鲍曼不动杆菌感染HeLa细...与YY1互作的差异蛋白鉴定_丁文一.pdf

第 33 卷第 1 期2023 年 2 月生物技术Biotechnology33(1):9Feb.,2023 收稿日期:2022-05-09 基金资助:国家自然科学基金项目(81900074)作者简介:丁文一(1983-),女,北京人,本科,技师,E-mail:dwy2311 。通讯作者:安志远(1985-),男,硕士,主管技师,研究方向:鲍曼不动杆菌及其毒力因子与宿主免疫系统相互作用,发表中文核心期刊论文 7 篇、SCI 文章 3 篇,E-mail:mran850712 。鲍曼不动杆菌感染 HeLa 细胞与 YY1 互作的差异蛋白鉴定丁文一1,安志远2(1.中国医学科学院北京协和医院检验科,北京 100730;2.首都医科大学附属北京朝阳医院医学研究中心,北京 100020)摘要:目的 鉴定鲍曼不动杆菌感染 HeLa 细胞前后与 YY1 互作的差异蛋白。方法 用脂质体转染法在 HeLa 细胞中过表达 YY1;之后用 Co-IP 技术捕获与 YY1 相互作用的蛋白质;最后利用高效液相色谱质谱联用技术鉴定互作差异蛋白。用 GO 注释和 KEGG 分析预测蛋白质的功能。结果 经 Co-IP 和蛋白银染发现鲍曼不动杆菌感染组和YY1 捕获组与 IgG 组比较在 45 55 kDa 和 70 100 kDa 处有明显的差异条带;质谱结果显示 YY1 捕获组的特有蛋白有 81 个,GO 注释和 KEGG 分析表明这些差异蛋白定位于细胞核及核膜,具有 RNA 结合功能,主要参与了 RNA 剪切的生物学过程;与 IgG 组和 YY1 捕获组比较在鲍曼不动杆菌感染组中获得了 SFRS4、CPSF2、LUC7L2 和 U2AF65 这些差异蛋白。GO 注释和 KEGG 分析表明这些差异蛋白定位于细胞核散斑,具有 RNA 结合功能,主要参与了 mRNA 剪切和核输出的生物学过程。结论 鲍曼不动杆菌感染的 HeLa 细胞中与 YY1 作用的蛋白均参与了 RNA 剪切过程,提示鲍曼不动杆菌很可能利用这些蛋白来调节 YY1,为进一步研究鲍曼不动杆菌与 YY1 的相互作用机制奠定了基础。关键词:鲍曼不动杆菌;转录因子 YY1;Co-IP/MS 技术;HeLa 细胞;生信分析中图分类号:378.99 文献标识码:A DOI:10.16519/ki.1004-311x.2023.01.0002Identification of differential proteins interacting with YY1in HeLa cells infected by Acinetobacter baumanniiDING Wen-yi1,AN Zhi-yuan2(1.Department of Clinical Laboratory,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy ofMedical Sciences,Beijing 100730,China;2.Medical Research Center,Beijing Chaoyang Hospital,CapitalMedical University,Beijing 100020,China)Abstract:Objective To identify the differential proteins interacting with YY1 before and after infection of HeLa cells byAcinetobacter baumannii.Method YY1 was overexpressed in HeLa cells by lipofection;Then,the protein interacting withYY1 was captured by Co-IP method;Finally,the interacting differential proteins were identified by high performance liquidchromatography-mass spectrometry.GO annotation and KEGG analysis were used to predict protein function.Result By Co-IP and silver staining,it was found that there were significant difference bands at 45-55 kDa and 70-100 kDa betweenAcinetobacter baumannii infection group and YY1 capture group and IgG group;The results of mass spectrometry showed thatthere were 81 unique proteins in YY1 capture group.GO annotation and KEGG analysis showed that these differential proteinswere located in the nucleus and nuclear membrane,and had RNA binding function,mainly participated in the biological processof RNA splicing;Compared with IgG group and YY1 capture group,SFRS4,CPSF2,LUC7L2 and U2AF65 were obtained inAcinetobacter baumannii infection group.GO annotation and KEGG analysis