茶园扁刺蛾生防菌筛选、鉴定及其发酵条件优化_贺望兴.pdf

贺望兴，谢小群，杨普香，等.茶园扁刺蛾生防菌筛选、鉴定及其发酵条件优化J.福建农业学报，2022，37（11）：14631469.HE W X,XIE X Q,YANG P X,et al.Identification and Culture Optimization of Effective Biocontrol Agent on Thosea senensis for TeaPlantationsJ.Fujian Journal of Agricultural Sciences，2022，37（11）：14631469.茶园扁刺蛾生防菌筛选、鉴定及其发酵条件优化贺望兴1,2，谢小群1,2，杨普香1,2*，李文金1,2，李延升1,2，江新凤1,2，毛平生1,2（1.江西省蚕桑茶叶研究所，江西南昌330203；2.江西省经济作物研究所，江西南昌330203）摘要：【目的】筛选适宜生态有机茶园防治扁刺蛾的生防菌。【方法】采用温度筛选法从自然罹病死亡的扁刺蛾肠道体内初筛生防菌，浸液饲喂法测定生防菌对扁刺蛾幼虫的室内毒力；综合菌株的形态特征、分子生物学鉴定以及构建的系统发育树分析进行菌株的鉴定；通过单因素和正交试验对生防菌的发酵参数条件进行优化。【结果】筛选到 1 株对扁刺蛾幼虫具有较高防效的内生生防菌 X-11，扁刺蛾 3 龄幼虫取食经 2.56108个mL1X-11 菌液处理的茶枝条 7d 后扁刺蛾累计校正死亡率达到 90.5%，致死中时（LT50）仅为 2.88d。菌株 X-11 经 16srDNA 分子生物学鉴定以及构建的系统发育树分析确定为偶氮还原拟杆菌（Paenibacillus azoreducens）。发酵条件优化试验表明，菌株X-11 的适宜发酵条件为：菌株接种量 2%，在发酵温度 36 条件下发酵培养 60h，菌株含量最高达 1.34109个mL1。【结论】筛选到 1 株对扁刺蛾幼虫具有较高防效的内生生防菌 x-11，可作为防治扁刺蛾幼虫的生物防治菌剂使用。关键词：扁刺蛾；菌株筛选；拟杆菌；发酵条件；正交试验中图分类号：S435文献标志码：A文章编号：1008-0384（2022）11146307Identification and Culture Optimization of Effective Biocontrol Agent on Thoseasenensis for Tea PlantationsHEWangxing1,2,XIEXiaoqun1,2,YANGPuxiang1,2*,LIWenjin1,2,LIYansheng1,2,JIANGXinfeng1,2,MAOPingsheng1,2（1.Jiangxi Sericulture and Tea Research Institute,Nanchang,Jiangxi330203,China;2.Industrial Crops Institute of Jiangxi,Nanchang,Jiangxi330203,China）Abstract:【Objective】Abiocontrolmicrobeon Thosea senensisWalkersuitablefororganicteaagriculturewasidentifiedandoptimalcultureconditionsstudied.【Method】FromtheintestinesofT.senensisdiedfromdiseaseinnature,microbeswereculturedandscreenedbymeansofvaryingthetemperature.IndoorvirulenceoftheselectedmicrobesonT.senensiswasdetermined by immersion feeding and further identified by morphological,molecular biological,and phylogenetic treeanalyses.Cultureoftheisolatedstrainwasoptimizedbyunivariateandorthogonalexperiments.【Result】TheendophyticstrainX-11withhighefficacyincontrollingthepestwasisolated.The3rdinstarlarvaeofT.senensis fedwitha2.56108conidiamL1X-11solutiondisplayedacumulativecorrectedmortalityrateof90.5%withamedianlethaltimeLT50of2.88donthe7thdayaftertreatment.Basedonthe16SrDNAmolecularidentificationandphylogeneticanalysis,X-11wasdeterminedtobePaenibacillus azoreducens.Theoptimizedcultureconditionsforthebacteriumincludedtheuseof2%inoculumtoculturefor60hat36withafinalcountapproaching1.34109conidiamL1.