藏红花素诱导视网膜母细胞瘤...袭和PI3K_AKT的活化_林珊.pdf

542 CHINESE JOURNAL OF ANATOMY Vol.45 No.6 2022 解剖学杂志 2022 年第 45 卷第 6 期doi：10.3969/j.issn.1001-1633.2022.06.010论 著*保定市科技计划项目（17ZF260）第 1 作者 E-mail： 通信作者，E-mail：收稿日期：2021-06-23；修回日期：2022-09-15藏红花素诱导视网膜母细胞瘤自噬性死亡 并抑制细胞侵袭和PI3K/AKT的活化*林 珊1 屈思萌1 张 荣1 王生海2 韦秋红1（1 保定市第一中心医院眼一科，2 河北大学附属医院ICU重症医学科，保定 071000）摘要 目的：目的：探究藏红花素对视网膜母细胞瘤自噬、凋亡、侵袭和PI3K/AKT活化的影响。方法：方法：采用CCK-8法检测不同剂量藏红花素对视网膜母细胞瘤细胞Y79细胞活力的影响，选用0、1、2、4 moL/L剂量藏红花素处理Y79细胞，分为藏红花素0 moL/L组、藏红花素1 moL/L组、藏红花素2 moL/L组和藏红花素4 moL/L组进行后续实验。免疫荧光检测LC3含量和AKT核转位；流式细胞仪检测细胞凋亡；Transwell检测细胞侵袭；免疫印迹检测LC3、LC3、Beclin1、ATG7、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平。结果：结果：与对照组相比较，藏红花素2、4 moL/L组LC3含量显著升高，LC3/LC3比值显著升高，Beclin1、ATG7蛋白表达水平显著降低，细胞凋亡率显著升高，侵袭细胞数显著降低，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值显著降低，AKT核转位显著降低。结论：结论：藏红花素诱导视网膜母细胞瘤自噬性死亡，并抑制细胞侵袭和PI3K/AKT的活化。关键词 视网膜母细胞瘤；藏红花素；自噬；PI3K/Akt信号通路Crocin induces autophagic death of retinoblastoma and inhibits cell invasion and activation of PI3K/AKT*Lin Shan1，Qu Simeng1，Zhang Rong1，Wang Shenghai2，Wei Qiuhong 1（1.Department of Ophthalmology，Baoding First Central Hospital；2.ICU Department of Critical Care Medicine，Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000，China）Abstract Objective：To investigate the effects of Crocin on autophagy，apoptosis，invasion，and activation of PI3K/AKT in retinoblastoma.Methods：The effects of different doses of Crocin on the activity of retinoblastoma Y79 cells were detected by the CCK-8 method.Y79 cells treated with Crocin were divided into four groups：the Crocin 0 mol/L group，the Crocin 1 mol/L group，the Crocin 2 mol/L group，and the Crocin 4 mol/L group for subsequent experiments.LC3 content and AKT nuclear translocation were detected by immunofluorescence assay.Flow cytometry was used to detect apoptosis.Transwell was used to detected the cell invasion.Western blotting was used to detect the protein expression levels of LC3，LC3，Beclin1，ATG7，PI3K，p-PI3K，AKT and p-AKT.Results：Compared with the Crocin 0 moL/L group，Crocin 2，4 mol/L group LC3 levels was significantly elevated，LC3/LC3 ratio increased significantly，Beclin1，ATG7 protein expression level decreased significantly，the apoptosis rate increased significantly，invasive cells was significantly reduced，p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT ratio decreased significantly，nuclear translocation of AKT was significantly reduced.Conclusion：Crocin induces autophagic death of retinoblastoma and inhibits cell invasion and activation of PI3K/AKT.Key words retinoblastoma；Crocin；autophagy；PI3K/Akt signaling pathway视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）是全世界儿童中最常见的眼内肿瘤，尽管尽早发现可治愈，但在发展中国家Rb死亡率高达701。尽管在放射疗法和化学疗法以及手术切除治疗Rb方面取得了进步，但晚期Rb很难治疗，因为Rb可以迅速填充眼睛，侵入视神经，并最终扩散到中枢神经系统，从而致命2。