不同日龄仔猪肠道菌群的组成与差异_刘丹.pdf

动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):7 8-8 3P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e不同日龄仔猪肠道菌群的组成与差异 收稿日期:2 0 2 1-0 9-2 3 基金项目:湖南省教育厅科学研究项目(1 8 A 1 0 9)作者简介:刘 丹(1 9 9 7-),女,内蒙古阿荣旗人,硕士研究生,主要从事哺乳动物肠道抗菌肽研究。*通讯作者刘 丹1,2,孟江海1,曹 斌1,李 灿1,曾 维1,纪春晓1,陈 韬1,2*(1.湖南农业大学动物医学院,湖南长沙4 1 0 1 2 8;2.湖南省兽药工程技术研究中心,湖南长沙4 1 0 1 2 8)摘 要:为确定新生仔猪肠道菌群组成以及新生仔猪不同发育阶段肠道菌群的分布和变化,并探讨仔猪肠道不同发育阶段各个优势菌群的功能,找到仔猪肠道菌群的演变规律。试验选取不同日龄(0、5、1 0、1 5、2 0、2 5、3 0d)健康二元仔猪,收集其结肠内容物,用1 6 Sr R NA基因高通量测序方法,分析不同日龄仔猪肠道菌群的菌群分布和变化。通过A l p h a多样性分析显示,不同日龄仔猪肠道菌群存在多样性差异,其0d2 0d的多样性呈现下降趋势,而2 0d 3 0d的多样性呈现上升趋势;在门水平,肠道菌群主要由F i r m i c u t e s(4 3.5%)、B a c t e r o i d o t a(2 6.9%)两个门组成,占比为7 0.4%。不同日龄仔猪的F i r m i c u t e s和B a c t e r o i d o t a变化趋势各不相同;在属水平,不同生长阶段的优势菌属各不同,断奶前仔猪L a c t o b a c i l l u s、B a c t e r o i d o t a等与碳水化合物等营养物质代谢相关的菌属丰度较高;断奶后P r e v o t e l l a、R u m i n o c o c c e a c e a eU C G-0 0 5、A l l o-p r e v o t e l l a等与纤维消化有关的菌属丰度较高。肠道菌群的组成在生长的不同阶段是动态变化的。B e t a多样性分析显示,同一日龄不同个体的物种多样性存在差异,尤其刚出生时(0d)和断奶后(2 5d)不同个体的物种多样性之间具有显著差异。说明仔猪肠道菌群的微生物组成在生长的不同阶段是动态变化的,且不同个体的物种多样性均有较大差异。关键词:仔猪;肠道菌群;1 6 Sr R NA基因测序;差异分析中图分类号:S 8 5 6.4文献标识码:A文章编号:1 0 0 7-5 0 3 8(2 0 2 3)0 2-0 0 7 8-0 6 新一代测序技术极大地拓展了人们对肠道微生物群在人类健康和疾病中作用的认识。猪是人类重要的蛋白质来源和人类疾病的生物医学模型,使猪肠道微生物群越来越受到关注。特别是在猪的关键生长阶段,肠道微生物在猪的健康和生产中发挥着重要的作用1。由于各种应激、肠道屏障功能降低和病原体感染增加,断奶与肠道微生物群失调有关2。通过益生菌和益生元调节猪肠道微生物以维持健康微生物群可有效预防病原体感染和促进有益细菌丰度3。有研究收集2 7 3份直肠拭子和粪便分别进行测序和粪便微生物群移植,共检测到1 9个菌门,其中厚壁菌门(F i r m i c u t e s)和拟杆菌门(B a c t e-r o i d o t a)最多,不同阶段健康猪微生物群可能是由饲料或猪生理特性差异决定的4。对来自法国、丹麦和中国的2 8 7头猪的粪便进行宏基因组测序,确定了7 7 0万个非冗余基因,代表了7 1 9个宏基因组物种5。在人类基因目录中发现的9 6%的功能途径都存在于猪肠道微生物目录中,这证实了猪在生物医学研究中的潜在用途6。仔猪体内肠道微生物群被认为是其疾病发生和健康平衡的关键8。