不同人抗狂犬病病毒抗体检测方法分析_王兆胜.pdf

河南医学高等专科学校学报 临床，（）：张宏英，方素芳，王婷，等新型冠状病毒肺炎细胞因子的动态变化及与主要临床结局的关系福建医科大学学报，（）：史秀枝，曹晓红 患者诱导痰中、水平与炎症表型的 相 关 性 研 究 临 床 医 学 进 展，（）：，？，：，：，（）：，：，（）：刘明阳，石庚玉，翁韵琦 糖尿病合并新冠肺炎患者白细胞介素、白细胞介素、白细胞介素、水平分析临床医学进展，（）：，（）：龚路，沈玲，曾浩龙，等 细胞因子及炎症指标在新型冠状病毒肺炎患者预后评估中的价值 临床检验杂志，（）：预防医学收稿日期：修回日期：基金项目：河南省医学科技攻关计划（联合共建）项目（）；河南省科技攻关项目（）。作者简介：王兆胜（），男，郑州市人，大专，主管医师，从事疾病预防控制工作。通信作者：梁振山，：。不同人抗狂犬病病毒抗体检测方法分析王兆胜，梁振山，李梦檀，李林蔓，彭小婉，崔为国（郑州市惠济区人民医院公共卫生科，郑州；河南省疾病预防控制中心，郑州）摘要 目的 以快速荧光灶抑制试验（，）检测结果为金标准，评价酶联免疫吸附试验（，）、胶体金检测方法（，）检测人血清样品中抗狂犬病病毒抗体的效能。方法 对 份接种过狂犬病疫苗者的血清样品分别采用、检测抗狂犬病病毒抗体，比较四种检测方法结果的一致性、敏感性与特异性。结果两种、与 检测结果的一致率都高于，万泰 的敏感性较高，亿特 的特异性好，一致性检验 值亿特 最好。结论 用 进行初筛，用 进一步检测，必要时用 法进行确诊，不同检测方法进行联合使用，具有较好的经济社会价值。关键词 狂犬病病毒抗体；快速荧光灶抑制试验；酶联免疫吸附试验；胶体金法；一致性中图分类号；文献标识码 文章编号（）狂犬病是严重危害我国人民群众身体健康和生命安全的传染性疾病之一，目前尚无特效治疗药物，病死率几乎。中国每年狂犬病发病人数排世界第二位，狂犬病疫苗使用量为全球第一位。世界卫生组织（）规定，人体狂犬病病毒中和抗体（，）水平时，其抗体水平可提供足够的免疫保护作用；当 水平 时，抗体水平尚未达到保护水平，需接种疫苗进行加强免疫。对于免疫低下或服用免疫制剂的狂犬病疫苗接种者，在接种疫苗后检测 水平，可及时发现可能的狂犬病疫苗免疫失败者。因此，水平的检测对预防狂犬病有至关重要的作用。目前有多种人抗狂犬病病毒抗体检测方法。本研究运用世界卫生组织推荐的 检测的标准方法快速荧光灶抑制试验（，）和 酶 联 免 疫 吸 附 试 验（，）、胶体金检测方法（，），分别对同一批样品进行了对比试验，以 作为金标准比较不同诊断方法之间的差异性，报道如下。第 期王兆胜，等 不同人抗狂犬病病毒抗体检测方法分析 对象与方法对象为接种狂犬疫苗全程免疫的 例犬伤患者，抽取血液进行检测。方法 试剂盒由北京博雅晟康医学科技有限公司生产的狂犬病中和抗体检测试剂盒（，批号：）。由郑州亿特生物技术有限公司（简称亿特）生产的狂犬病毒抗体（）检测试剂盒（，批号为），北京万泰生物药业股份有限公司（简称万泰）生产的人狂犬病病毒 抗体测定试剂盒（，批号：），北京中检安泰诊断科技有限公司生产的人狂犬病毒 抗体检测试剂盒（，批号：）。检验原理 将样品和标准品做系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液混合，感染敏感细胞，在规定的时间内用荧光抗体染色并观察荧光灶减少的情况，以测定样品效价。实验前准备材料 细胞准备：准备生长良好的 细胞，使用前消化调整细胞密度至 个。病毒准备：将 病毒种子用细胞培养液稀释至 感染量，滴度不得小于，病毒现用现配。操作步骤 在 孔细胞培养板中每孔加入 细胞培养液。在 每孔分别加入 待检样品，每孔分别加入 标准参考品及阴、阳性内控品，即为 稀释度，用移液器反复吹打充分混匀。吸取 孔中试液 移至 孔，成为 的稀释度，反复吹打充分混匀。重复 操作，将试液系列稀释至 孔，孔中多余的 试剂弃掉。