草莓自毒物质对香豆酸降解菌的筛选及其降解效果研究_刘紫英.pdf

草莓自毒物质对香豆酸降解菌的筛选及其降解效果研究刘紫英，杜贵勇，傅苒馨，刘小林（宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春 ；万载县农业农村局，江西万载 ；宜春学院生命科学与资源环境学院，江西宜春 ）摘要：目的：对香豆酸是相对分布较广的一类酚酸类化感自毒物质，本文以其筛选株对自毒物质对香豆酸降解效果较好的细菌。方法：以对香豆酸为唯一碳源，经富集分离得到高效降解菌，采用分光光度法对其解毒能力进行探究，并对分离所得菌株在进行形态学鉴定的基础上并进一步进行 分子鉴定。结果：筛选得到株对对香豆酸具有解毒能力的菌株，其中菌株 在 时降解率最高，达到 ，经形态鉴定和分子鉴定为霍氏肠杆菌属。结论：筛选的降解菌 可降解草莓自毒物质对香豆酸。关键词：草莓；自毒物质；对香豆酸；降解菌；降解作用中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，；，；，）：，：，：，：；探究自毒物质化感效应的修复机制是克服植物连作障碍的热点，控制根部化感自毒物质效应，能有效防治草莓重茬病害，给草莓产业带来良好的经济收益。连作障碍主要是由于连续在同区土壤上多次种植相同茬的作物，而直接导致了植株生长较慢、减产，品质呈大幅度降低，严重时会造成部分枯萎、死苗的现象。我国草莓种植产业具有长期的发展潜力，而连作障碍是限制我国草莓产业发展的一大阻碍。自毒性抑制作用（）是相同茬植物因为长时间与环境之间互作而引发的一种自身生长可以抑制的效果。多年连作，自毒性抑制作用的毒害便随着连作年限的增加越来越明显，便引发一系列由病原物与环境的互作引起的草莓根部病害。酚酸类化合物常常被认作是作物根部的自毒物质，如苄酸、对苯酚甲酸、丁香酚、对香豆酸等。于会泳等研究发现，烟草根部土壤的主要分泌物（苄酸、羟基苯甲酸第 卷第 期 年 月宜春学院学报 ，收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（编号：）；江西省教育厅 年度科技计划项目（编号：）。作者简介：刘紫英（），女，江西万年人，副教授，硕士，研究方向为植物病理学、微生物工程。通信作者：刘小林（），男，江西高安人，教授，博士，研究方向为植物营养学。等根系自毒物质）的积累量与连作年限成正比，对于其引发烟草连作障碍存在一定关联。近年来，筛选和利用微生物进行预防和解决作物连作障碍已成热点，能在一定程度上解决连作自毒物质的问题。研究证实，细菌如恶臭假单胞菌（）和枯草芽孢杆菌（）分别能有效降解桃、草莓根系积累的苯甲酸自毒物质以及拮抗草莓的根腐病害；毛宁等 报道放线菌能有效减轻草莓化感自毒物质（苯甲酸和对羟基苯甲酸）的自毒作用。对香豆酸是相对分布较广的一类酚酸类化感自毒物质，有研究表明，的对香豆酸对莴苣的生长有强抑制作用，抑制率可达 。对香豆酸是烟草中发现的尖孢镰刀菌（）的理想化学抑制剂。本课题组前期探明，苯甲酸、对香豆酸、对羟基苯甲酸是草莓植株根系分泌的主要酚酸化感自毒物质，已筛选苯甲酸的效果较好的降解菌 。本研究以对香豆酸为唯一碳源，经富集分离得到高效降解菌，采用分光光度法对其解毒能力进行探究，并对分离所得菌株在进行形态学鉴定的基础上并进一步进行 分子鉴定。本研究选用自毒物质对香豆酸为研究对象，筛选其高效降解菌并对其降解效果开展研究。材料与方法 供试材料 年 月在江西省宜春市袁州区本地的草莓基地取得试验土样，为连作三年以上土壤的 土层。供试对香豆酸为分析纯品；桂式细菌基因组 抽提试剂盒，扩增引物：正向和反向引物分别为 （）和 （）（上海生工）；（北京艾莱德）、核酸染料（公司）。超净工作台 （苏州苏洁）、恒温震荡培养箱 （上海智城）、智能生化培养箱 （上海鸿都）、灭菌锅、台式高速离心机（上海安亭）、紫外可见光分光光度计 、台式高速离心机（上海佑科）、梯度 仪（）（上海沪西）等。基础改良无机盐液体培养基：（），（），（）（），（），对香豆酸（），余量为蒸馏水；控制 为 。