因此,肠道微生物在猪的健康和生产中发挥着重要作用,分析猪肠道微生物群落的组成和演替机制,可有效促进养猪业发展。传统分子生物技术多以检测粪便中的菌群为主,而对结肠内容物的检测相对较少。近年来,新一代高通量测序技术的成熟,弥补了传统分子生物技术手段对肠道微生物群的研究,能够更全面、客观、准确地反映肠道微生物群的真实情况9。据了解,目前对猪出生到断奶后的肠道微生物群的组成和多样性,在不同日龄仔猪肠道微生物群的纵向变化较少有系统的研究。本试验主要选取不同日龄(0、5、1 0、1 5、2 0、2 5、3 0d)健康二元仔猪,收集其结肠内容物,用1 6 Sr R NA基因高通量测序方法,探究不同日龄仔猪肠道微生物群的菌群组成、分布及其多样性的变化。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验用动物 从湖南新祥和农牧科技有限公司随机选择不同日龄(0、5、1 0、1 5、2 0、2 5、3 0d)的健DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.02.008康二元仔猪(大约克长白猪)各3头,总共2 1头。健康二元仔猪在断奶前饲喂常规教槽料,断奶后饲喂常规乳猪料。1.1.2 主要试剂与仪器 P h u s i o nH i g h-F i d e l i t yP C R M a s t e rM i x,N e wE n g l a n dB i o l a b s公司产品;G e n e J E T TM G e lE x t r a c t i o nK i t琼脂凝胶回收试剂盒和I o nP l u sF r a g m e n tL i b r a r yK i t建库试剂盒,T h e r m oS c i e n t i f i c公 司 产 品。Q u b i t 2.0F l u o-r o m e t e r荧光定量仪、I o nS 5 TM X L高通量测序系统和超低温冰箱,T h e r m oF i s h e r公司产品;S X 3 0 0高压灭菌锅,T o m y公司产品。1.2 方法1.2.1 样品采集 通过肌肉注射4 0m g/k g戊巴比妥钠麻醉仔猪,收集仔猪结肠内容物2g3g,装入2m L无菌E P管中,并迅速置于液氮中进行速冻,随后保存在-8 0冰箱备用。1.2.2 D NA提取 采用C T A B法(十六烷基三甲基溴化铵)对样本进行基因组D NA提取,得到所有样品的 基 因 组D NA,并 用 紫 外 分 光 光 度 计 检 测D NA浓度和纯度,再用A g i l e n t5 4 0 0全自动毛细管电泳检测D NA的完整性。1.2.3 P C R扩增和1 6 Sr R NA测序 使用引物序列:8 0 6 R(5 -G GA C T A CHVG G G TWT C T AAT-3)和3 3 8 F(5 -A C T C C T A C G G GAG G C AG C AG-3),对细菌1 6 Sr R NA基因V 3-V 4区P C R扩增。P C R反应程序为:9 81m i n;9 81 0s,5 03 0s,7 23 0s,3 0个循环;7 2 5m i n;1 0保存。P C R产物混合后用浓度为2 0g/L的琼脂糖凝胶回收P C R产物,用凝胶回收试剂盒(G e n eJ E T TMg e l e x t r a c t i o nk i t)回收,并 构 建 文 库(I o np l u sf r a g m e n tl i b r a r yk i t),再通过Q u b i t 2.0f l u o r o m e t e r(t h e r m os c i-e n t i f i c)和q P C R定量,合格后用I o nS 5 TM X L高通量测序系统进行测序。