比例的生育酚及生育三烯酚细胞抗氧化活性测定 细胞培养将 细胞置于含有 胎牛血清、青霉 素（）和 链 霉 素（）的 培养基中，在 、含 和 空气的培养箱中培养。为了探究不同比例的生育酚及生育三烯酚对敌草快诱导的肠上皮细胞氧化应激的预防作用，将 细胞分为个处理组，处 理 情 况 见 表 所 示。不 同 比 例 的 样 品（）加入 孔板内预处理细胞，再加入敌草快（）处理细胞，处理结束后检测各组细胞活力及细胞内活性氧含量。细胞活力检测 在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物，反应后颜色深浅与细胞增殖成正比。样品预处理细胞，敌草快处理后加入 试剂孵育 ，在 处测定吸光值。表试验处理及分组试验分组预处理处理 组 组 生育酚敌草快 组 （生育酚生育三烯酚）敌草快 组 （生育酚生育三烯酚 ）敌草快 组 （生育酚生育三烯酚）敌草快 组敌草快 细胞内活性氧的检测样品预处理细胞，敌草快处理后，收集不同处理组的细胞用 探针孵育 ，洗涤两次后，用流式细胞仪检测细胞内活性氧含量。数据分析数据采用 和 进行单因素方差分析，结果均用“平均值标准差”表示，表示有统计学意义。任颖等：不同比例的生育酚及生育三烯酚抗氧化能力的比较 年第期结果 不同比例的生育酚及生育三烯酚对羟自由基清除率、超氧阴离子清除率的影响羟自由基清除率、超氧阴离子清除率如图所示，不同比例的生育酚和生育三烯酚清除羟自由基的能力不同，组羟自由基的清除能力显著高于 组（）。在总生育酚和生育三烯酚浓度不变的情况下，生育三烯酚的含量越高，清除羟自由基的能力越强。组清除超氧阴离子的能力相较于 组显著上升（），、组清除超氧阴离子的能力较 组极显著上升（），、组之间无显著差异（）。图不同比例的生育酚及生育三烯酚的羟自由基清除率、超氧阴离子清除率 不同比例的生育酚及生育三烯酚对细胞抗氧化活性的影响 不同比例的生育酚及生育三烯酚对细胞活力的影响 细胞细胞活力检测结果如图所示。图不同比例的生育酚及生育三烯酚处理后的细胞活力与对照组相比，加入敌草快使细胞氧化应激后，细胞活力极显著下降（），但 组细胞活力显著（）、组细胞活力极显著（）高于 组；组细胞活力显著高于 组（），组细胞活力极显著高于 组（）；组细 胞 活 力 极 显 著 高 于 组（）。结果显示：不同比例的生育酚及生育三烯酚均可预防细胞的氧化应激，且随着生育三烯酚的浓度增加抗氧化应激的效果增强，其中，生育酚生育三烯酚 时，预防氧化应激效果最佳。不同比例的生育酚及生育三烯酚对细胞内活性氧的影响 细胞处理后用流式细胞仪测定细胞内活性氧含量，结果如图所示。敌草快处理后细胞内活性氧含量均极显著高于对照组（）；与 组相比，生育酚和生育三烯酚预处理均使细胞内活性氧含量下降，其中 、组与 组差异显著（），组与 组差异极显著（）；、组细胞内活性氧含量均显著低于 组（）。讨论 不同比例的生育酚及生育三烯酚清除羟自由基、超氧阴离子的比较活性氧（）主要包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等，对活性氧（）的清除能力常用于评价抗氧化物的抗氧化能力。抗氧化剂能够清除体内产生的氧自由基，切断过氧化链反应，抑制脂质过氧化。有研究表明：的生育酚可清除 的羟自由基，这与本试验结果一致。在本试验中：的生育酚可清除 的羟自由基，且随着生育三烯酚含量的增加。这是因为生育酚及生育三烯酚的苯环上都存在酚羟基，具有还原性，能捕捉进入脂膜的自由基，从而阻断自由基的链式反应，清除活性氧。但生育酚的抗氧化能力取决于本身的结构，不同结构的生育酚供任颖等：不同比例的生育酚及生育三烯酚抗氧化能力的比较 年第期 氢能力及键解离能力不同，生育酚苯环上的酚羟基有个邻甲基取代基，苯环上甲基数量最多，其作为维生素 的生理活性最强，但抗氧化能力较差。有研究表明，生育酚在体内的生理活性顺序为生育酚生育酚生育酚生育酚，而体外抗氧化的顺序则完全相反。生育三烯酚侧链上存在不饱和链，使其更容易进入界面区域，导致抗氧化能力及自由基清除能力大大增加 ，所以生育三烯酚的抗氧化能力大于相应的生育酚。这符合本试验生育三烯酚的含量越高，其抗氧化能力和自由基清除率越强的结果。图不同比例的生育酚及生育三烯酚处理后细胞内活性氧含量生育酚主要是通过质子耦合电子转移反应清除超氧阴离子，且质子耦合电子转移反应通过色满醇环上的甲基将电子转移给超氧阴离子形成氧原子，甲基的增多促进了质子耦合电子转移反应的进行。维生素只能在体外脂质和磷脂匀浆溶液中清除超氧阴离子 ，在水溶液中的体外抗氧化反应中，生育酚及生育三烯酚均不能有效清除超氧阴离子，只能轻微抑制过氧自由基的生成。然而，在本试验中，生育酚可清除 的超氧阴离子，且添加生育三烯酚的比例越高，清除超氧阴离子的能力越强。这可能是因为本试验中采用是 溶解的 油和米糠油提取物，为生育酚和生育三烯酚提供了体外脂质环境。此外，李琴等 通过动物实验发现，生育酚还可以增加 的表达，抑制细胞色素 的表达，进而抑制超氧阴离子的产生。不 同 比 例 的生 育 酚 及生 育 三 烯 酚 对 细胞氧化应激的预保护作用敌草快是农业上广泛应用的一种除草剂，可以被绿色植物吸收，转化为过氧化物自由基。有研究表明，敌草快可以诱导肠上皮细胞产生氧化应激和损 伤，常 用 的 建 模 浓 度 为 敌 草 快 ，。细胞是一种非转化、非致瘤性 小 肠 上 皮 细 胞 系，广 泛 应 用 于 益 生 菌 筛选、肠道免疫和炎症研究 以及真菌毒素研究 等。为了评估不同比例的生育酚及生育三烯酚对肠道上皮细胞氧化损伤的保护作用，我们建立了敌草快诱导的 细胞氧化应激模型，并测定了同一浓度下不同比例的生育酚和生育三烯酚对氧化损伤的预防作用。氧化应激会导致细胞损伤，从而导致细胞活力下降。（甲氧基硝基苯基）（硝基苯基）（，二磺酸苯）四唑单钠盐（）是一种传统的评价细胞活力的方法，被认为是评价细胞损伤的综合指标。在电子耦合剂的作用下被细胞中线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物。生成的甲瓒产物的数量与活细胞的数量呈正比，使用酶标仪在 波长处测定吸光值可间接反映活细胞的数量。在本实验中，法测定细胞活力结果显示敌草快能显著降低细胞活力，但不同比例的生育酚和生育三烯酚预处理均能缓解 导致的细胞活力下降，其中比例为 时效果最佳，与体外清除羟自由基的结果一致。细胞内活性氧（）的检测是基于 介导 的 非 荧 光 的 ，二 氯