采用胶原酶Ⅱ循环灌流消化法...胞活性及瞬时外向钾电流观察_何水静.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 3 期采用胶原酶循环灌流消化法急性分离的成年大鼠心肌细胞活性及瞬时外向钾电流观察何水静1，2，徐瀚哲1，2，胡棣文1，2，孟宪睍1，2，李辛一1，2，王腾1，2，胡丹1，2，黄燕1，21 武汉大学人民医院心内科 武汉大学心血管病研究所 心血管病湖北省重点实验室，武汉 430060；2 武汉大学第一临床学院摘要：目的通过观察采用胶原酶循环灌流消化法急性分离的成年大鼠心肌细胞形态、活性及瞬时外向钾电流，以验证胶原酶循环灌流消化法对心肌细胞急性分离的效果。方法利用自制Langerdorff灌流装置进行主动脉逆行灌流，胶原酶循环灌流消化，分离成年大鼠单个心肌细胞；利用逐步梯度复钙法选出耐钙心肌细胞；在共聚焦显微镜下观察单个心肌细胞的形态、舒缩能力，并用全细胞膜片钳记录心肌细胞瞬时外向钾电流。结果胶原酶循环灌流消化法分离大鼠心肌细胞可获取90%质量良好的细胞，分离出来的心肌细胞边缘锐利、横纹清晰，折光性强，舒缩规律；复钙后仍有60%质量良好的活细胞；用全细胞膜片钳可记录到标准的瞬时外向钾电流。结论采用胶原酶循环灌流消化法急性分离的成年大鼠心肌细胞活性较好且耐钙，可记录到标准的瞬时外向钾电流。关键词：心肌细胞分离术；细胞急性分离术；胶原酶循环灌流消化法；心肌细胞；细胞活性；钾电流doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.03.004 中图分类号：R33 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）03-0017-05Activity and transient outward potassium current in adult rat cardiomyocytes acutely isolated by collagenase type circulating perfusion digestionHE Shuijing1，XU Hanzhe，HU Diwen，MENG Xianxian，LI Xinyi，WANG Teng，HU Dan，HUANG Yan1 Department of Cardiology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，ChinaAbstract：Objective To observe the morphology and activity as well as the electrophysiological characteristics in acutely isolated rat cardiomyocytes digested by cyclic perfusion of collagenase type and to evaluate the effect of collagenase type circulating perfusion digestion.Methods Single cardiomyocytes of adult rats were isolated by using the self-made Langerdorff apparatus for retrograde aortic perfusion and collagenase type circulating perfusion digestion.Myocytes tolerated to calcium were screened by adding calcium step by step.The morphology and contraction capacity of individual cardiomyocytes were observed under confocal microscope.The whole-cell-patch clamp was used to record the transient outward potassium current of cardiomyocytes.Results Ninety percent of the cells with good quality were obtained by this collagenase digestion method.The isolated cardiomyocytes had sharp edges，clear transverse lines，strong refraction and regular contraction.There was 60%of good quality living cells after calcium recovery.Standard transient outward potassium currents were recorded using the whole cell patch clamp.Conclusions Adult rat cardiomyocytes isolated by collagenase type circulating perfusion digestion showed good activity and calcium tolerance.Standard transient outward potassium current was recorded.Key words：cardiomyocyte isolation；acute isolation；collagenase type cyclic perfusion digestion；cardiomyocytes；cell viability；potassium current目前已有许多实验1-2证明，心肌细胞离子通道异常与心血管疾病之间关联紧密。