参白解毒方基于Wnt_β-...癌细胞增殖和迁移的抑制作用_黄敏.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 789 参白解毒方基于Wnt/-catenin信号通路对结直肠癌细胞增殖和迁移的抑制作用黄敏1，范旻旻1，程海波1,2，沈卫星1，肖君1，徐长亮1，谭佳妮1，赖岳阳1，余成涛1，孙东东1，李柳1,2（1南京中医药大学第一临床医学院，南京 210023；2江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心，南京 210023）摘要：目的：研究参白解毒方对结直肠癌细胞增殖和迁移的药效及其作用机制。方法：用参白解毒方处理人结直肠癌细胞HT29、SW480和SW620，MTT和平板克隆形成实验检测细胞的增殖和自我更新能力；细胞划痕实验检测HT29细胞的迁移能力；实时定量PCR或Western Blot检测上皮-间充质转化（EMT）相关标记物（E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin）、Wnt5a和-catenin的表达水平；实时定量PCR检测Wnt/-catenin信号通路下游的结直肠癌肿瘤干细胞标志物CD44和CD133的表达水平。结果：参白解毒方可抑制结直肠癌细胞HT29、SW480和SW620的增殖（P0.01，P0.05），减少HT29细胞形成克隆的数目（P0.05，P0.01）；细胞划痕实验结果表明参白解毒方可以显著抑制HT29细胞的迁移（P0.05，P0.01），且具有剂量依赖性。实时定量PCR和Western Blot结果显示，参白解毒方可以剂量和时间依赖性的上调上皮细胞标志物E-Cadherin mRNA和蛋白的表达，下调间质细胞标志物N-Cadherin、Vimentin mRNA和蛋白的表达；参白解毒方同时可以下调Wnt5a、-catenin mRNA和蛋白的表达，抑制Wnt/-catenin信号通路活化，显著抑制结直肠癌肿瘤干细胞标志物CD44、CD133的mRNA表达。结论：参白解毒方可以抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移，其作用机制可能与调控Wnt/-catenin信号通路从而逆转结直肠癌细胞EMT的发生，降低结直肠癌细胞干性相关。关键词：结直肠癌；参白解毒方；上皮-间充质转化；Wnt/-catenin信号通路；肿瘤干细胞基金资助：国家自然科学基金重点项目（No.81930117），江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）Inhibition effects of Shenbai Jiedu Formula on proliferation and migration of colorectal cancer cells based on Wnt/-catenin signaling pathwayHUANG Min1,FAN Min-min1,CHENG Hai-bo1,2,SHEN Wei-xing1,XIAO Jun1,XU Chang-liang1,TAN Jia-ni1,LAI Yue-yang1,YU Cheng-tao1,SUN Dong-dong1,LI Liu1,2(1First Clinical Medical College,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China;2Jiangsu Collaborative Innovation Center of Traditional Chinese Medicine Prevention and Treatment of Tumor,Nanjing 210023,China)Abstract:Objective:To explore the efficacy and mechanism of Shenbai Jiedu Formula(SBJDF)in inhibiting the proliferation and migration of colorectal cancer(CRC)cells.Methods:After treating human CRC cells HT29,SW480,and SW620 with SBJDF,MTT and clone formation assay were used to detect the proliferation and self-renewal ability of the cells;the wound healing assay was used to detect the migration ability of HT29 cells;Real-time quantitative PCR and Western Blot were used to detect the expression levels of Wnt5a,-catenin and epithelial-mesenchymal transition(EMT)-related proteins(E-cadherin,N-cadherin and Vimentin);Real-time quantitative PCR was used to detect the expression levels of CRC stem cells markers CD44 and CD133 regulated by of Wnt/-catenin signaling pathway.Results:SBJDF can effectively inhibited the proliferation of CRC cells HT29,SW480 and SW620(P0.01,P0.05),and reduced the number of clones formed by HT29 cells(P0.05,P0.01).The results of wound healing assay showed that SBJDF can