柴胡皂苷A抑制链脲佐菌素联...病大鼠肾氧化应激和自噬损伤_陈晨.pdf

中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY第 31 卷第 6 期2022 年 12 月Vol.31.No.6December.2022收稿日期2022-06-05 修回日期2022-10-09作者简介陈晨，女（1989 年），汉族，硕士研究生*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：柴胡皂苷 A 抑制链脲佐菌素联合高脂高糖饮食诱导的糖尿病大鼠肾氧化应激和自噬损伤陈晨1，李芳2*（1福建医科大学附属第一医院临床营养科，福州 350005；2湖北文理学院附属医院襄阳市中心医院内分泌科，襄阳 441000）摘要目的 探讨柴胡皂苷 A（saikosaponin A，SSA）对糖尿病大鼠肾保护效应及机制。方法 采用高脂高糖饮食联合链脲佐菌素诱导法构建糖尿病大鼠模型，SSA 灌胃进行干预。用尿液化学分析仪测量尿液中微量白蛋白和肌酐的水平，HE和 Masson 染色法观察肾脏的组织学改变情况，试剂盒法检测肾组织中氧化应激指标 MDA、NO 和 GSH 的水平及 SOD 活性，电镜观察肾小球基底膜以及足细胞形态，免疫荧光染色观察肾小球中足细胞自噬相关蛋白 p62 和 LC3 II 分布，Western blot 法分析肾组织中 p62 和 LC3 II/LC3 I 水平。结果 糖尿病大鼠尿液中微量白蛋白和肌酐水平增加，肾小球硬化，肾小管扩张，肾小球基底膜增厚，部分肾小球、肾小管及间质发生纤维化；肾组织中 MDA 和 NO 水平升高，GSH 水平和 SOD 活性下降；足细胞足突变形并不同程度融合，p62 阳性足细胞增多，LC3 II 阳性足细胞减少；肾组织中 p62 蛋白表达升高，LC3 II/LC3 I 比值下降。SSA 干预可显著减轻上述变化。结论 柴胡皂苷 A 可减轻糖尿病肾损伤，该作用可能与其降低氧化应激和抑制自噬损伤有关。关键词柴胡皂苷 A；糖尿病肾病；大鼠；自噬；保护中图分类号R285.5 文献标识码B DOI：10.16705/ki.1004-1850.2022.06.004Saikosaponin A inhibits oxidative stress and autophagy impairment in the kidney of the rats with diabetes induced by streptozotocin combined with high-fat and high-sugar dietChen Chen1,Li Fang2*(1Department of Clinical Nutrition,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China;2Department of Endocrinology,Affiliated Hospital of Hubei University of Arts and Sciences(Xiangyang Central Hospital),Xiangyang 441000,China)AbstractObjective To investigate the protective effect of saikosaponin A(SSA)on kidney of diabetic rats and its mechanism.Methods The diabetic rat model was established by high-fat and high-sugar diet combined with streptozotocin induction,and then SSA was administered by gavage.The excretion of microalbumin and creatinine was measured by urine chemical analyzer.The histological changes of kidney were observed by HE and Masson staining.The contents of oxidative stress indexes including MDA,NO,GSH and SOD in renal tissue were detected by the corresponding kit method.The morphological changes of glomerular basement membrane and podocytes were observed by transmission electron microscopy.The distribution of autophagy-related proteins p62 and LC3 II in podo-cytes was observed by immunofluorescence staining.Western blot was used to analyze the protein expression levels of p62 and LC3 II/LC3 I in renal tissue.Results Urinary microalbumin and creatinine levels in diabetic rats were significantly increased,significantly sclerosis was observed in the glomeruli,renal tubules were significantly expanded,the glomerular basement membrane was thickened,fibrosis was obvious in the glomeruli,renal tubules and