因此，迫切需要开发用于治疗Rb新的药物。藏红花素（Crocin）是鸢尾科番红花属球根类草本植物藏红花中提取的一种水溶性类胡萝卜素。相关研究表明藏红花素具有较强的抗肿瘤活性，可抑制肿瘤的生长和扩散，包括结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨髓癌和白血病3-9，543 这表明它可以作为癌症化疗和癌症预防剂。本研究旨在探究藏红花素对Rb自噬、凋亡、侵袭和PI3K/AKT活化的影响，以期为藏红花素应用于Rb的治疗提供理论和实验依据。1 材料和方法1.1 实验药物和主要试剂1.1 实验药物和主要试剂藏红花素购自美国Sigma-Aldrich，化学式为C44H64O24，分子量976.96；Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI 1640）培养基、胎牛血清、青-链霉素、胰蛋白酶购自美国Gibco 公司；Transwell购自美国Corning Costar；CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、免疫荧光染色试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；兔 抗LC3/LC3、Beclin1、ATG7、PI3K、p-PI3K、AKT（ab106693）、p-AKT、GAPDH单克隆抗体购自英国Abcam公司。1.2 细胞培养1.2 细胞培养人Rb细胞Y79来源于美国典型培养物保藏中心，将细胞培养于RPMI1640培养基中，添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，置于37含5CO2的培养箱中培养，每24 h更换新鲜培养基，1：2传代。选用对数生长期细胞为实验用细胞。1.3 CCK-81.3 CCK-8将Rb细胞Y79接种于96孔板（100 L/孔）孵育24 h后，用不同剂量（0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 moL/L）藏红花素处理细胞，每孔加入10 L CCK-8溶液孵育4 h，在450 nm处用酶标仪测定OD值。1.4 细胞分组及处理1.4 细胞分组及处理通过方法1.3结果计算藏红花素对人Rb细胞Y79的IC50值，选择无显著毒性1、2、4 moL/L剂量藏红花素处理Y79细胞48 h，并选择0 moL/L 剂量藏红花素作为对照组，将细胞分为4组：对照组、藏红花素1 moL/L组、藏红花素2 moL/L组和藏红花素4 moL/L组。1.5 免疫荧光1.5 免疫荧光将爬片用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗15 min，用0.1%Triton X-100通 透5 min，用5%牛 血 清白 蛋 白（BSA）在PBS中 培 养30 min，滴 加LC3（1100）或AKT（1100）一抗，4孵育过夜，清洗后，加入FITC标记荧光二抗（11 000）孵育2 h，最后加入DAPI染色避光孵育1 h。清洗后用抗荧光淬灭剂封片。在荧光显微镜下观察，并采集图片，每个细胞的绿色荧光斑点数量通过用斑点数除以每个场中的细胞核数来确定。1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡采用Annexin V-FITC和PI双重染色检测细胞凋亡。收集各组Y79悬浮细胞到10 mL的离心管中，每样本细胞数为3106/mL，1 000 r/min离心5 min，弃去培养液，用孵育缓冲液洗涤1次，1 000 r/min离心5 min，重悬细胞后加入5 L Annexin V-FITC和5 L PI溶液室温避光孵育15 min，1 000 r/min离心5 min，将细胞悬浮在结合缓冲液中，采用流式细胞仪分析。右上象限（晚期凋亡）和右下象限（早期凋亡）中的Y79细胞是凋亡细胞。1.7 Transwell检测细胞迁移1.7 Transwell检测细胞迁移Transwell小室加入50 L基质胶并于37孵育3 h凝固。将1.4所述的方法分组及处理的细胞接种于Transwell小室上室，其中上室为无血清培养基，下室为完全培养基，培养48 h后取出小室，擦除未过膜的细胞后多聚甲醛固定，1%结晶紫染色后拍照。每组取3个随机视野，计数视野中的染色细胞数目即为侵袭细胞数。1.8 免疫印迹检测1.8 免疫印迹检测收集各组细胞加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，用BCA试剂盒测定蛋白质含量。提取等量的蛋白质样品，在100条件下变性5 min。然后使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离并转移至聚偏氟乙烯膜，在4条件下加入LC3（13 000）、Beclin1（12 000）、ATG7（13 000）、PI3K（11 000）、p-AKT（1 1 000）、AKT（1 1 000）、p-AKT（1 1 000）、GAPDH（12 000）并孵育过夜，清洗，然后在4下加入辣根过氧化物酶标记的二抗（110 000），孵育2 h，最后加入发光液，曝光处理。Image J软件统计灰度值。1.9 统计学处理1.9 统计学处理应用SPSS 18.0软件对实验数据进行统计学分析。数据以xs表示，两组间比较采取t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 藏红花素降低Y79细胞活力2.1 藏红花素降低Y79细胞活力通过CCK-8法检测不同剂量藏红花素对Y79细胞活力的影响，与0.125 moL/L组相比较，2、4、8、16 moL/L组细胞存活率显著降低（P0.05）（图1）。544 2.2 藏红花素升高Y79细胞LC3含量2.2 藏红花素升高Y79细胞LC3含量通过免疫荧光检测LC3含量结果，与对照组相比较，Crocin 2、4 mol/L组细胞LC3含量显著升高（P0.05）（图2）。2.3 藏红花素升高Y79细胞LC3II/LC3I比值，降低2.3 藏红花素升高Y79细胞LC3II/LC3I比值，