【Conclusion】TheendophyticstrainwithhighcontrolefficacyonT.senensislarvaewasidentifiedasP.azoreducens.Itcouldbeculturedtobeusedasabioagentforthepestcontrolatteaplantations.Key words:Thosea senensis Walker；strainscreening；bacteroidetes；cultureconditions；orthogonaltest收稿日期：20220412初稿；20220617修改稿作者简介：贺望兴（1989），男，硕士研究生，助理研究员，研究方向：微生物学（E-mail：）*通信作者：杨普香（1965），女，研究员，研究方向：茶学（E-mail：）基金项目：江西省重点研发项目（20201BBF61006）；江西省茶叶质量与安全控制重点实验室项目（20192BCD40007）；江西省星火计划项目（20161BBF61011）福建农业学报2022，37（11）：14631469http:/Fujian Journal of Agricultural Sciencesdoi:10.19303/j.issn.1008-0384.2022.011.0120引言【研究意义】扁刺蛾 Thosea senensis Walker 属鳞翅 目 Lepidoptera 刺 蛾 科 Limacodidae 扁 刺 蛾 属Thosea，俗称“痒辣子”，分布广泛，为杂食性食叶害虫1。扁刺蛾爆发时可将茶树及景观树冠层芽叶大面积吃光，甚至造成树木枯死，严重影响茶叶产量和茶园景观。此外，扁刺蛾幼虫体表遍布毒刺，触及人皮肤会引起皮肤发炎、疼痛、红肿，伴有剧烈灼痛感，严重影响茶园生产作业。目前生态茶园推广最广泛的普杀性物理防控技术如色板、杀虫灯等难以针对茶园刺蛾进行有效防控，适时还需要药剂防控，但长期使用化学药剂防治扁刺蛾易导致害虫产生抗药性，生态环境污染以及作物农残超标等问题23。与化学药剂相比生物菌剂具有不易产生抗药性、对天敌友好、环境污染少等优点46。因此，筛选高效的生防菌防治扁刺蛾可以有效保护茶园生态系统、减少环境污染，提升茶叶的质量安全，具有非常重要的意义。【前人研究进展】笔者调查发现刺蛾在江西南昌地区茶园一年一般发生 2 代，少数3、4 代，且通常第二代发生为害较严重，发生种类主要有茶刺蛾（Iragoides fasciataMoore）、扁刺蛾（Thosea senensis Walker）、褐 刺 蛾（Thoseahaibarana Matsumura）、丽 绿 刺 蛾（Parasa lepidaGramer）、黄 刺 蛾（Cnidocampa flavescensWalker）和龟形小刺蛾（Narosa nigrisigna Wileman）7，其中尤以扁刺蛾发生最为严重。目前报道对刺蛾有一定防效的生防菌株主要有白僵菌、金龟子绿僵菌、苏云金芽孢杆菌等810。肖锴11利用苏云金杆菌防治刺蛾，发现其具有较好的防治效果，致死率达到90%以上。谢小群等12以球孢白僵菌（Bb）、苏云金杆菌（Bt）和金龟子绿僵菌（Ma）等 3 种微生物农药为试验药剂，探讨了单一药剂及两两混配药剂不同浓度下对扁刺蛾幼虫的防效，结果表明，药后24h，Bb 在不同浓度下的平均校正死亡率最高为61.11%，显 著 高 于 Bt（46.67%）和 Ma（32.96%）。稀释 100 倍的 Bb和稀释 1000 倍的 Bt 的混配药剂在药后24h 的校正死亡率最高为 72.2%。同时优化生防菌株的发酵工艺条件，提高生防菌株细胞产量不仅是保证生防菌株防效的前提，也是决定其能否从实验室走向田间的关键1314。曹云娥等15通过结合单因素试验和响应面分析法优化了生防菌 WQ-6 的发酵工艺条件，发现优化后WQ-6发酵液对枯萎病菌的抑菌率较优化前增加了 2.28%32.16%。【本研究切入点】目前市售可选择的扁刺蛾高防效生物药剂还较少，有关专一性防治刺蛾的生防菌剂还有待深入研究。【拟解决的关键问题】从扁刺蛾尸虫肠道体内筛选对扁刺蛾具有高防效的生防菌株，优化生防菌株的发酵工艺条件，提高对茶园扁刺蛾的生防防效，以期解决使用化学药剂防治扁刺蛾造成的茶园生态环境污染，茶叶农残超标等问题，为该生防菌剂的工业发酵生产及产品开发提供理论依据。1材料与方法1.1供试虫源扁刺蛾幼虫采集于江西省凤凰沟风景区内套种樱花茶园，幼虫以新鲜茶枝饲养于人工气候培养箱中，光周期16L 8D，温度（281），相对湿度80%，3d 后选择健康、大小一致的扁刺蛾 3 龄幼虫用于生防菌毒力测定。1.2培养基GYS培养基：硫酸铵2.0g，磷酸氢二钾5.0g，葡萄糖1.0g，酵母2.0g，硫酸锰0.06g，硫酸镁0.4g，氯化钙0.08g，水 1L；牛肉膏蛋白胨培养基（NA）：蛋白胨 10g，牛肉粉 3g，氯化钠 5g，琼脂 15g，水 1L，pH7.3；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯 300g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，水 1L，pH自然；牛肉膏蛋白胨液体培养基：NA 培养基不加琼脂，用来发酵培养细菌。1.3生防菌株筛选1.3.1菌株初筛将从茶园收集到的自然罹病死亡的扁刺蛾尸虫用大量无菌水冲洗晾干，取其肠道内含物研磨成匀浆后备用。采用温度筛选法进行菌株的分离16，取适量匀浆物至 50mLGYS 培养液中振荡发酵培养 48h，设置发酵条件为 30、220rmin1，发酵完后取 1mL 发酵液离心沉降固体物，取其上清液于 70 水浴锅内热处理 5min，然后取 200L 稀释液涂抹于 NA 和 PDA 培养基上 30 恒温培养 72h。细菌菌株毒力采用浸液饲喂法测定17，取幼嫩的茶树枝条洗净、晾干后置于发酵好的菌液中浸湿 30min，自然风干后供扁刺蛾取食。真菌菌株毒力采用直接喷雾法12测定，将菌液直接喷雾于扁刺蛾表面，然后以无任何处理的茶树幼嫩枝条饲养扁刺蛾。每个菌株处理选取 20 只健康、生长状况较一致的扁刺蛾3 龄幼虫，处理后的幼虫放入人工气候箱中饲养，每天观察记录扁刺蛾死亡状况（用笔轻触幼虫吸盘无收缩力，视为死虫）。1464福建农业学报第37卷1.3.2菌株复筛以初筛到的对扁刺蛾有致死作用的 5 株细菌为试验对象，选择市售生物农药苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）为阳性对照，NA液体