1.2.4 生物信息分析 通过生物信息学分析数据,从而获取准确、可靠的结果,再使用B a r c o d e拆分获得各样本数据后用F L A S H(V 1.2.7)对每个样本的R e a d s进行拼接,得到原始数据,再对原始数据进行严格的 拼 接、过 滤,去 除 干 扰 数 据 得 到 高 质 量 的T a g s数据。参照Q i i m e(V 1.9.1)的T a g s质量控制流程,进行排序与去除嵌合体序列,得到最终的有效数据。利用U p a r s e软件(U p a r s ev 7.0.1 0 0 1)基于有效数据进行OTU s聚类和物种分类分析,筛选每个OTU s的代表性序列,对每个OTU的代表序列做物种注释。为研究不同OTU s的系统发育关系以及不同样本间的优势菌群差异,用MU S C L E(V e r-s i o n3.8.3 1)软件进行多序列比对分析,得到所有OTU s代表序列,后对各样本的数据进行均一化处理,再使用R软件进行多样性组间差异分析与多样性分析。通过T-t e s t检验,W i l c o x秩和检验与T u k e y检验分析组间物种多样性差异是否显著。用S P S S2 2.0软 件 进 行 单 因 素 方 差 分 析(O n e-w a yANOVA)比较不同日龄多样性指数组间差异,统计结果以P0.0 5为差异显著,P0.0 1为差异极显著。2 结果2.1 D NA样品质检结果D NA样品质检结果显示,除3个样品不合格外,其他样本均检测合格,检测不合格的3个样品用备份样品重新质检,所有样品均检测合格。2.2 OTU s聚类分析试验共采集样本2 1个,原始数据总r e a d s共获得18 7 24 6 0条原始测序数据,通过双端拼接,获得17 6 15 5 8条 序 列,经 质 控、嵌 合 体 过 滤,获 得12 8 11 5 3条r e a d s用于后续的OTU s注释分析,平均每个样本6 10 0 7条;OTU s的总数目为1 23 0 6个,平均每个样本5 4 5个OTU s。其中,3 0d(断奶后)样品具有最高数量的OTU s(OTU s平均数为6 8 9)。每个样本的公共和特有的OTU数的统计结果被用来组成图1,图1显示0d中特有7 1 8个OTU s,5d中特有3 6 2个OTU s,1 0d中特有3 2个OTU s,1 5d中特有5 6个OTU s,2 0d中特有2 0 8个OTU s,2 5d中特有3 1 4个OTU s,3 0d中特有1 3 5个OTU s,表明7个日龄仔猪肠道中的微生物菌群存在差异。2.3 猪肠道菌群多样性分析通过A l p h a多样性指数分析发现,试验样本C o v e r a g e均超过9 9.7%,说明了此次测序结果基本反映了肠道内微生物的状况。由表1分析物种多样性差异可知,2 5d仔猪S h a n n o n指数和S i m p s o n指数要显著低于3 0d仔猪(P0.0 5),表明2 5d时群落多样性显著低于3 0d仔猪。同时,2 5d仔猪的S i m p s o n指数也要显著低于5、1 0、2 0d仔猪的,因此,5、1 0、2 0d仔猪肠道菌群的多样性也要显著高于2 5d仔猪的(P0.0 5)。3 0d时,物种观察指数和C h a o 1指数最高,表明群落样品中包含的物种总数最多,物种丰富度最高。除此之外,O b s e r v e ds p e-c i e s指数和C h a o 1指数在0d 2 0d时降低,在2 0d3 0d时升高,表明在0d2 0d时,物种丰富度呈现降低趋势,在2 0d 3 0d时,物种丰富度呈现增高趋势。97刘 丹等:不同日龄仔猪肠道菌群的组成与差异表1 不同日龄仔猪A l p h a多样性指数统计结果T a b l e1 S t a t i s t i c a l r e s u l t so fA l p h ad i v e r s i t y i n d e x e so fp i g l e t sa td i f f e r e n td a y so f a g e组别G r o u pO b s e r v e ds p e c i