初筛固体培养基：琼脂粉（），（），（），（）（），（），对香豆酸（），余量为蒸馏水，控制 为 。培养基：（），琼脂粉（），胰蛋白胨（），酵母提取物（），控制 为 。葡萄糖发酵培养基：蛋白胨 ；溴百里酚蓝 ；玉蜀黍糖 ；蒸馏水 。蛋白胨水培养基：蛋白胨 ；玉蜀黍糖 ；蒸馏水 ；为 。草莓降解菌株的富集培养和分离 降解菌株的富集培养为探索最适生长改良无机盐液体培养基条件并有效抑制杂菌生长，使用不同浓度对香豆酸作为唯一碳源来提高优势菌种的成活率。采用富集驯化培养方法，称取连作土样，接种到对香豆酸浓度 基础改良无机盐液体培养基，平行次，对照组不接菌液。设定 ，进行摇床培养，培养，并实时观察培养基中菌株生长状况，待培养物生长良好时，用移液枪吸取培养液 接种至含对香豆酸 新的 基础改良液体培养基中，重复上述步骤，逐步驯化至浓度为 。初筛将上述含对香豆酸 基础改良无机盐液体培养基生长情况良好进行单菌落的菌株涂布接种初筛固体培养基，对照组无菌水，设定恒温培养箱 培养，再挑取单个长势良好的菌落采用划线分离法继续进行纯种分离，每个菌株重复次，将此筛选纯化单菌落的菌种分别编号为 、，共 株菌。复筛前期探索菌株的最适生长条件，下培养的菌株生长状况最好，进一步探索最适接种量为，最适 时的菌株（）值最大，降解菌的生长状况最好。将初筛获得的降解菌株再接到基础改良无机盐液体培养基中，其对香豆酸浓度为 ，接种量为每瓶 ，对照为 无菌水，设定 、摇床震荡培养。每 用移液枪吸取 菌悬液加至事先灭好菌的 离第 期 宜春学院学报 第 卷心管中，去除菌体需先在 、下离心 后用 规格的滤膜过滤上清液，用紫外分光光度仪测得吸光度，检测对香豆酸的残留量，求出其降解率。对香豆酸的降解测定 对香豆酸的最大吸收波长的确定及标准曲线的测定称取对香豆酸纯品 ，用蒸馏水稀释定容至 容量瓶，配置浓度为 的对香豆酸标准液，对照组为蒸馏水，在紫外分光光度仪的测定下，发现对香豆酸在 处有最大吸收。对蒸馏瓶进行编号，吸取定量 、的 对香豆酸标准液，按编号加至 的蒸馏瓶中，加蒸馏水定容配置成个浓度梯度的酸标准液，对照为零管（蒸馏水）。设定紫外分光光度计波长为 ，测得的（）值作纵坐标，绘制对香豆酸标准液浓度作横坐标的标准曲线。降解菌对对香豆酸的降解率生物降解率主要指测试一种生物降解的速度，可以用多样测试方法进行衡量，本研究采用下式进行计算。降解率（）（纯培养液吸光度接种菌株培养液吸光度）未接菌培养液吸光度 （）其中，（）为对照组培养液吸光度，为实验组培养液吸光度。草莓自毒物质降解菌株的鉴定 形态学鉴定用 固体培养基进一步活化培养复筛得到的降解菌株，培养 后，挑取长势较好的单个菌落拍照，然后将经革兰氏染色后的菌落玻片用数码显微镜进行检查，观察其显微形态并记录。生理生化鉴定参考 微生物学实验指导 的实验十二 细菌的生理生化用于降解菌的生理生化鉴定，最先进行糖的发酵试验、再依次进行 试验、试验及靛基质试验。基因的 扩增和序列测定复筛菌株由上海生工 抽提试剂盒提取 ，并进行琼脂糖凝胶电泳，在 冰箱保藏得到的 。同时，采用 引物（、）进行 扩增，产物采用高通量测序法，得到生工生物测序公司反馈的测序结果。登录 网站，启用 程序，将测序结果交由 搜索查询比对核酸序列的同源性，系统发育的分析结果由 软件获得，其菌株系统发育树由 算法自展次数设定为 得出。结果与分析 对香豆酸降解菌的降解效果绘制的对香豆酸酸标准曲线见图，探讨吸光度与酸浓度关系，。图 对香豆酸标准曲线分离纯化出的 株菌株中有株 、对草莓自毒物质对香豆酸均具有降解能力，其余菌株降解效果不太明显。由图可知，根据时间这个自变量，观察对香豆酸前三天的降解率较为陡峭，而到了第四天降解率呈下降趋势，基本上都是第天降解率为最大值。图 降解菌在液体培养基中对对香豆酸的降解率对香豆酸降解菌在进行液体培养时，株降解菌中 、有较明显的降解效果，、降解效果较弱；其中 在第达到最大值为 ，在第达到最大值 ，在第为 ；在第达到最大值 ；在第达到最大值为 。