不同时间高氧对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞能量代谢的影响_黄蓉蓉.pdf

中 国 医 学 科 学 院 学 报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAEVol.45 No.19基金项目:甘肃省自然科学基金(21J1A062)论著不同时间高氧对大鼠肺泡型上皮细胞能量代谢的影响黄蓉蓉1，瞿珊珊1，郭鸿1，陈苏衡1，杨传奇1，张俊妹1，李玉兰21兰州大学第一临床医学院，兰州 7300002兰州大学第一医院麻醉科，兰州 730000通信作者:李玉兰电话:13519625065，电子邮件:摘要:目的探讨不同时间高浓度氧对肺泡型上皮细胞线粒体能量代谢的影响。方法将大鼠 LE-6TN 细胞分为对照组(21%O2常规培养 4 h)、高氧 1、2、3、4 h 组(95%O2分别培养 1、2、3、4 h)。采用荧光素酶化学发光法检测各组细胞的三磷酸腺苷(ATP)含量，采用微量法检测线粒体呼吸链复合体 V 活性，荧光探针 JC-1 检测细胞线粒体膜电位，实时荧光定量 PC 法检测线粒体呼吸链复合体、的核心亚基 NADH 脱氢酶亚基1(ND1)、细胞色素 b(Cytb)、细胞色素 C 氧化酶亚基 I(COXI)、ATP 酶 6(ATPase6)mNA 的表达水平。结果与对照组比较，高氧 1、2、3、4 h 组细胞线粒体呼吸链复合体核心亚基 ND1(q=24.800，P 0.001;q=13.650，P 0.001;q=9.869，P 0.001;q=20.700，P 0.001)、COXI(q=16.750，P 0.001;q=10.120，P 0.001;q=8.476，P 0.001;q=14.060，P 0.001)及 ATPase6 mNA(q=22.770，P 0.001;q=15.540，P 0.001;q=12.870，P 0.001;q=18.160，P 0.001)表达水平均显著降低;且高氧 1、4 h 组细胞 ATPase 活性受到抑制(q=9.435，P 0.001;q=11.230，P 0.001)，ATP 含量降低(q=5.615，P=0.007;q=5.029，P=0.005);而高氧 2、3 h 组细胞 ATPase 活性(q=0.156，P=0.914;q=3.197，P=0.116)及 ATP 含量(q=0.859，P=0.557;q=1.273，P=0.652)差异无统计学意义。各组细胞线粒体膜电位之间差异无统计学意义(F=0.303，P=0.869)。结论短时间高氧会抑制呼吸链复合体核心亚基表达并降低 ATPase 活性，导致肺泡型上皮细胞能量代谢障碍。关键词:高氧;线粒体;肺泡型上皮细胞;能量代谢中图分类号:614.2+7文献标志码:A文章编号:1000-503X(2023)01-0009-07DOI:10.3881/j.issn.1000-503X.15096Excess Oxygen Supply for Different Time Periods Affect EnergyMetabolism in at Alveolar Epithelial Type CellsHUANG ongrong1，QU Shanshan1，GUO Hong1，CHEN Suheng1，YANG Chuanqi1，ZHANG Junmei1，LI Yulan21The First School of Clinical Medical，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China2Department of Anesthesiology，the First Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，ChinaCorresponding author:LI YulanTel:13519625065，E-mail:ABSTACT:ObjectiveTo observe the effect of excess oxygen supply for different time periods on themitochondrial energy metabolism in alveolar epithelial type cells.Methodsat LE-6TN cells were assignedinto a control group(21%O2for 4 h)and excess oxygen supply groups(95%O2for 1，2，3，and 4 h，res-pectively).The content of adenosine triphosphate(ATP)，the activity of mitochondrial respiratory chain com-plex V，and the mitochondrial membrane potential were determined by luciferase assay，micro-assay，and fluo-中 国 医 学 科 学 院 学 报10February，2023rescent probe JC-1，respectively.eal-time fluorescence quantitative PC was employed to determine the mNAlevels of NADH dehydrogenase subunit 1(ND1)，cytochrome b(Cytb)，cytochrome C oxidase subunit I(COXI)，and adenosine triphosphatase 6(ATPase6)in the core subunits of mitochondrial respiratory chain complexes，and，respectively.esultsCompared with the control group，excess oxygen supply for 1，2，3，and 4 h