significantly inhibit the migration of HT29 cells(P0.05,P0.01)in a dose-dependent manner.The results of real-time quantitative PCR and Western Blot showed that SBJDF can up-regulated the 研究报告通信作者：范旻旻，江苏省南京市栖霞区仙林大道138号南京中医药大学，邮编：210023，电话：025-85811005E-mail：程海波，江苏省南京市栖霞区仙林大道138号南京中医药大学，邮编：210023，电话：025-85811005，E-mail：内文2.indd 7892023/2/28 10:35:49中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 790 结直肠癌是一种恶性消化系统肿瘤，发病较为隐匿，且易发生转移和侵袭，可远端转移至肝、肺、脑等1-2。据国际癌症研究机构发布的2020年全球癌症发病率和病死率预计数据显示，结直肠癌的发病率位居全球第三，病死率位居全球第二3。大约35%的结直肠癌患者在确诊时已经发生转移，多达50%的非转移性结肠癌患者最终会发生转移4。大多数有远端转移的结直肠癌患者不适合常规治疗，并且5年生存率10%5-6。因此，目前急需寻找能够抑制结直肠癌细胞侵袭和转移的治疗药物。上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）这一过程在肿瘤侵袭和转移方面发挥着关键而复杂的作用。肿瘤细胞发生EMT可以促进细胞的侵袭和转移7，结直肠癌细胞的侵袭性和高度转移性也与EMT的激活有关8，而Wnt/-catenin信号通路的活化可以诱导肿瘤细胞发生EMT转换9。近年来，中医药被越来越多地运用到恶性肿瘤的治疗上，显示出良好的临床疗效，从中医药中寻找抗结直肠癌的药物是值得探索的路径10。参白解毒方是岐黄学者程海波教授临床经验方，方中苦参、白花蛇舌草，抗癌解毒、清热燥湿，二者共为君药；党参、炒白术，健脾燥湿、补中益气，黄连、薏苡仁，清热泻火、健脾渗湿，四药共为臣药，与方中其他药物配伍，共奏“抗癌解毒、清热燥湿、健脾益气”之功。本团队前期研究11发现其具有良好的抗结直肠癌活性，本研究旨在探索参白解毒方对结直肠癌细胞增殖和迁移的调控作用及其机制。材料1.细胞 人结直肠癌细胞HT29（编号：TCHu103），SW480（编号：TCHu172），SW620（编号：TCHu101）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。2.药物与试剂 参白解毒方药材与饮片均购于苏州市天灵中药饮片有限公司；胎牛血清（Gibco公司，批号：10099-141C）；RPMI-1640培养基（上海源培生物科技有限公司，批号：D120705）；MTT（Sigma-Aldrich公司，批号：SP1080）；二甲基亚砜（DMSO）（Biofroxx，批号：143310）；结晶紫染色液（碧云天生物技术公司，批号：C0121）；通用型高灵敏度染料法定量PCR检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，批号：Q711）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：23227）；Western及IP细胞裂解液（碧云天生物技术公司，批号：P0013）；20X LumiGLO Reagent and 20X Peroxide（CST公司，批号：7003）；抗E-Cadherin单抗（批号：sc-8426）、抗N-Cadherin单抗（批号：sc-59987）、抗Vimentin单抗（批号：sc-6260）；抗-catenin单抗（批号：sc-7963）均购自Santa Cruz公司；抗GAPDH单抗（Abmart公司，批号：M20006F）；Alexa Fluor 594山羊抗小鼠荧光二抗（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：A11005）；实时定量PCR引物订购自南京金斯瑞生物科技有限公司。3.仪器 Esco Airstream型垂直流超净工作台（新加坡ESCO科技有限公司）；Nikon ECLIPSE TS100倒置显微镜（日本Olympus公司）；SPARK 10M型多功能酶标系统/（瑞士TECAN公司）；1658001型垂直平板电泳仪和1703935型转膜仪（美国Bio-Rad公司）；NANODROP 2000型分光光度仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；普通PCR仪（美国ABI公司）；实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；Tanon 5500型凝胶图像分析系统上海天能（Tanon）科技有限公司。方法1.细胞培养 HT29、SW480和SW620细胞使用含有青霉素-链霉素及10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。所有细胞均在37、5%CO2条件下培养。2.参白解毒方冻干粉的制备 全方煎液：取参白解毒方加10倍量水，室温浸泡1 h，煎煮2 h，纱布过滤，滤液备用；药渣用8倍量水继续煎煮1.5 h，过滤，合并两次滤液，回收溶剂、减压浓缩使其浓度达到2 g/mL。全方水提醇沉：以上2 g/mL全方煎液放冷后，边搅拌边缓慢加入乙醇使达到80%含醇量，然后密闭冷藏2448 h。冻干粉制作：取出全方水提醇沉，过滤，旋转蒸馏去除乙醇，-80 冻存24 h，于冻干机中冻干 710 d，所得冻干粉得率为生药量的19.46%。使用时称量所需量的冻干粉溶于细胞培养基中，并用0.22 mol/L的滤膜过滤，用于后续细胞实验，按照生药量计算浓度。3.MTT检测细胞增殖 将处于对数生长期的结直肠癌细胞常规消化并计数，3103/孔的密度种至96孔板中，待细胞贴壁后，加入用培养基稀释的参白解毒方，使终浓度依次为2、4、8、16、32 m