苍耳子水提液对过敏性鼻炎小鼠的治疗作用及机制研究_邵深深.pdf

浙江中医药大学学报2023年2月第47卷第2期JOURNAL OF ZHEJIANG CHINESE MEDICAL UNIVERSITY VOL.47NO.2 Feb.2023中医药现代化论著苍耳子水提液对过敏性鼻炎小鼠的治疗作用及机制研究邵深深1张蔷蓉1林希1何婷21.温州市人民医院浙江，温州3250002.浙江大学医学院附属第一医院摘要：目的探讨苍耳子（Xanthii Fructus，XF）水提液对过敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）小鼠的治疗作用及机制。方法36只BALB/c小鼠随机分为正常对照（normal control，NC）组、AR组、低剂量XF水提液（low-dose XF，L-XF）组（4 mgkg-1）、中剂量XF水提液（medium-dose XF，M-XF）组（8 mgkg-1）、高剂量XF水提液（high-dose XF，H-XF）组（16 mgkg-1）和地塞米松（dexamethasonegroup，DXM）组（5 mgkg-1），每组6只。除NC组外，余下各组小鼠均用卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）致敏进行AR造模，随后治疗14 d。治疗结束后，记录小鼠搔鼻和喷嚏次数，并进行鼻炎症状评分；取小鼠鼻腔组织，行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和糖原（periodic acid-schiff，PAS）染色观察小鼠鼻腔组织学形态变化并评分，中性红染色观察肥大细胞脱颗粒情况，并计算各组药物脱颗粒抑制率；酶联免疫吸附试验检测小鼠血清白三烯C4、组胺及-氨基己糖苷酶A水平；免疫印迹法检测鼻腔组织T细胞激活连接蛋白（linker for activation of T cell，LAT）、磷酸化LAT（phospho-LAT，p-LAT）、磷脂酶C1（phospholipase C1，PLC1）、磷酸化PLC1（phospho-PLC1，p-PLC1）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、磷酸化PKC（phospho-PKC，p-PKC）蛋白的表达。结果与NC组比较，AR组小鼠的搔鼻、打喷嚏次数显著增加，鼻炎评分显著升高，HE评分以及PAS评分均显著升高，血清白三烯C4、组胺、-氨基己糖苷酶A水平显著升高，肥大细胞脱颗粒率显著升高，p-LAT/LAT、p-PLC1/PLC1、p-PKC/PKC的蛋白表达显著升高（P0.01）。与AR组比较，各组小鼠搔鼻、打喷嚏次数，以及肥大细胞脱颗粒率显著减少（P0.05，P0.01）；M-XF组、H-XF组、DXM组的鼻炎评分显著下降，HE评分以及PAS评分显著降低，血清白三烯C4、组胺、-氨基己糖苷酶A水平显著下降（P0.05，P0.01）；M-XF组、H-XF组、DXM组的药物脱颗粒抑制率显著高于L-XF组（P0.05，P0.01）。免疫印迹显示，与AR组比较，各组小鼠鼻腔组织的p-PKC/PKC蛋白表达显著下降（P0.05，P0.01），M-XF组、H-XF组、DXM组小鼠鼻腔组织的p-LAT/LAT、p-PLC1/PLC1的蛋白表达显著下降（P0.05，P0.01）。结论XF水提液可能通过抑制LAT/PLC1/PKC信号通路的表达，抑制肥大细胞脱颗粒，从而改善小鼠AR症状。关键词：苍耳子水提液；过敏性鼻炎；肥大细胞脱颗粒；组胺；LAT/PLC1/PKC信号通路；作用机制中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1005-5509（2023）02-0111-07DOI:10.16466/j.issn1005-5509.2023.02.001Study on the Therapeutic Effect and Mechanism of Xanthii Fructus Water Extract on Mice with Allergic RhinitisSHAO Shenshen，ZHANG Qiangrong，LIN Xi，et al Wenzhou Peoples Hospital，Wenzhou(325000)，ChinaAbstract:ObjectiveTo investigate the therapeutic effect and mechanism of Xanthii Fructus(XF)water extract on allergic rhinitis(AR)mice.MethodsThirty-six BALB/c mice were randomly divided into normal control(NC)group，AR model(AR)group，low dose XFwater extract(L-XF)group(4 mgkg-1)，medium dose XF water extract(M-XF)group(8 mgkg-1)，high dose XF water extract(H-XF)group(16 mgkg-1)，and dexamethasone(DXM)group(5 mgkg-1)，six in each group.Except the NC group，mice were sensitized withovalbumin(OVA)to establish AR model，then treated for 14 days.After treatment，the times of nasal scratching and sneezing wererecorded and the symptoms of rhinitis were scored.Mice nasal tissues were collected，hematoxylin-eosin(HE)staining and periodic acid-schiff(PAS)staining were used to observe the histological