showed that these differential proteins located innuclear speckles,and had RNA binding function,mainly involved in the biological process of mRNA shearing and nuclear ex-port.Conclusion In Acinetobacter baumannii infected HeLa cells,the proteins that interact with YY1 are involved in the RNAcleavage process.This suggesting that Acinetobacter baumannii may use these proteins to regulate YY1,which lays a foundationfor further study on the interaction mechanism between Acinetobacter baumannii and YY1.Keywords:Acinetobacter baumannii;transcription factor YY1;Co IP/MS technology;HeLa cells;bioinformatics analysis 鲍曼不动杆菌是一种革兰氏阴性机会致病菌,常引起肺炎、败血症等感染性疾病,医院获得性感染多与此菌相关。近年来由于抗生素的滥用,已经产生了泛耐药和全耐药的鲍曼不动杆菌,给临床治疗带来了极大困难1-2。鲍曼不动杆菌引起宿主免疫系统炎症反应的机制主要在于其释放的含毒力物质生 物 技 术2023 年的囊泡和菌体外膜蛋白3-5。笔者在前期研究中已发现鲍曼不动杆菌及其外膜蛋白与宿主的免疫系统诸多分子有相互作用,并且干扰宿主的炎症、凋亡、自噬相关通路6-8。Yin-Yang1(YY1)又被称为阴-阳 1,是广泛分布于细胞核的一种转录因子,是一种高度保守的锌脂蛋白。该蛋白通过染色体重塑和组蛋白修饰参与抑制和激活了多种基因的启动子9-10。研究表明,YY1 在调节自噬、凋亡、肿瘤生长等多种生物进程中发挥重要作用11-13。YY1 介导的这些调节作用肯定不是其在单独发挥作用,必然是 YY1 和一些蛋白相互作用才能实现。这就提示需首先鉴定出与YY1 相互作用的特异性蛋白,这样才能为今后的研究提供可选择的分子靶点。另外,笔者在前期研究中发现鲍曼不动杆菌可以通过干扰转录因子 YY1 来影响自噬降解进程,从而加重小鼠肺组织的炎症性损伤。但直到目前还不清楚鲍曼不动杆菌对 YY1 的干扰是直接作用还是通过了何种分子产生的间接作用。所以笔者通过免疫共沉淀串联蛋白质谱技术鉴定 HeLa 细胞中与YY1 相互作用的特异性蛋白,并利用鲍曼不动杆菌感染 HeLa 细胞后与 YY1 互作蛋白产生的变化,找到鲍曼不动杆菌与 YY1 相互作用的具体辅助蛋白,为进一步研究这些分子在鲍曼不动杆菌干扰 YY1的深层机制提供依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料鲍曼不动杆菌 19606 和人宫颈癌上皮细胞 He-La 细胞均购自美国 ATCC;pcDNA3.1-YY1 过表达质粒由笔者实验室保存。1.1.2 试剂Lipofectamine3000 转染试剂盒,美国 Invitrogen;IP Lysis Buffer,美国 Thermo Fisher;Protein A/G,美国 Santa Cruz 公司;蛋白银染试剂盒,北京索莱宝科技有限公司。1.1.3 仪器电泳设备(MINI-PROTEAN TETRA)及凝胶检测设备(GEL DOC XR),美国伯乐;质谱检测及分析由北京青莲百奥生物科技公司完成。1.2 方法1.2.1pcDNA3.1-YY1 过表达载体转染 HeLa细胞 用脂质体转染法,参照 Lipo3000 转染试剂说明将预先构建好的 YY1 过表达质粒 pcDNA-3.1-YY1 和对照质粒 pcDNA3.1(+)分别转染至 HeLa细胞,待转染 48 h 后留取细胞蛋白备用。1.2.2鲍曼不动杆菌感染过表达 YY1 的 HeLa细胞 用 MOI=10 的鲍曼不动杆菌感染已转染 pcD-NA3.1-YY1 后 48 h 的 HeLa 细胞 24 h,之后留取细胞蛋白用于免疫共沉淀。1.2.3免疫共沉淀 Co-IP 技术捕获与 YY1 相互作用的蛋白 用 PBS 洗涤 HeLa 细胞 3 次,加入 Lysis buffer500 L,冰上孵育10 min,4 离心10 min,留取上清即为细胞蛋白溶液。在制备好的蛋白溶液中加入YY1 人源单克隆抗体 2 g,对照组加入人源 IgG 单克隆抗体1 g,在4 冰箱中用旋转摇床孵育过夜。取出后加入 Protein A/G 50 L,4 旋转孵育 4 h,3 000 r/min 离心 5 min,弃上清,留沉淀。用 Lysisbuffer 500 L 清洗沉淀 3 次。最后在沉淀中加入4 L蛋白 Loading buffer,离心后取上清进行 SDS-PAGE 凝胶电泳。1.2.4 蛋白质银染用索莱宝科技公司的蛋白银染试剂盒,参照说明书操作,全部操作均在室温下完成。用固定液固定 PAGE 蛋白凝胶 30 min;将凝胶转移至敏化液中作用 30 min;之 后 用 去 离 子 水 漂 洗 3 次,每 次10 min;转入银染液中作用 30 min,期间用水平摇床不断摇晃;最后将凝胶转移至显色液中,显示 5 min;弃去显色液加入终止液终止显色。用 BIO-RAD 蛋白成像系统对银染凝胶进行拍照留存。1.2.5 高效液相色谱-质谱联用技术鉴定实验由北京青莲百奥生物科技公司完成。主要实验步骤:首先加入脱色液(50 mmol/L NH4HCO3与 ACN(11)对胶粒脱色,脱色完全后加入乙腈脱水至胶粒变白