interstitium;the contents of MDA and NO in kidney tissue were significantly increased,while the contents of GSH and SOD were significantly decreased;the fusions of processes of podocytes were mutated and fused to different degrees,p62 positive podocytes were increased while LC3 II positive podocytes were decreased;the expression of p62 protein in renal tissue was significantly increased,while the LC3 II/LC3 I ratio was significantly decreased.SSA intervention could significantly mitigate these changes.Conclusion SSA can alleviate kidney injury in diabetes,which may be related to its effect 陈晨等.柴胡皂苷 A 抑制链脲佐菌素联合高脂高糖饮食诱导的糖尿病大鼠肾氧化应激和自噬损伤第 6 期 559糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是一种常见的糖尿病微血管并发症，是导致终末期肾病的主要病因之一1-2。据世界卫生组织估计，预计到 2040年全球将有 6 亿糖尿病患者3，其中约 1/3 将发展成 DN4。足细胞即肾小囊脏层上皮细胞，其能与肾小球基底膜和血管内皮细胞一起构成肾小球滤过屏障。已有研究5-6表明，DN 与糖尿病早期肾小球足细胞损伤密切相关，足突形态、数量、密度、相关蛋白表达等方面的变化是导致 DN 的发生发展的关键因素之一。柴胡皂苷 A（saikosaponin A，SSA）是柴胡的主要活性成分，其具有包括抗氧化、抗炎和免疫调节等多种药理活性7。最新研究8-9显示，SSA 能改善动物模型的包括肾损伤在内多种器官损伤。关于 SSA 在糖尿病大鼠中对肾脏的作用尚不明确。因此，本研究采用高脂高糖饮食联合链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱导法构建糖尿病大鼠模型，然后用 SSA 干预，旨在探讨 SSA 在糖尿病大鼠中对肾脏的保护作用及机制。材料与方法1 实验材料和仪器SSA（成都普菲德生物技术有限公司，纯度98%，货号JOT-10071），用质量分数为0.9%生理盐水配置使用；STZ（美国Sigma公司，货号S0130）；丙二醛（malondialdehyde,MDA）比色检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号 BC0020）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）检测试剂盒（美国 Cayman Chemicals 公司，货号 10006270)；一氧化氮（nitric oxide,NO）和还原型谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）检测试剂盒（美国 Cell Biolabs 公司，货号 STA-800，STA-312-E）；Araldite 包埋树脂（美国 Tedpella 公司，货号 18060）；微管相关蛋白 1-轻链 3（microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3）、p62 和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyc-eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的小鼠源单克隆抗体（美国 Santa Cruz 公司，货号 sc-376404，sc-48402，sc-47724）；蛋白含量分析试剂盒和 ECL 发光底物（武汉博士德生物工程有限公司，货号 AR1172，BA1051）；威廉姆斯瘤蛋白 1（Wilms tumor protein 1,WT1）兔源单克隆抗体和Alexa Fluor 647标记羊抗兔IgG（美国CST公司，货号 83535，4418）；HRP 标记的羊抗小鼠 IgG 和FITC标记羊抗小鼠IgG（万类生物科技有限公司，货号WLA024，WLA031）。TBA-200FR NEO尿液化学分析仪（日本Toshiba公司）；电泳设备和酶标仪（美国Bio-Rad 公司）；超薄切片机（德国 Leica 公司）；CellInsight CX7激光扫描共聚焦显微镜（美国Thermo Scientific公司）；光学显微镜（日本 Olympus 公司)；Oxy-max/CLAMS代谢笼（美国Columbus公司）；H-7700透射电子显微镜（日本 Hitachi 公司）。2 实验动物18 只雄性 SD 大鼠（清洁级，6 7 周龄，体重 190 220 g）购自浙江维通利华实验动物技术有限公司 SCXK（浙）2021-0006，置于福建医科大学 SYXK（闽）2018 0001 屏障动物饲养房饲养。饲养条件：室温维持（232），湿度维持55%65%，明/暗周期维持 12 h/12 h 循环，食物充足。所有实验方案均得到本院动物伦理委员会批准，并按照其对实验动物的研究方案进行实验。3 实验方案将 18 只 SD 大鼠随机分为 3 组（每组 6 只）：对照组（Ctrl）、模型组（Model）和柴胡皂苷 A 组（SSA）。Ctrl 组大鼠在整个实验流程中采用标准啮齿动物饲料饲养；Model 组和 SSA 组大鼠在整个实验流程中均给予高脂高糖食物（54.6标