changes and scoring，neutral red staining was used to count the number ofdegranulation of mast cells and calculate the drug degranulation inhibition rate；enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)was used todetect serum leukotriene C4(LTC4)，histamine and-hexosaminidase A levels；Western blot was used to detect protein expression oflinker for activation of T cell(LAT)，phospho-LAT(p-LAT)，phospholipase C1(PLC1)，phospho-PLC1(p-PLC1)，protein kinaseC(PKC)，phospho-PKC(p-PKC)in nasal tissue.ResultsCompared with NC group，the times of scratching nose and sneezing，rhinitisscore，HE and PAS scores，serum LTC4，histamine and-hexosaminidase A levels，rate of degranulation mast cells，and protein基金项目：温州市科技计划项目（Y20180817）Fund project：Wenzhou Science and Technology Plan Project(Y20180817)111浙江中医药大学学报2023年2月第47卷第2期过敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是机体免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介导的，针对吸入性过敏原的变态反应性疾病，表现为鼻痒、阵发性喷嚏、鼻分泌亢进及鼻塞等，其发病受环境因素和遗传因素的双重影响1。目前认为，IgE接触过敏原后刺激肥大细胞激活和脱颗粒，是产生AR症状和炎症的主要原因1。中医治疗AR讲究辨治，并独具特色2-3。苍耳子（Xanthii Fructus，XF）为 菊 科 植 物 苍 耳（Xanthiumsibiricum Patr）干燥成熟带总苞的果实，其性温，味辛、苦，多用于鼻部疾病治疗4。研究表明，XF具有抑制肥大细胞释放炎症介质和调节细胞因子的作用5-7，但其具体机制尚不明确。因此，本研究通过卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）致敏小鼠模型，观察XF水提液对AR小鼠的改善作用并探究其作用机制，以完善临床治疗AR的理论依据。1材料和方法1.1实验动物8周龄左右的雌性BALB/c小鼠36只，购于上海斯莱克实验动物有限公司实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005，常规饲养于杭州鹰旸生物科技有限公司实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2020-0024，给予自由饮食。本研究动物伦理已获得杭州鹰旸生物科技有限公司动物中心许可（伦理批准号为：EYOUNG-20210404-01）。1.2试剂及药物OVA购于美国Sigma公司（批号：SLCH4123）；小鼠白三烯C4（leukotriene C4，LTC4）、组胺（histamine）、-氨基己糖苷酶A（-hexosaminidaseA）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）试剂盒均购于江苏酶免实业有限公司（批号：20210421、20210518、20210513）；苏 木 精-伊 红（hematoxylin-eosin，HE）、过 碘 酸-雪 夫（periodicacid-schiff，PAS）染液套装均购于武汉塞维尔生物科技有限公司（批号：CR20210712、CR20210406）；T细胞激活连接蛋白（linker for activation of T cell，LAT）抗体、磷酸化LAT（phospho-LAT，p-LAT）、磷脂酶C1（phospholipase C1，PLC1）、磷酸化PLC1（phospho-PLC1，p-PLC1）、蛋 白 激 酶C（protein kinase C，PKC）、磷酸化PKC（phospho-PKC，p-PKC）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-genase，GADPH）抗体均购于美国Affinity抗体公司（批号：32e5440、34e4712、32b5843、32b7854、51f3487、51f3542、65e8990）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司（批号：20210623）。XF购于桐君堂药业有限公司，煮沸2 h后用3号滤纸过滤，60 旋转蒸发仪浓缩，真空干燥后重新悬浮，得到浓缩的XF水提液备用，每1 g提取 物相当于原 药20 g；地 塞 米 松（dexamethasone，DXM）片购于山东新华制药股份有限公司（批号：H37020290）。1.3主要仪器LRH-150生化培养箱购于上海齐欣科学仪器有限公司；CMaxPlus酶标仪购于美谷分子仪器（上海）有限公司；Micro17R低温高速离心机购于美国Thermo公司；610020-9Q化学发光仪为上海勤翔科学仪器有限公司产品；Eclipse E100正置光学显微镜购于日本尼康公司；RM2016病理切片机为上海徕卡仪器有限公司产品。1.4造模及分组给药将小鼠随机分为正常对照（normal control，NC）组、AR模型（AR model，AR）组、4 mgkg-1的低剂量XF水提液（low-dose XF，L-X