认识各种正常生理或异常病理状态下心肌细胞某种离子通道的特性，尤其是其结构和功能的变化，在研究疾病发病机制、相关药物作用以及新型药物研发等方面都起着至关重要的作用3-5。膜片钳技术为心律失常以及心脏电生理研究中不可或缺的方法6。同时，钙成像以及单细胞测序等技术在近年来的心脏电生理研第一作者简介：何水静（2001-），女，本科在读，主要研究方向为心脏电生理及冠心病的诊治。E-mail：通信作者简介：黄燕（1988-），女，主治医师，主要研究方向为心脏病的诊治及基础研究。E-mail：17山东医药2023 年第 63 卷第 3 期究中也占据了重要地位。单个心肌细胞常被应用于上述试验中，因此如何利用经济、简便的方法获得适用于这些实验研究的心肌细胞尤为重要。当前，单个心肌细胞的获取方法主要有原代细胞培养、急性分离等7。新生大鼠心肌细胞的分离和培养技术已相当稳定成熟8，但成年大鼠心肌细胞的体外培养不仅操作时限长且操作复杂，对细胞外环境要求高，体外培养不易存活，且培养出的细胞产量低，再生能力差9。培养细胞与急性分离所得成熟细胞在形态和功能等方面存在着较大差异，许多实验培养新生鼠未成熟的心肌细胞来进行后续研究所得的结论与成熟心肌细胞做出来的结论并不相符。直接分离成熟心肌细胞用于实验称为急性分离，目前常用的急性分离方法有机械分离和酶分解法。急性分离细胞更接近生理状态，利用急性分离的心肌细胞所得实验结果更具临床应用价值，而机械法分离心肌细胞难以避免损伤心肌细胞膜。酶解法分离细胞是1969年KONO10首先报道的，为心肌细胞急性分离的最常用方法。现已有许多实验对该种方法进行了研究，但所得细胞质量不一。本研究通过改进分离过程中所使用的装置、材料及方法，形成一种简便而经济高效的成年大鼠心肌细胞分离方法即胶原酶循环灌流消化法，采用此方法能分离到舒缩状态良好且耐钙，功能稳定的单个细胞，并能用来记录心肌细胞离子通道电流。1 材料与方法 1.1实验动物、试剂及仪器68周的健康成年SD大鼠，雌雄不限，体质量150200 g，均购买于北京维通利华公司。实验遵循 湖北省实验动物管理条例中的相关规定。主要试剂：胶原酶（COLLAGENASE，TYPE 2），4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）购自Sigma公司，氯化钠（NaCl），氯化钾（KCl）等试剂均为国产分析纯。无钙台式液：NaCl 135 mmol/L；KCl 5.4 mmol/L；氯化镁（MgCl2）1.0 mmol/L；磷酸二氢钠（NaH2PO4）0.33 mmol/L；HEPES 10 mmol/L；葡萄糖（Glucose）10 mmol/L。溶液使用前用氢氧化钠（NaOH）调pH至7.35。细胞保存液：无钙台氏液+牛血清白蛋白（BSA，1 mg/mL），所有溶液在使用前用95%O2+CO2饱和约30 min。记录瞬时外向钾电 流 的 电 极 内 液：KOH 130 mmol/L；KCl 15 mmol/L；MgATP 5 mmol/L；CaCl2 1 mmol/L；L-glutamic acid 130 mmol/L；MgCl2 1 mmol/L；NaCl 5 mmol/L；EGTA 5 mmol/L；HEPES 10 mmol/L；PH 用KOH调pH至7.35。记录瞬时外向钾电流的细胞外 液：NaCl 138 mmol/L；MgCl2 1.0 mmol/L；KCl 5.4 mmol/L；CaCl2 1.8 mmol/L；HEPES 10 mmol/L；Glucose10 mmol/L；nifedipine 0.02 mmol/L；PH 用NaOH调pH至7.35。主要仪器：Langerdorff灌流装置（自制，如图1）；恒流泵；恒温水浴锅；倒置显微镜（日本olympus）；电极拉制仪P-97（美国sutter）；膜片钳（德国HEKA）。1.2心肌细胞的分离采用胶原酶循环灌流消化法。提前打开 Langerdorff 灌流装置中的加热装置，使Langerdorff系统温度维持在37。配制无钙台式液1 000 mL，加热同时通氧气30 min后，调pH至7.37.35。分离细胞过程中所需的溶液分为A、B、C杯；A杯：100 mL无钙台氏液+20 mg乙二醇双四乙酸（EGTA），调pH值至7.35；B杯：100 mL无钙台氏液；C 杯：60 mL 无钙台氏液+30 mg BSA+12 mg 胶原酶。另外量取100 mL无钙台氏液冰浴通氧备用，剩余台氏液恒温水浴通氧备用。用75%乙醇反复冲洗 Langerdroff灌流装置 35遍后，再用去离子水冲洗35遍，再通准备好的无钙台氏液，灌流速度调节至78 mL/min之间。取 SD 大鼠称重，腹腔注射肝素（200 U/kg），10 min后腹腔注射3戊巴比妥钠（60 mg/kg），充分图1自制Langerdroff装置18山东医药2023 年第 63 卷第 3 期麻醉后固定于鼠板上，用止血钳提起胸壁皮肤，组织剪剪开皮肤后，提起剑突，自剑突沿肋缘下剪开胸壁。充分暴露心脏后，弯镊托起心脏及部分肺组织，眼科剪于心脏根部保留主动脉 12 cm剪下心脏，立即放入预冷的氧饱和无钙台氏液中，快速清洗，修剪肺及其他结缔组织，保留心脏及 1 cm 左右的主动脉，迅速行主动脉插管，动脉夹固定。确认Langerdroff装置已打开且无气泡，将插管接于灌流装置灌流口处，细线于主动脉第一分支根部固定。灌流过程中，所有的灌流液均需持续通氧。参照并改进文献11方法，先以预先恒温水浴且氧饱和的无钙台氏液灌流冲洗干净残留血液，然后依次灌流A杯约5 min，B杯35 min，C杯酶液灌流至心脏疏松膨胀变软约20 min。在C杯酶液灌流消化过程中，为了提高胶原酶的活性，分 3 次加入60 L 20 mmol/L的CaCl2溶液；消化酶液可循环使用。同时密切观察心脏形态，消化至心脏半透明，明显胀大蓬松时停止消化，此时亦可观察到酶液滴速增快；也可取少量心室表面组织于镜下观察，若有散在单个细胞即可停止消化，此时为心室肌细胞消化终点。取下心脏于保存液中清洗。由于心房肌细胞