down-regulated the mNA levels of ND1(q=24.800，P 0.001;q=13.650，P 0.001;q=9.869，P 0.001;q=20.700，P 0.001)，COXI(q=16.750，P 0.001;q=10.120，P 0.001;q=8.476，P 0.001;q=14.060，P 0.001)，and ATPase6(q=22.770，P 0.001;q=15.540，P 0.001;q=12.870，P 0.001;q=18.160，P 0.001).Moreover，excess oxygen supply for 1 h and 4 hdecreased the ATPase activity(q=9.435，P 0.001;q=11.230，P 0.001)and ATP content(q=5.615，P=0.007;q=5.029，P=0.005).The excess oxygen supply for 2 h and 3 h did not cause significant changesin ATPase activity(q=0.156，P=0.914;q=3.197，P=0.116)and ATP content(q=0.859，P=0.557;q=1.273，P=0.652).There was no significant difference in mitochondrial membrane potential among thegroups(F=0.303，P=0.869).ConclusionShort-term excess oxygen supply down-regulates the expressionof the core subunits of mitochondrial respiratory chain complexes and reduces the activity of ATPase，leading tothe energy metabolism disorder of alveolar epithelial type cells.Key words:excess oxygen supply;mitochondria;alveolar epithelial type cell;energy metabolismActa Acad Med Sin，2023，45(1):9-15在全身麻醉过程中，患者高氧血症的发生率可达83%1。相关研究表明，长时间暴露于超生理水平氧分压下会导致肺组织的氧化应激损伤2-4。肺泡型上皮细胞(alveolar epithelial type cell，AEC)是高氧介导肺损伤的关键靶点5，同时也是 AEC 的祖细胞6，在肺发育和损伤修复过程中具有重要作用7。线粒体是细胞能量代谢的核心，AEC 能量代谢异常可能影响其合成、修复功能，参与肺组织损伤的病理过程。有研究发现高氧 4 h 后小鼠肺泡上皮细胞呼吸链复合体酶活性及氧化磷酸化水平降低，三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合成减少8;高氧 6 h 后肺血管内皮细胞线粒体结构紊乱9。但Farrow 等10 研究发现，在 95%的高氧条件下，肺血管内皮细胞线粒体基质内活性氧在 15 min 内显著增加，30 min 时达到最大10，可见线粒体对高氧非常敏感，而高氧 4 h 内是否影响 AEC的能量代谢尚不清楚。因此，本研究体外培养大鼠 AEC建立高氧细胞模型，检测4 h 内不同时间点细胞线粒体呼吸链复合体和能量代谢变化趋势，探究高氧肺损伤的形成机制。材料和方法材料细胞株 LE-6TN 购自北京北纳创联生物技术研究院，为永生化大鼠 AEC。PMI-1640 培养基、胎牛血清、链霉素、青霉素、0.25%胰酶均购自上海逍鹏生物科技有限公司;MolPureCell/Tissue Total NA试剂盒购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;实时 荧 光 定 量 PC(real-time fluorescence quantitativePC，qT-PC)试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;线粒体膜电位(mitochondrial membranepotential，MMP)检测试剂盒(JC-1)、线粒体呼吸链复合体活性检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司;ATP 检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。细胞培养及分组LE-6TN 细胞用含 10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的PMI-1640 培养基，置于37、5%CO2的常规培养箱中培养，待细胞覆盖培养瓶80%90%时，用胰酶消化并传代，一般 2 3 d 传代1 次，取对数生长期细胞接种于培养瓶中，培养 48 h后采用随机数字表法将细胞分为对照组(21%O2常规培养 4 h)、高氧 1、2、3、4 h 组(95%O2分别培养 1、2、3、4 h)。ATP 含量检测收集各组细胞加入200 l ATP 裂解液，冰上裂解 10 min，4、12 000 g 离心 5 min 取上清液;黑色 96 孔板中加入 100 l ATP 检测液，静止 3 5 min 后每孔加 20 l 样品或标准品，采用多功能酶标仪进行测定，根据标准曲线测定样品中 ATP 的浓度，最后计算 ATP 浓度与 BCA 法检测样品蛋白浓度的比值，以 mol/mg 表示。线粒体呼吸链复合体活性检测收集各组细胞不同时间高氧对大鼠肺泡型上皮细胞能量代谢的影响Vol.45 No.111以 800 r/min(r=6 cm)的速率离心 3 min，弃掉上清液，随后采用微量法按照线粒体呼吸链复合体活性检测试剂盒说明书测定各组细胞 ATP 酶(ATP synthase，ATPase)的活性，同时测定各组细胞的蛋白浓度，