由此得出如下结论：菌株 对对香豆酸的降第 期刘紫英，杜贵勇，傅苒馨，等：草莓自毒物质对香豆酸降解菌的筛选及其降解效果研究第 卷解效果最好，其降解率比较高，在培养 达到 ，有望作为生物防治的有效手段；因而进一步对其进行种属鉴定。降解菌的鉴定 形态学鉴定观察对香豆酸降解菌 ，菌落呈乳白色、椭圆形，边缘较光滑，表面较湿润，染色后呈红色、短杆状、长杆状、条状，经鉴定属革兰氏阴性菌。图 降解菌菌落：图 降解菌 显微图（倍）生理生化鉴定降解菌 生理生化鉴定结果如表。由表可知，降解菌 为产酸产气菌，阳性，阴性、靛基质阳性。表 降解菌的生理生化鉴定分析生化指标观察结果糖的发酵试验为产酸产气菌，呈阳性 试验为产气菌，呈阳性试验培养液出现黄色，呈阴性靛基质试验培养液中层出现淡粉色，呈阳性 降解菌的分子鉴定 产物电泳结果如图，对比 发现 有条带且拖尾不明显，说明 产物克隆成功。图 的电泳结果系统发育的分析结果由 软件获得，结果表明（如图），与菌株 存 在 达 的相似性，经鉴定后可初步认为该菌为霍氏肠杆菌属 。图 的系统发育树结合 伯杰细菌鉴定手册，霍氏肠杆菌属的生理生化结果为葡萄糖产酸阳性（），葡萄糖产气阳性（），阳性（）、阳性（）、吲哚阴性（），菌株 与霍氏肠杆菌属吻合。综合该菌株形态结构与分子鉴定的结果，所以最后确定菌株 为霍氏肠杆菌属 。结论与讨论草莓连作障碍的发生与土壤障碍（如土壤黏化、盐碱化、沙性过强及土传病害等）等环境恶化和自毒性抑制作用有关，连作条件下作物根际土壤微生态失衡的重要因素之一是根系分泌物的化感抑制作用，以根泌自毒物质降解为切入点，探索利用微生物降解草莓根泌自毒物质缓解、克服连作障碍是可行的。研究报道对草莓连作自毒物质的降解菌较多为放线菌，如解灵军等 报道对羟基苯甲酸降解菌 ，降解率在 时 。自毒物质降解菌为真菌的菌株 青霉 、黄丝曲霉 、桔青霉 ，其中 青霉在 时对苯甲酸、对羟基苯甲酸和水杨第 期 宜春学院学报 第 卷酸的降解率分别为 、和 。自毒物质降解菌为细菌的现报道有枯草芽孢杆菌 、炭疽芽孢杆菌 、解淀粉芽孢杆菌 。本研究筛选得到的降解菌 属细菌中的霍氏肠杆菌属，降解率在培养 达到 ，能在一定程度上降解草莓代谢积累的对香豆酸，虽然降解率与已报到的草莓自毒物质对羟基苯甲酸、苯甲酸相比相对低一点，但国内外尚未见草莓连作自毒物质降解菌的报道。对香豆酸降解菌筛选获得对后期通过筛选诱变提升其对香豆酸的降解率，其防治连作草莓的根部毒害作用方面也有一定的效果；而对于其它化感自毒物质的自毒性抑制作用以及对其他草莓根部病害的控制效果则有待进一步研究。探究控制植物根部分泌物及病原微生物的代谢物质对其连作土壤的毒害，是有效解决植物连作障碍的热点。筛选草莓自毒物质的高效降解菌株，对草莓连作障碍消除技术的研究、抗重茬病害的研究及缓解酚酸类自毒物质胁迫效应的研究均有一定的推动作用。同时，能够促进草莓产业在市场上的长期发展以及草莓产质量的提高，并带来更高的经济收益。参考文献：扈金丽，尹宝重，甄文超，等防治草莓连作障碍的复合生防制剂的筛选中国农学通报，（）：钟淑敏，廖晓兰作物自毒作用研究进展作物研究，（）：陈鹏，刘奇志草莓连作障碍研究进展北方园艺，（）：田给林，毕艳孟，孙振钧，等酚酸类物质在作物连作障碍中的化感效应及其调控研究进展中国科技论文，（）：谢星光，陈晏，卜元卿，等 酚酸类物质的化感作用研究进展生态学报，（）：于会泳，申国明，高欣欣连作烟田土壤根系分泌物的变化和分解中国烟草科学，（）：林壁润，谢双大，江学斌，等抗生素 对黄瓜疫病菌的抗生作用植物保护学报，（）：何昊 桃根泌自毒物质苯甲酸降解菌的分离鉴定及应用潜力研究 武汉：华中农业大学，刘紫英，黄磊，袁斌，等一株草莓连作自毒障碍主要物质苯甲酸降解细菌的筛选及其降解效果的研究 浙江农业学报，（）：毛宁，薛泉宏，唐明 株放线菌对土壤中苯甲酸和对羟基苯甲酸的降解作用 西北农林科技大学学报（自然科学版），（）：杨小燕，李立，张奇，等 不同类型酚酸物质对莴苣的化感作用福建农林大学学报（自然科学版），（）：，（）：何志刚，娄春荣，王秀娟，等番茄自毒物质降解菌的筛选及其降解效