向每孔加入 狂犬病毒（感染量），混匀后 孵育 。加样后 分钟准备个细胞悬液，第 步结束后，向 孔培养板中每孔加入 细胞悬液，二氧化碳 条件下培养 。待培养结束弃培养液，并尽量扣干。每孔加入洗液 清洗，并扣干。每孔加入预冷至 的固定液 ，固定，弃去固定液，挥发干燥充分。加入混合好的检测液，孔，避光孵育 ，打开荧光显微镜预热。孵育完成后弃上清，向每孔中加入 洗液，连续清洗 次，清洗完后扣干。每孔中加入 封闭液，均匀铺底后即可观察。荧光显微镜下判断细胞感染量，计算样品滴度。亿特狂犬病毒抗体（）检测试剂盒（）微孔上包被的狂犬病毒抗原，可与待测样本中特异性抗体反应，形成抗原抗体复合物被吸附到固相上，再加入酶标记的抗人。洗涤后，加入显色剂显色，为阳性；加入显色剂不显色，为阴性。当人血清或血浆中的狂犬病毒抗体（）以上，具有免疫保护水平。万泰人狂犬病病毒 抗体测定试剂盒（）本试剂盒采用间接法 原理。在微孔条上预包被的狂犬病毒抗原可与样品中的狂犬病毒抗体结合，洗板后加入酶标试剂进行二次温育。当样品中存在 抗体时，将形成“包被抗原一抗体一酶标二抗”复合物。若样品中无 抗体时，不显色。通过酶标仪检测吸光度（值），用校准品浓度值与 值拟合双对数曲线，计算样品中 抗体含量，时，达到保护作用。安泰公司生产的人狂犬病毒 抗体检测试剂盒（）本方法是采用胶体金免疫层析原理，在硝酸纤维素膜上的检测线包被重组狂犬病毒抗原，在质控线包被山羊抗小鼠 多克隆抗体，在金标垫上包被胶体金标记的小鼠抗人 单克隆抗体。结果判定。阴性：只在质控线（）位置出现一条红色条带。阳性：质控线（）和检测线（）位置出现两条红色条带。无效：质控线（）位置没有出现红色条带。评价指标为了更好地说明不同检测方法的可靠性，研究中利用 检测结果与亿特公司、万泰公司、进行对比分析。见表。表 评价检测方法和金标准关系的模式表项目金标准合计检测方法合计假阴性率（）假阳性率（）一致率（）值（）（）：实际一致率（）：理论一致率 （）（）（）（）一致性检验的评定标准：，表明两种方法检测结果几乎完全一致；，两种方法检测结果为高度的一致性；河南医学高等专科学校学报第 卷，两种方法检测结果为中等的一致性；，两种方法检测结果为一般的一致性；，两种方法检测结果为极低的一致性。统计学处理本研究数据采用 录入信息，用 统计软件进行处理分析。结果 不同检测方法的结果分别用四种检测方法对 份人血清标本进行抗狂犬病病毒抗体检测，检出的阳性样品数为 份，阴性为 份；亿特 检出的阳性样品数为 份，阴性为 份；万泰 检出的阳性样品数为 份，阴性为 份；检出的阳性样品数为 份，阴性为 份。与金标准相比，亿特 的假阴性率为、假阳性率为；万泰 的假阴性率为、假阳性率为；假阴性率为、假阳性率为。从结果中可以发现，万泰 的敏感性较高，亿特 的特异性好。亿特 与 的一致率为，值为；万泰 与 的一致率为，值为；与 的一致率为，值为。从一致率方面分析，亿特、万泰、与 检测结果的一致率都高于；从 值方面分析，亿特 与 的 值为，介于，二者具有高度的一致性；与 的 值为，介于，二者具有一般的一致性；万泰 与 的 值为，介于 ，二者具有极低的一致性。见表。表 与亿特、万泰 和 检测同一批血清标本的抗狂犬病病毒抗体结果项目假阴性率 假阳性率 一致率 值（亿特）（万泰）不同人抗狂犬病病毒抗体检测方法的比较在四种人抗狂犬病病毒抗体检测方法中，是 标准检测方法，可信度强，但检测条件要求和成本比较高；和 要求的检测条件和成本比较低、操作简便、便于推广，但准确性低于。综合不同检测方法的特点，可用 和 进行初筛，用 进行确证。见表。表 不同狂犬病毒抗体检测方法的比较方法（亿特）（万泰）仪器荧光显微镜等酶标仪酶标仪加样器试剂（盒）中和抗体检测试剂盒狂犬病毒抗体（）检测试剂盒狂犬病毒抗体（）检测试剂盒狂犬病毒 抗体检测卡定性、定量定性、定量定性、定量定性检测前处理复杂简单简单简单、便捷平均样品检测时间 以上 仪器市场价格 万 万 万 万 万 万耗材市场价 元 人份 元 人份 元 人份 元 人份适合场所专业实验室普通实验室普通实验室现场 讨论从 年 月 日在北京举办的 年动物致伤防治高峰论坛获知，中国每年有 多万人被犬、猫所伤，因动物致伤而进行狂犬病预防处置的人数超过 万，人接种狂犬病疫苗、注射免疫球蛋白和伤口医疗处置的费用超过 多亿元。我国每年大量人群接种狂犬病疫苗后，由于受多种因素影响，不能使所有接种者产生足够的保护性抗体，因此，进行抗体检测非常必要。不同人抗狂犬病病毒抗体检测方法各有特点。世界卫生组织推荐 来体外评估血清第 期王兆胜，等 不同人抗狂犬病病毒抗体检测方法分析中。此方法需要昂贵的 标记的狂犬病病毒抗体，实验周期较长，需要在人工显微镜下观察；实验用到高致病性的狂犬病病毒 株作为攻击病毒，涉及生物安全，只能在生物安全水平 级（）的实验室中进行。由于受实验室应用条件、成本高等条件所限难以推广。因此，找到一种简单便捷，准确高的检测方法很有必要。是常用的检测狂犬病病毒抗体的方法之一，在 世纪 年代由 等建立。目前 法基本上采用间接法，该法可通过检测 糖蛋白抗体，从而测定其中和抗体效价。等研究表明，检测 糖蛋白抗体的结果与 法相比，具有较好的一致性。等研究显示，检测试剂盒的敏感性达到，其特异性达到，在敏感性和特异性方面与 方法无差异。本研究结果发现，亿特公司、万泰公司的两种 与金标准 的一致率均为 以上，检查结果与吕新军等报道的 检测法的结果比较接近。运用 法测定的是抗狂犬病病毒糖蛋白抗体滴度与使用病毒中和试验测定的结果有一定的相关性。安泰公司的 与 的一致率均为以上。然而，此种检测方法只能定性检测抗体的有或无，不能定量测定抗体效价，也不能特异性检测中和抗体。中国 病毒所卢学新报道的“基于量子点技术的狂犬病病毒抗体免疫层析检测方法”，初步建立了基于量子点技术的狂犬病抗体免疫层析方法，可对不同物种的狂犬病病毒抗体进行检测，初步完成了抗体滴度定量检测。不足之处是检测的为狂犬病总抗体，不能区分保护性抗体。需进一步扩大样本量和样本种类，验证此方法的性能。其展望进一步探究中和抗体和总抗体间的相关比例，通过检测总抗体完成对狂犬病中和抗体滴度的判定。、与 相比具有实验条件要求低、操作便捷、时间快、成本低等优点，主要用于大范围狂犬病病毒抗体筛查，特别适合基层医疗卫生单位使用。操作简单，可以现场检测，但是易受检验人员主观影响，不易准确判断等不足之处，根据其特点可以作为一个早期筛查的手段。综合以上分析结果，建议在人抗狂犬病病毒抗体检测过程中，首先利用 进行初步筛选，然后利用 法进一步检测。如果条件允许，最好用 法进行确诊。不同检测方法的联合应用，具有较好的社会经济价值。参考文献 王传林，殷文武 狂犬病防治技术与实践北京：中国医药科技出版社，：周航，李昱，陈瑞丰，等狂犬病预防控制技术指南（版）中华流行病学杂志，（）：年动物伤致伤防治高峰论坛：？宋云，于鹏程，朱武洋 抗狂犬病病毒中和抗体检测技术研究进展 国际病毒学杂志，（）：，：邓瑶，吕新军，于鹏程，等基于狂犬病病毒 假病毒的中和抗体检测新技术及初步应用中华微生物学和免疫学杂志，（）：，（）：，（）：，（），（）：吕新军，王伟伟，李云云，等 采用快速荧光灶抑制试验对一种狂犬病病毒抗体竞争性 检测法的评价 国际检验医学杂志，（）：吕新军，唐青 快速荧光灶抑制试验的应用和改进 国际病毒学杂志，（）：陆菁，杨玉颖，李晓军，等 快速荧光灶抑制试验检测暴露后人群接种狂犬病疫苗的免疫学效果 中国疫苗和免疫，（）：，俞永新 狂犬病和狂犬病疫苗 版北京：中国医药科技出版社，梁振山，于海珍，崔为国，等 两种人抗狂犬病病毒抗体检测方法的分析 河南预防医学杂志，（）：齐景文，依颖新，周艳红，等 牛羊布鲁氏菌病四种血清学检测方法对比分析 中国动物检疫，（）：张雷，曹东，赵晓彤，等 布鲁氏菌病抗体不同检测方法的比较 黑龙江畜牧兽医，（下）：，卢学新 基于量子点技术的狂犬病病毒抗体免疫层析检测方法 中国狂犬病年会报告集（年 月 日 湖南长沙）：